Abstract
spesifikk T-celle-immunitet hos pasienter med aktiv tuberkulose er assosiert med en reduksjon i multifunksjonalitet. Det er imidlertid ikke kjent hvorvidt cytokin-profiler er forskjellige i pasienter med primær infeksjon og de med tidligere kontakt. Vi brukte derfor intravesikal immunoterapi med svekket levende Bacille Calmette-Guérin (BCG) hos pasienter med urothelial karsinom som en modell for å karakterisere induksjon av systemisk immunitet mot renset protein derivat (PPD) og for å studere hvorvidt cytokin-profiler variere, avhengig av pre-eksisterende immunitet . Atten pasienter med ikke-muskel invasiv blærekreft ble rekruttert i løpet av BCG-induksjon kurs. Femti-fire friske individer fungerte som kontroller. Interferon (IFN) -γ og interleukin (IL) -2 produserende PPD-spesifikke CD4 T-celler ble analysert i lengderetningen før hver instillasjon ved anvendelse av en hurtig flow-cytometriske helblod immunologisk analyse. Baseline nivåer av IFN-γ produserende PPD-spesifikke T-celler som var sammenlignbare med kontroller. T-celler viste en 5-gangers økning til 0,23% etter uke 2/3, og videre økes åtte ganger ved uke 4/5 (0,42%, p = 0,0007). Systemisk immunitet ble indusert hos alle pasienter, men økningen var mindre uttalt hos pasienter med pre-eksisterende immunitet. Som i aktiv TB, cytokin profilering under behandlingen viste en lavere andel av multifunksjonelle IFN-y /IL-2 dobbel-positive T-celler sammenlignet med kontroller (60,2% vs. 71,9%, p = 0,0003). Av notatet, når man sammenligner pasienter med og uten pre-eksisterende immunitet, cytokin profiler i pasienter med primær immunitet ble flyttet mot IL-2 enkle å produsere T-celler (p = 0,02), mens de hos pasienter med pre-eksisterende immunitet ble forskjøvet mot IFN -γ enkelt-positivitet (p = 0,01). I konklusjonen, ble systemiske T-celle responser indusert etter BCG-terapi, og deres kinetikk og cytokin profil avhengig av pre-eksisterende immunitet. Redusert funksjonalitet er et typisk trekk ved spesifikk immunitet i begge pasienter med aktiv tuberkulose og BCG-terapi. Blant pasienter med aktiv infeksjon, kan en dreining mot IL-2 eller IFN-γ enkelt-positive celler tillater skille mellom pasienter med primær infeksjon og tilfeller med økt immunitet etter forutgående kontakt, henholdsvis
Citation. Elsasser J, Janssen MW, Becker F, Suttmann H, Schmitt K, Sester U, et al. (2013) antigen-spesifikke CD4 T-celler indusert etter Intravesikal BCG-Instillasjon behandling hos pasienter med blærekreft og viser lignende cytokin-profiler som i aktiv tuberkulose. PLoS ONE 8 (9): e69892. doi: 10,1371 /journal.pone.0069892
Redaktør: Delia Goletti, Nasjonalt institutt for smittsomme sykdommer (L. Spallanzani), Italia
mottatt: 02.05.2013; Akseptert: 13. juni 2013, Publisert: 11.09.2013
Copyright: © 2013 Elsässer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet delvis av uavhengig forskning støtte ved medac GmbH. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerende interesser: Studien ble støttet delvis av uavhengig forskning støtte ved medac GmbH. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet, og dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. M.S. og USA er co-grunnleggerne av RedFlag Diagnostics GmbH og co-oppfinnere for en patentsøknad med tittelen «In vitro prosess for rask bestemmelse av en pasients status knyttet til infeksjon med Mycobacterium tuberculosis» (internasjonal patent nummer WO2011113953 /A1). H.S. fungerer som en konsulent for medac GmbH. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Alle andre forfattere ikke erklære noen konkurrerende økonomiske interesser.
Innledning
Siden 1976 har immunterapi med levende Bacille Calmette Guérin (BCG) vist seg å være en effektiv adjuvant intravesikal behandling for å hindre fremgang og tilbakefall etter transuretral reseksjon av nonmuscle invasiv blærekreft [1,2]. Anti-tumoreffekten av BCG-terapi er i stor grad tilskrives den induksjon av en sterk medfødte immunrespons [3], etterfulgt av infiltrering av T-celler i blæren [4,5]. Dette er hovedsakelig preget av en T-hjelper typen respons [6,7], og dens omfang er vist å korrelere med klinisk respons [8]. Selv om den terapeutiske aktivitet er begrenset til blæren, musemodeller viser at levende basiller angi blære-drenerende lymfeknuter hvor T-celle-priming initieres [9]. Dette antyder at lokal BCG-instillasjon kan være forbundet med en systemisk induksjon av spesifikke T-celler, selv om bevis på deres induksjonskinetikk og funksjonelle egenskaper hos mennesker er begrenset [10]. Interessant, studier i mus viste at T-celle-infiltrasjon etter BCG-tildrypping hurtigere observeres hvis dyrene var pre-immunisert med BCG-vaksinasjon, noe som tyder på at en pre-eksisterende immunitet kan være fordelaktig i akselererende T-celle-induksjon og følgelig terapeutisk virkning . Dette ble støttet av de observasjoner som pre-eksisterende immunitet ble assosiert med forbedret anti-tumor respons etter BCG-instillasjon i både mus og pasienter [9]. Dermed kan subkutan immunisering før drypping representerer en ny terapeutisk strategi for å bedre behandlingsresultat. I denne sammenheng til tilgjengeligheten av raske analyser vurdere mengden og funksjonaliteten av spesifikk immunitet på individuell basis er en viktig forutsetning for å overvåke slike strategier [11].
Estimater på tilstedeværelsen av systemisk immunitet overfor BCG kan oppnås ved hjelp av tuberkulin-hud test som påviser primede T-celler overfor mykobakterielle antigener som en forsinket type hypersensitivitetsreaksjon [12]. Renset protein-derivat (PPD), antigenet som brukes i hud-testing, er en ekstrakt av forskjellige mykobakterielle proteiner i forskjellige mykobakterielle arter, inkludert BCG. Hud-testing har visse begrensninger som et overvåkingsverktøy som det gir ofte falske negative resultater [13], og kan føre til at forsterke reaksjoner som ikke kan skilles fra de dynamiske endringer indusert ved instillasjon [14]. I de senere årene,
in vitro
-assays har blitt utviklet som tillater en mer detaljert kvantifisering av
M. tuberkulose
-spesifikke T-celler. Mest
in vitro
-assays kan utføres fra små volumer av fullblod i løpet av en dag, er logistisk mindre krevende, og tillate serietesting og funksjonell karakterisering av antigen-spesifikke T-celler [15]. I innstillingen av infeksjon med
M. tuberkulose
, vurdering av funksjonalitet ved cytokin profilering er allerede brukt til å skille pasienter med og uten aktiv sykdom [16-21]. Interessant nok, en reduksjon i multifunksjonalitet og en dreining mot cytokin enkelt-produserende celler ble nylig vist å være et typisk trekk ved antigen-spesifikke CD4 T-celler i pasienter med aktiv tuberkulose [16-18]. Interessant, blant pasienter med en redusert prosentandel av IFN-y /IL-2-dobbel-positive celler, noe viste en dreining mot celler som uttrykker IL-2 mens andre oppviste en IFN-γ enkelt-positiv status [16]. Grunnen til dette skillet er foreløpig uklart, men kan være relatert til nærværet eller fravær av pre-eksisterende immunitet før utviklingen av aktiv tuberkulose.
Intravesikal BCG instillasjon behandling kan bli betraktet som en modell for å studere induksjon av mykobakterielle immunitet etter definert antigen kontakt hos mennesker. Vi har derfor benyttet en flow-cytometrisk analyse av fullblod til lengderetningen karakterisere induksjonskinetikken og funksjonaliteten av systemiske PPD-spesifikke T-celler i pasienter før og etter BCG-instillasjon. Som allerede eksisterende immunitet overfor PPD kan påvirke kinetikken og funksjonell profil av spesifikke T-celler etter utfordring, ble det lagt spesiell vekt på karakteriseringen av induksjon av spesifikk immunitet hos pasienter med og uten bevis for forutgående sensibilisering med mykobakterielle antigener.
Materialer og metoder
etikk uttalelse
studiet ble godkjent av den lokale etikkutvalg (Ärztekammer des Saarlandes) og alle pasienter ga skriftlig informert samtykke.
pasienter
undersøkelsen ble gjennomført blant 18 blærekreftpasienter som fikk BCG-instillasjon terapi for første gang (gjennomsnittsalder 66,7 ± 10,9 år). Alle individer gjennomgikk transurethral reseksjon av alle synlige svulster. Pasient og tumoregenskaper er vist i tabell 1. Alle pasientene ble analysert i løpet av en standard induksjons kurs som består av seks ukentlige intravesikal BCG-instillasjoner (BCG-medac, RIVM stamme avledet fra stamme 1173-P2), og etterfulgt klinisk henhold til gjeldende retningslinjer [ ,,,0],22]. Hos to pasienter, ble den tredje og femte instillasjon forsinket i to og en uke på grunn av nitritt positive urinveisinfeksjon og logistiske årsaker, henholdsvis. Blod ble tatt før BCG-terapi så vel som 1, 2 eller 3 og 4 eller 5 uker etter, i hvert tilfelle før instillasjon. Vedlikeholdsbehandling ble gitt i 7 individer ifølge sentrum praksis. Tumorresidiv eller progresjon ble definert på grunnlag av biopsi og urin cytologi. Femti-fire alderstilpassede friske individer (gjennomsnittsalder 65,3 ± 11,0 år, 45 menn og 9 kvinner) som gjennomgikk analyser for latent infeksjon med
M. tuberkulose
uten klinisk mistanke om aktiv sykdom ble rekruttert som kontroller.
Demografiske karakteristikker
Pasienter (n = 18)
år gammel, mener ± SD66.7 ± 10.9Sex, male /female15 /3Tumor egenskaper * Single tumor9 /18 (50,0%) Flere tumor9 /18 (50,0%) pTa9 /18 (50,0%) PT16 /18 (33,3%) CIS3 /18 (16,6%) G2 /G3-grade tumors15 /18 (83,3% ) G211 /15 (73,3%) G34 /15 (26,6%) lav /høy klasse tumors14 /18 (77,8%) lav grade9 /14 (64,3%) høy grade5 /14 (35,7%) Associated CIS0 /18 (0%) Tilbakevendende tumor9 /18 (50,0%) Perioperativ mitomycin treatment5 /18 (27,7%) Dager til terapi, mener ± SD34 ± 25Non responders8 /18 (44,4%) måneder til tilbakefall, mener ± SD7.5 ± 5.9Table 1. Demografiske og kliniske karakteristikker av pasienter behandlet med Bacille Calmette-Guérin (BCG) product: * Ta /T1 – papillærtumorer.; CIS – carcinoma in situ; SD – standardavvik. CSV Last ned CSV
Kvantifisering av PPD-spesifikke CD4 T-celler fra fullblod
Karakterisering av PPD-spesifikke CD4 T-celler ble utført direkte fra heparinisert fullblod for totalt 6 timer i henhold til en etablert standard prosedyre som tidligere beskrevet [23]. Cellene ble stimulert med PPD (7,32 ng /ml, Tuberkulin for
in vitro
bruk (RT-50), Statens Serum Institut, København, Danmark). Behandling med fortynningsmiddel (PBS) og med 2,5 ug /ml
Staphylococcus aureus
-enterotoksin B (SEB, Sigma, Deisenhofen, Tyskland) tjente som negative og positive kontroller, henholdsvis. Hver stimulerende reaksjonen ble utført fra 300 ul blod i nærvær av 1 ug /ml anti-CD28 (klon L293) og 1 ug /ml anti CD49d (klon 9F10, BD, Heidelberg, Tyskland). For den siste 4t inkubasjonstiden (37 ° C, 5% CO
2) 10 pg /ml Brefeldin A (Sigma, Deisenhofen, Tyskland) ble tilsatt for å akkumulere intracellulært cytokiner. Deretter erytrocytter ble lysert og leukocytter ble løst ved hjelp av 10 ml BD lysende løsning /ml fullblod. Farging ble utført ved anvendelse av anti-CD4 (klon SK3), anti-IFN-γ (klon 4S.B3), anti-IL-2 (klon MQ1-17H12), og anti-CD69 (klon L78, alt fra BD). Minst 15.000 CD4 T-celler ble analysert på et FACS Canto II (BD) ved hjelp av diva Software. Prosentandelen av spesifikke T-celler, ble beregnet ved å trekke frekvensen oppnådd ved den respektive styre stimulering. Den nedre grensen for deteksjon var 0,05% CD4 T-celler som tidligere er etablert og anvendt i andre studier av mykobakterielle T-celle immunitet [16,23-25].
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble gjennomført ved anvendelse av GraphPad Prism-5,03 (La Jolla, Ca.). Forskjeller mellom to grupper ble bestemt av Mann-Whitney-test. Den Friedman-test ble brukt for langsgående analyse. Å sammenligne PPD-status mellom to eller flere grupper av fisher eller chi-kvadrat test ble brukt.
Resultater
PPD-spesifikke CD4 T-celle immunitet før behandling skiller seg ikke mellom pasienter og friske individer
for å karakterisere omfanget av pre-eksisterende cellulær immunitet mot PPD, baseline frekvenser av PPD-reaktive CD4 T-celler fra 18 pasienter ble sammenlignet med de av 54 alderstilpassede kontroller. Antigen-spesifikke CD4 T-celler ble identifisert basert på induksjon av aktiverings markør CD69 og cytokiner IFN-y og IL-2 etter at PPD-stimulering. Selv om CD4 T-celle-frekvensene fremkalt med den negative kontroll stimulus var vanligvis meget lav (median 0,008%, IQR 0,016%) ble, den individuelle prosentandelen av PPD-spesifikke CD4 T-celler beregnes ved å trekke frekvensen oppnådd ved den respektive styre stimulering. I en pasient med utgangsverdien var ikke tilgjengelig. Men som denne pasienten ikke har noen spesifikk immunitet en uke etter behandlingsstart, ble baseline immunitet betraktet under deteksjonsgrensen. Som eksemplifisert for celler som produserer IFN-γ, 9/18 pasienter (50,0%) hadde PPD-spesifikke T-celler over deteksjonsgrensen. Dette var sammenlignbart med kontroller, hvor PPD-spesifikke T-celler var detekterbar i 24/54 individer (44,4%, p = 0,79, Figur 1A). Lignende resultater ble funnet når pasientene ble lagdelt med hensyn på IL-2-produserende PPD-spesifikke T-celler (figur 1 A), som var 88,9% overensstemmende med IFN-γ positivitet. Når kvantitative analyser ble utført i individer med PPD-reaktive CD4 T-celle-frekvenser over deteksjonsgrensen, var det ingen forskjell i median frekvenser av IFN-γ eller IL-2-produserende PPD-reaktive T-celler i begge grupper (IFN-y: pasienter 0.183 %, IQR 0,399% versus kontroller 0,161%, IQR 0,355, p = 0,73 ,; IL-2: pasienter 0,153%, IQR 0,241% versus kontroller 0,156%, IQR 0,347, p = 0,88, figur 1B). Dermed forbehandling immunitet mot PPD hos pasienter viser en fordeling som er sammenlignbar med friske kontroller.
(A) Andelen personer med pre-eksisterende immunitet mot PPD (≥0.05% CD69 positive interferon-γ ( IFN-γ) eller interleukin 2 (IL-2) produksjon av CD4 T-celler) og (B) PPD-reaktive T-celle frekvenser av IFN-γ eller IL-2-produserende CD4 T-celler ble kvantifisert i blærecancerpasienter før BCG-terapi ( n = 18) og i alderstilpassede friske kontroller (n = 54). I en pasient med utgangsverdien var ikke tilgjengelig. Men som denne pasienten ikke har noen spesifikk immunitet en uke etter behandlingsstart, ble baseline immunitet betraktet under deteksjonsgrensen. T-celle frekvenser for hver enkelt (sirkler) samt medianverdien og interkvartilt avstands (IQR) er vist, og påvisningsgrensen (0,05% reaktive CD4 T-celler) er representert ved en stiplet linje.
Intravesikal BCG-program induserer en systemisk T celle respons mot PPD
induksjon av PPD-spesifikk immunitet ble så vurdert før samt 1, 2 eller 3 og 4 eller 5 uker etter den første drypping. Dotplots av PPD-spesifikke T-celler som produserer IFN-γ avledet fra en typisk pasient er vist i figur 2A. Selv om denne pasienten ikke viste noen spesifikk immunitet ved start og en uke etter drypping, en sterk PPD-spesifikk T-cellerespons var påvisbar en uke etter 2
nd instillasjon (uke 3) og T-celle-nivået ytterligere øket i uke 5 . I motsetning til dette, SEB-reaktive T-celler var lett påvisbar og frekvenser som var i alt vesentlig stabil over tid. Disse funnene ble bekreftet da langsgående analyse av PPD-spesifikke T-celler fra alle 18 pasienter. PPD-reaktive T-celle-frekvensene ble ikke endret i løpet av den første uken. Men median frekvenser av IFN-γ produserer PPD-spesifikke T-celler viste en ca 5 ganger økning fra 0,05% ved baseline til 0,23% i uke 2/3, og ytterligere økt åtte ganger etter uke 4/5 (median 0,42% , p = 0,0007, data ikke vist). Interessant, da stratifying pasienter med og uten pre-eksisterende immunitet, økningen i PPD-reaktive T-celler etter BCG-instillasjon var vesentlig sterkere hos individer hvor utgangsnivået var under påvisningsgrensen, som gjaldt for både IFN-γ og IL-2- produserende T-celler (figurene 2B og 3). Men maksimum frekvens var signifikant høyere hos pasienter med pre-eksisterende immunitet (p = 0,02, data ikke vist). Av notatet, SEB-reaktive T-celler kunne påvises gjennom hele observasjonsperioden, og deres frekvenser endret seg ikke over tid (figur 2C). Når kvantifisere andelen av personer som kjøpte PPD-spesifikk immunitet over tid, IFN-γ produserende T-celler etter stimulering med PPD var påvisbare i 16/18 pasienter (88,9%) av uke 2/3, og i alle pasienter ved uke 4 /5 (p = 0,0004, tabell 2). Dette også gjaldt når IL-2-produserende T-celler ble kvantifisert (p = 0,0013, tabell 2). Tatt sammen, kan en systemisk induksjon av cellulær immunitet overfor PPD kvantifiseres direkte fra fullblod etter BCG-drypping, og PPD-spesifikk immunitet ble indusert i alle pasienter.
(A) Representative eksempler på kinetikken til IFN -γ positiv CD69 /CD4 T-celler før så vel som 1, 3 og 5 uker etter starten av BCG-terapi. I denne pasienten, ble den tredje drypping forsinket med 2 uker på grunn av urinveisinfeksjon uten feber. Tall i øvre høyre kvadrant viser til andelen av CD69 /IFN-y-positive celler blant alle CD4 T-celler etter stimulering med PPD, PBS (negativ kontroll), eller
Staphylococcus aureus
enterotoksin B (SEB, positiv kontroll ). Resultater på IL-2-produserende celler i denne pasient fra det samme stimulerende reaksjon er inkludert i figur 4A. Kinetics i prosentandelen av (B) PPD-spesifikke eller (C) SEB-reaktive CD4 T-celler som produserer IFN-γ eller interleukin-2 (IL-2) fra alle pasienter i løpet av induksjonen kurs. Induksjon av PPD-reaktive T-celler er vist separat for pasienter med og uten påvisbar immunitet ved utgangspunktet. Alle pasientene ble undersøkt for PPD-spesifikke T-celler, og 12 pasienter ble lengderetningen analysert for SEB-reaktive CD4 T-celler (6/18 pasienter hadde en manglende grunnverdi). Stiplede linjer representerer Kinetikken for hver enkelt pasient, og gjentatte målinger fra en pasient etter 2 eller 3 og 4 eller 5 uker er blitt gruppert som middelverdier. Den dristige linjen viser median andel av reaktive CD4 T-celler.
Økningen av PPD og SEB-reaktivt CD69 positive IFN-γ produserende T-celler mellom baseline og maksimumsverdien i løpet av BCG-instillasjoner ble kvantifisert for alle pasienter og resultatene ble stratifisert for pasienter med negativ og positiv PPD-status før behandling. Medianer og interkvartilt områder er angitt.
Behandlingsuken
baseline
1 2-3
4-5
Totalt antall patients18181818IFN-γ positive ( %) 9 (50,0%) 9 (50,0%) 16 (88,9%) 18 (100,0%) p = 0.0004IL-2-positive (%) 9 (50,0%) 11 (61,1%) 16 (88,9%) 18 (100,0 %) p = 0.0013Table 2. Andel personer med en positiv immunrespons over deteksjonsgrensen på 0,05% mot PPD før og etter BCG-instillasjon.
CSV ned CSV
Cytokin profiler av PPD spesifikke T-celler etter BCG-instillering er forskjellig fra den som ble observert hos friske kontroller
Vi har tidligere vist at en reduksjon i dual-cytokin-positivitet av PPD-spesifikke T-celler er observert i pasienter med aktiv tuberkulose, mens en høy prosentandel av IFN-γ /IL-2 doble-positive T-celler er typisk for personer med ikke-aktive tilstander [16]. For å undersøke hvorvidt gjentatt antigen-kontakt med levende BCG er forbundet med en endret cytokin-profil, og hvorvidt dette er forskjellig hos pasienter med og uten pre-eksisterende immunitet, ble IFN-y /IL-2 ekspresjonsmønstre i pasienter etter BCG-instillering i forhold til de av PPD-positive kontroller. For å sikre robust statistisk analyse av T-celle-subpopulasjoner, var denne analysen være begrenset til prøver hvor det totale antall cytokin-produserende T-celler etter stimulering oversteg 20 hendelser over bakgrunn. Representative dotplots av PPD- og SEB-reaktive cytokin profiler før og under behandling av en pasient og en kontroll er vist i figur 4A. I tråd med siste kontakt med levende BCG, pasienten hadde bare 48,1% og 55,4% av IFN-γ /IL-2 dobbel-positive T-celler etter uke 2 og 5, henholdsvis, mens 78,2% av PPD-reaktive T-celler var dobbelt -positive i kontrollen. I alle de testede individer, den prosentandel av dobbelt-positive celler etter instillasjon var signifikant lavere hos pasienter sammenlignet med kontroller (p = 0.0003, figur 4B). Prosentandelen av dobbelt-positive celler mellom SEB-reaktive T-celler var også høyere i kontrollene, selv om denne forskjellen var mindre uttalt (p = 0,03, figur 4B). Interessant, nylig indusert PPD reaktive T-celler hos pasienter uten pre-eksisterende immunitet hadde en høyere prosentandel av IL-2 enkle produserende T-celler i forhold til pasienter med pre-eksisterende immunitet (p = 0.02, Figur 4C). Omvendt, PPD-spesifikk immunitet i sistnevnte viste en dreining mot IFN-γ enkelt-positive T-celler (p = 0,01, Figur 4C). Sammen indikerer dette at den gjentatte BCG-kontakt er forbundet med endringer i cytokin-profiler tilsvarende til pasienter med aktiv tuberkulose. En forskyvning mot IL-2 enkelt-positivitet er typisk for pasienter med primær immunitet, mens en dreining mot IFN-γ enkelt-positivitet ser ut til å være assosiert med immunitet etter reaktivering.
(A) Representative dotplots av strømnings -cytometric analyse av IFN-γ og IL-2 uttrykk profiler av PPD og SEB-reaktive CD4 T-celler i en pasient før, 3 og 5 uker etter BCG-terapi (samme pasient som på figur 2A), og i en frisk kontroll. Prosentandelene som er vist i de tre kvadranter refererer til relative prosentandel av IFN-y enkelt-positive, IFN-y /IL-2 dobbelts-positive og IL-2-en-positive celler blant alle cytokin-positive CD4 T-celler. (B) Den prosenter av IFN-y /IL-2 dobbel-positive celler blant PPD- (sirkler) eller SEB-reaktive (firkanter) CD4 T-celler ble kvantifisert for alle pasienter i uke 2/3 (PPD n = 16; SEB n = 18), samt uke 4/5 (PPD n = 18; SEB n = 18) som hadde et tilstrekkelig antall cytokin-produserende celler etter spesifikk stimulering (≥20 hendelser). Mindre enn 20 hendelser ble målt i 2/9 pasienter hvor samlet prosentandel av PPD spesifikke CD4 T-celler ved baseline var over 0,05%. Ved uke 2/3, alle 9 baseline-positive pasienter hadde hendelses teller over 20, mens 2/9 baseline negative pasienter var fortsatt under deteksjonsgrensen på 0,05% og hadde 20 arrangementer. Alle andre prøver hadde hendelses tellinger av mer enn 20. cytokin profilering av CD4 T-celler ble utført i 16 kontroller etter PPD-stimulering (svarte sirkler) og i 7 kontroller etter SEB-stimulering (svarte firkanter). (C) Den prosentandel av IL-2 enkelt-positive og IFN-γ enkelt-positive celler blant PPD-spesifikke T-celler etter uke 2/3 ble stratifisert for pasienter med negativ (n = 7) og positiv PPD-status (n = 9) før behandlingen. I to baseline negative pasienter antall cytokin positive T-celler var fortsatt under 20 arrangementer. Medianer og interkvartilt områder er indikert.
Pre-eksisterende cellulær immunitet mot PPD ser ikke ut til å forutsi behandling suksess
Til slutt, selv om denne studien er begrenset av en liten prøve størrelse og en heterogen vedlikeholdsbehandling, en foreløpig analyse av forbehandling PPD-reaktivitet og PPD-spesifikk T-celle økning i forhold til behandling suksess ble utført. Åtte pasienter ble klassifisert som ikke-respondere (gjennomsnittlig tid til tilbakefall 7,5 ± 5,9 måneder) og 10 respondere (gjennomsnittlig oppfølging 30 ± 22,7 måneder). Tilstedeværelsen av PPD-spesifikke T-celler ved utgangspunktet synes ikke å være relatert til etterfølgende behandling suksess, som basislinje PPD-spesifikk immunitet, målt ved hjelp av IFN-y-reaktive celler, var til stede i 4 av 8 ikke-responderende og 5 ut av 10 respondere (p = 1,0), og det var ingen forskjell i tilbakefall overlevelse i begge gruppene (figur 5A). Tilsvarende hadde graden av PPD-spesifikk T-celle-vekst ikke forutsi behandling suksess, da økningen i IFN-y-reaktive CD4 T-celle-frekvensene etter BCG drypping var 7,1 ganger (IQR 10.7) i ikke-respondere og 8,2 ganger (IQR 11,7) i respondere (p = 0,83, figur 5B). Således, en effekt av pre-eksisterende immunitet eller systemisk økning av PPD-reaktive T-celler etter BCG-induksjon på behandling suksess ble ikke discernable i sammenheng med denne studien.
(A) Gjentagelse overlevelse avhengig PPD-status før behandling. (B) Økningen av prosenter av IFN-γ produserende CD4 T-celler blant alle spesifikke T-celler etter stimulering med PPD mellom baseline og maksimumsverdien ble sammenlignet hos ikke-respondere (hvite sirkler, n = 8) og respondere (svarte sirkler, n = 10).
Diskusjoner
Instillasjon av levende BCG-bakterier er en effektiv behandling for å hindre utviklingen av ikke-muskel invasiv blærekreft [26]. I denne studien er det brukt intracellulær farging cytokin for å karakterisere induksjon av PPD-spesifikk T-celle immunitet før og i løpet av BCG-behandling. Vi viser at en standard BCG-induksjon kurs induserer en systemisk PPD-spesifikk T-cellerespons som økninger i størrelsesorden over tid, og er klart detekterbare i alle pasienter etter 4-5 ukers behandling. I samsvar med funn fra immunitet mot andre patogener eller vaksiner [27,28], både induksjonskinetikk og cytokin profiler uenige avhengig av pre-eksisterende immunitet mot PPD. Som immunresponsen profilen etter drypping av levende BCG-bakterier ser ut til å være lik som i aktiv infeksjon med
M. tuberkulose product: [16,29], kan denne terapi representerer en levedyktig modell for i lengderetningen å studere induksjon av antigen-spesifikk immunitet før og etter naturlig infeksjon med
M. tuberkulose
hos mennesker, der kunnskap på er begrenset av det faktum at tidspunktet for smitte er sjelden kjent.
Våre observasjoner i pasienter uten pre-eksisterende immunitet illustrerer at
de novo
induksjon av en systemisk T-cellerespons overfor PPD er bare observert 2-3 uker etter den første drypping. Dette forsinket tidsforløpet er typisk for sakte replikerende bakterier, og sammenlignes med T-celle immunitet etter naturlig
M. tuberkulose
infeksjon eller etter vaksinasjon som tar flere uker for induksjon [30,31]. I samsvar med aktiv replikasjon av BCG-bakterier, cytokin-ekspresjonsprofilen av BCG-induserte T-celler i både pasienter med og uten pre-eksisterende immunitet viste en reduksjon i dual-positivitet som ligner på våre observasjoner hos pasienter med aktiv tuberkulose [16 ]. Av notatet, til tross for dette uniform nedgang i dual-positive T-celler hos pasienter med aktiv tuberkulose, var det uklart hvorfor cytokin profilen hos noen pasienter viste en dreining mot IFN-γ og andre heller skiftet til IL-2 [16]. Resultatene fra denne studien viser nå, at dette synes å være relatert til nærværet eller fravær av pre-eksisterende immunitet, som en høyere prosentandel av nylig induserte T-celler hos pasienter uten en pre-eksisterende immunitet ble forskjøvet mot IL-2 enkelt-positivitet . Dette er konsistent med en dominans i IL-2 positive PPD-spesifikke T-celler enn IFN-y-positive celler som nylig ble beskrevet i spedbarn tidlig etter BCG-vaksinasjon [31]. Dette cytokin profil ligner også den av akutt oppløsnings infeksjoner, og kan opprettholde proliferativ aktivitet for å sikre ekspansjon av spesifikk immunitet [27]. Interessant, BCG-indusert immunitet hos pasienter med pre-eksisterende immunitet heller vist en dreining mot IFN-γ single-positivitet, som er konsistent med cytokin profiler av antigen-spesifikke T-celler under reaktive infeksjoner som cytomegalovirus, som også er preget av en reduksjon i IFN-γ /IL-2 dobbel-positivitet og en samtidig dreining mot IFN-γ enkelt-positive celler [32]. Disse observasjonene kan også være aktuelt for pasienter med aktiv tuberkulose eller sine kontakter der pre-smittestatus er sjelden kjent. I denne situasjonen, forskjellen i cytokin profiler av
M. tuberkulose
-spesifikke T-celler kan brukes til å skille personer med primær infeksjon fra reaktivering og dermed kan være nyttig i å spore naturhistorie av
M. tuberkulose
infeksjon.
PPD-spesifikk T-celle responser viser betydelige interindividuelle forskjeller på et gitt tidspunkt før og etter drypping. Dette illustreres av det faktum at T-celle nivåer som ble nådd 4-5 uker etter drypping hos pasienter uten pre-eksisterende immunitet var i samme område som utgangsnivået hos pasienter med pre-eksisterende immunitet. Som den proliferative kapasiteten ble vist seg å øke i løpet av BCG-behandling [10], innebærer dette at tilstrekkelige T-cellenivået kan nås tidligere og krever færre drypping sykluser i personer med pre-eksisterende immunitet. Den spesielle rolle pre-eksisterende immunitet for å redusere tiden fra drypping til tumorinfiltrasjon støttes av en fersk studie på mus som overbevisende viste at parenteral pre-vaksinasjon med BCG ikke bare akselerert tumorinfiltrasjon men også terapeutisk effekt [9]. Selv om systemisk immunitet kan også vurderes ved å bruke hud-testing eller proliferasjonsanalyser [33,34], kan strømnings-cytometriske analysen kan utføres i løpet av en dag, og brukt i en klinisk sammenheng for en individuell overvåkning av induksjon av en spesifikk immunitet. Denne fremgangsmåten kan også brukes til å utforske effekten av andre instillasjon strategier med reduserte doser eller færre sykluser, og derved bidra til en reduksjon i toksisitet.
murine modeller har indikert at systemisk immunitet etter BCG-instillasjon kan tjene som estimering av mengden av T-celler med terapeutisk potensiale på stedet av tumor [9]. Bevis for tumor-infiltrerende T-celler og dens tilknytning til behandlingsrespons hos mennesker har også vist seg ved immunhistokjemisk fra biopsier [35], men dette er vanskelig å utføre som screening på en rutinemessig basis. Imidlertid kan en positiv hud-test anses som en betennelsesreaksjon basert på T-celle infiltrerer på stedet av kutan indurasjon, og hud-test hardhet generelt korrelerer med PPD-reaktive T-celler som ble analysert fra fullblod [23,25]. Derfor har mange studier på mennesker derfor sikte på å knytte hud-test konvertering med langsiktige resultatet etter behandling, men resultatene var heterogene [36,37]. Selv om studien ikke ble drevet for robust utfallet analyse, verken før behandling frekvenser eller induksjonskinetikk PPD-spesifikke T-celler viste noen merkbar forbindelse med langtidsbehandling utfall. Bortsett fra den lave prøvestørrelse, kan flere årsaker står for dette. Når det gjelder utfallet analyse, ble vår studie begrenset av det faktum at systemisk immunitet ble bare vurdert under induksjon kurs.
