Abstract
Bakgrunn
Terapeutisk antistoff utvikling er en av de raskest voksende områdene i den farmasøytiske industrien. Generere høy kvalitet monoklonale antistoffer mot et gitt terapeutisk mål er avgjørende for en vellykket utvikling av legemidler. Men på grunn av immuntoleranse, noe som gjør det vanskelig å generere antistoffer ved hjelp av konvensjonelle metoder.
metodikk /Funn
Blandet fire humane magecancer (GC) cellelinjer ble benyttet som immunogen i A /J-mus; seksten sterkt positive hybridoma kolonier ble selektert via fluorescens-aktivert cellesortering-high throughput screening (FACS-HTS) under anvendelse av en total på 20.000 kolonier i seksti-syv 96-brønners plater mot levende celler (blandede humane GC-celler versus human PBMC kontroller). MS17-57 og kontrollere kommersiell alkalisk fosfatase (ALP) mAbs ble brukt til å bekrefte målet antigener (Ags), som ble identifisert som Alpene uttrykt på GC celleoverflaten gjennom en kombinasjon av western blot, immunoprecipitation og massespektrometri (MS).
MS identifisert Ags anerkjent av MS17-57 å være to varianter av en utskilt ALP, PALP og IALP (placenta og tarm ALP). Disse proteiner tilhører en hydrolase enzymfamilien er ansvarlig for fjerning av fosfatgrupper fra mange typer av molekyler. Immunfluorescens farging ved hjelp av MS17-57 viste høyere farging av gastrointestinal (GI) cancervev sammenlignet med normale vev (GI
P
0,03), og bekreftet binding av MS17-57 å være begrenset til en funksjonell epitop uttrykt på kreftcelleoverflaten. Proliferasjonsanalyser ved hjelp av PALP /IALP-uttrykkende cellelinjer GC viste at MS17-57 hemmet cellevekst med 32 ± 8%. Transwell celle migrasjon analyser dokumentert at MS17-57 kan hemme PALP /IALP-uttrykke GI kreft celle migrasjon ved 25 ± 5%. MS17-57 mAb hemmet tumorvekst i nakne mus.
Konklusjoner
Våre funn tyder på at PALP og IALP kan ectopically uttrykt på ekstracellulære matrise av GI kreft, og at MS17-57 rettet mot PALP /IALP kan hemme GI kreft celler vekst og migrasjon
i
vitro Hotell og
i
vivo
. Denne undersøkelsen gir et eksempel på identifisering av kreft biomarkører som representerer lovende terapeutiske mål ved hjelp av mAb generert gjennom en roman HTS teknologi
Citation. Li M, Gao J, Feng R, Wang Y, Chen X, Sun J, et al. (2013) Generasjon av monoklonalt antistoff MS17-57 målretting Utskilt alkalisk fosfatase ectopically uttrykt på overflaten av Gastrointestinal kreft celler. PLoS ONE 8 (10): e77398. doi: 10,1371 /journal.pone.0077398
Redaktør: Nikki Pui Yue Lee, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: May 1, 2013, Akseptert: 3. september 2013, Publisert: 15 oktober 2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (tilskudds tall 81201596, 81101847, 81172324, 91229106, 31270963); Viktige prosjekter i National Science Teknologi Pillar Program of China (2011BA203191); Science and Technology Commission av Shanghai kommune (12XD1403700, 12PJ1406300); Forskningsfondet for doktorgradsutdanning av høyere utdanning i Kina (20110073110071); Key prosjekt Shanghai Education Committee (12ZZ105). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Alle forfatterne er oppfinnerne av en patentsøknad vedrørende immuniserer mus, forbereder MS17- 57 hybridom og anvendelse av MS17-57 monoklonalt antistoff for behandling av kreft. Forfatterne hevder at to forfattere ble ansatt av et kommersielt selskap, Shanghai MabStar, Inc. Forfatterne erklærer også at MS17-57 samt screening metoden har blitt sendt inn for patentsøknaden med tittelen «Generation of anti-ectopically uttrykt alkalisk fosfatase mAb, sin metode og programmer «(en patent), Statens Intellectual Property Office i Folkerepublikken Kina (CN201310090565.9). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. De fire andre mAbs vil bli patentert, og resultatene vil bli offentliggjort så vel.
Innledning
Gastrointestinal (GI) kreft er en av de vanligste ondartede svulster hos mennesker med høy risiko for dødelighet verdensomspennende [1]. Utviklingen av terapeutiske antistoffer for å undersøke, evaluere, forebygge og behandle kreft er en av de raskest voksende områdene forskning i både den akademiske arena og farmasøytisk industri [2]. Den generasjonen av høy kvalitet monoklonale antistoffer (mAbs) mot kreft markører som terapeutiske mål er en viktig vei for kliniske legemiddelutvikling. Noen kreftmarkører er kjent (for eksempel human epidermal vekstfaktor-reseptor 2 og vaskulær endotelial vekstfaktor) eller godt utviklet, men de fleste er fortsatt ukjent eller uutviklet [3]. Det er derfor stor interesse i å generere mAb mot nye og ukjente kreft mål. mAb mot spesifikke tumormål kan utvikles og identifisert ved hjelp av en rekke metoder, inkludert enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) -høy throughput screening (HTS), fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) -HTS, og
in vitro Hotell og
in vivo
screening.
Identifisering av nye kreft biomarkører som er involvert i tumordannelse, kreftutvikling, eller kreft forebygging fortsetter å være av stor interesse verden over [4,5]. På grunn av fremskritt i proteomikk og andre aspekter av molekylærbiologi, slike undersøkelser blir stadig mer aktuelt i dagens tid enn tidligere. Cutting-edge HTS-teknologi er relativt godt utviklet og er svært populært i mange fag [6,7].
Vi har derfor undersøkt generering av mAbs mot potensielt nye Ags på kreftcelleoverflaten ved hjelp av en FACS- HTS-metoden. I denne studien fant vi at MS17-57 mAbs kunne identifisere placenta og tarm alkalisk fosfatase (PALP og IALP, henholdsvis) som mål uttrykt på kreftcellemembran. Vår strategi var å utnytte en ny fremgangsmåte for FACS-HTS og hybridoma teknologi ved anvendelse av en blanding av 4 live GI kreftcellelinjer som immunogen [8], hypoteser at i det minste noen av de mAb produsert ville være sannsynlig å binde til konformasjonell epitope (r ) på celleoverflaten av GI-kreftceller. Dataene viste at MS17-57 kunne binde seg til PALP og IALP som ble ectopically uttrykt på celleoverflaten, og kunne nøytralisere ALP aktivitet både
in vitro Hotell og
in vivo
. Disse resultatene tyder på at PALP og IALP uttrykkes på tumoroverflaten GI med avvikende kreftcellemetabolisme og signalreaksjonsveien som de kan fremme kreftcellevekst og metastase. MS17-57 er et mAb med høy affinitet og spesifisitet, potensielt representerer et nyttig reagens og en potensiell basis for en ny terapeutisk strategi i kreftlegemiddelutvikling.
Våre fremtidige studier vil fokusere på den molekylære mekanismen for MS17-57 inhibering av kreftceller proliferasjon og migrering via binding til PALP /IALP på kreftcelleoverflaten, og på å klargjøre intracellulære signalveier som påvirkes ved innvirkning av dette antistoff. Forutsatt ytterligere undersøkelser bekrefter de lovende resultatene som beskrives i disse foreløpige undersøkelser, kunne antistoff prosjektering av MS17-57 som et kimært eller humanisert antistoff for terapeutisk anvendelse bli forfulgt.
Materialer og Metoder
Cellekulturer
GI kreft cellelinjer MKN45, BGC823, SGC7901, MKN28, AGS og GES-1 ble kjøpt fra Institutt for biokjemi og cellebiologi Shanghai Institutes for Life Science, Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) og Riken Bioresource Senter (Tsukuba, Japan). De GI kreft cellelinjer MKN-74 [9] og TMK-1 [9] var høflighet av Dr. Gary K. Schwartz (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY, USA), og KKLS celler [10] ble oppnådd fra Dr. Yukuta Takahashi (Cancer Research Institute, Kanazawa University, Kanazawa, Japan). Mage kreft cellelinjer ST-8 og ST-9 [11] var høflighet av legene. Bradley McIntyre og Paul F. Mansfield, University of Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, Texas, USA). Alle andre cellelinjer (SP2 /0, etc.) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble oppnådd fra en frisk frivillig med informert samtykke.
Bortsett fra SP2 /0-myelomceller og mAb hybridomceller, alle celler ble dyrket i MD6, en hjemmelaget, serumfritt medium avledet fra Dubecco modifiserte Eagles-medium (Gibco BRL, Rockville, MD, USA) med 5% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) (Sigma, St. Louis, MO, USA), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /mL streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De myelom og hybridom-celler ble dyrket på samme måte men uten føtalt bovint serum. Myelom og hybridom-celler ble dyrket i suspensjon. GI kreft celler ble dyrket til å følge vevsdyrkingskolber med 5% FBS /MD6 medium.
Pasient Vev
Ferske vevsprøver og tilstøtende noncancerous vev (mucosa) av syv GC pasienter som gjennomgår kirurgi var innhentet fra Kirurgisk avdeling av Shanghai Ruijing Hospital i Shanghai, Kina. Disse pasientene hadde ikke fått cytostatika eller strålebehandling før operasjonen. Institutional Review Board protokoller ble observert, og etisk godkjenning for studien ble gitt av forskningsetiske komité for Ruijing Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Informert skriftlig samtykke hadde blitt innhentet fra alle deltakere (inkludert frivillige donorer) involvert i studien.
Fresh vev ble farget med MS17-57 samt isotypekontrollantistoff mAb. De bindende signaler ble forsterket, merket med fluoresceinisotiocyanat, og telles ved FACS-HTS.
Mus
Menn A /J mus (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) 6- 8 uker gammel ble kjøpt fra Nanjing Experimental Model Animal Center, Nanjing University, Nanjing, Kina, og opprettholdt på dyre~~POS=TRUNC av Shanghai MabStar, Shanghai, Kina. Vedlikehold av A /J mus og eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Shanghai Animal Welfare og forskningsetiske komité, Science and Technology Committee of Shanghai Municipal Government, Kina og lisensnummer er SYXK (Hu) 2009-0087.
Mann JAX nakne mus i alderen 4-8 uker ble kjøpt fra Shanghai Experimental Modell Animal Center og opprettholdt på Experimental Animal Center of Shanghai Rueijing Hospital. Disse nakne mus ble anvendt for eksperimenter med xenotransplantater av human magekreft (GC) og metodene som er tilsvarende Sela gruppe som tidligere beskrevet [12]. Vedlikehold av JAX nakne mus og eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Shanghai Animal Welfare og forskningsetiske komité, Science and Technology Committee of Shanghai Municipal Government, Kina og lisensnummer er SYXK (Hu) 2011-0113.
Live Cancer Cell Immunisering
Hver A /J mus ble injisert subkutant på 5-10 sider så vel som når intraperitonealt (IP) med ca 5-10×10
6 celler (like mengder MKN45, BGC823, SGC7901, og MKN28 celler) i fosfat-bufret saltvann (PBS; pH 7,4). Tre mus ble tildelt per eksperimentell gruppe. To uker senere ble musene injisert igjen, for en total av tre immuniseringer, samt en i.p. booster tre dager før fusjon forsøket
Tre dager etter booster, ble miltceller samlet av kirurgi fra en immunisert mus ofret av CO
2 innånding og alle anstrengelser ble tatt for å redusere dyrs lidelser.; miltcellene ble deretter sammensmeltet med myelomceller SP2 /0-celler [13,14] i 50% polyetylenglykol (pH 7,4) fusjons løsning for å generere hybridomer mAb. De sammensmeltede hybridoma-celler ble opprettholdt i hypoksantin-aminopterin-tymidin-medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), og 280 ul /brønn fusjonerte celler (ca. 1-2 x 10
4 miltceller /brønn) ble alikvotert inn i seksti syv 96-brønners flatbunnede vevskulturplater og inkubert ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO
2 i 10 dager. På samme tid ble de fire GI kreftcellelinjer dyrket i bulk i flere kolber.
fluorescens-aktivert cellesortering med høy gjennomstrømming screening (FACS-HTS)
FACSCalibur-HTS-systemet (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) ble brukt til å skjerme de selektive hybridomene fra store mengder fusjons celler /kolonier i fusjonsplatene. Opp til 200 screening og telleren screening (kreftceller versus normale celler) plater kan brukes i slike screeningsanalyse. Celler fra alle fire GC-linjer ble høstet, blandet og porsjonert (ca. 1×10
6 celler /brønn) i 96-brønners U-bunnplater (67 plater) sikret samme antall av humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra en sunn frivillig ble separert ved hjelp av menneskelig lymfocytt-skille løsning Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare biovitenskap, Pittsburgh, PA, USA) og porsjonert i 96-brønners U-bunnplater (en annen 67 plater for teller screening). Supernatanten (80 pl /brønn) fra hver av de 67 fusjonsplatene ble overført til GC-celleplater som er merket 1 til 67 etter at disse cellene var blitt blokkert med 2,0% bovint serumalbumin (BSA) /PBS-blokkeringsbuffer i platene. Supernatant fra de samme fusjonsplatene ble likeledes overført til PBMC platene. Etter GC cellen og PBMC Platene ble vasket tre ganger med blokkeringsbuffer, det sekundære antistoff [geit-anti-mus-immunoglobulin G (IgG) Fc konjugert med fluorescein-isotiocyanat] ble alikvotert inn i begge GC-celleplater og PBMC-plater (100 ul /brønn) og inkubert på is eller i et kjøleskap ved 4 ° C i 30 minutter, og igjen vasket tre ganger med blokkeringsbuffer. De fluoriserende farget cellene fiksert i 1,5% paraformaldehyde /PBS. Prosentandelen av farget celle topp skift og mener fluorescens intensitet (MFI) ble kontinuerlig overvåket av FACS-HTS-systemet for 134 screening og kontra screening 96-brønners U-bunnplater. Hybridomkulturer kolonier utviser sterk binding og spesifisitet for GC-celler (og ingen binding til PBMC) ble valgt for ekspansiv vekst, avvent fra kondisjonert medium, og subklonet.
mAb Generation
Supernatanter ble samlet inn fra utvalgte hybridom-kloner og renset ved anvendelse av Protein-A-Sepharose-kolonne (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Vi valgte rensede MS17-57 mAb for ytterligere analyse, som ble filtrert gjennom et 0,2 um membran, sterilisert, og alikvotert inn i cryotubes oppbevart ved 4 ° C for anvendelse i cellekulturer eller
in vivo-studier
(rives under). Blandingen av mAb i PBS og 50% glyserol ble frosset ved -20 ° C for langtidslagring.
Mouse IgG Isotyping
Vi brukte en mus mAb isotyping kit (IsoStrip, RochePharma AG , Reinach, Sveits) for å karakterisere isotype av musen MS17-57 mAb (IgG).
cDNA Sekvensering av Variable regionen MS17-57
Vi brukte en RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) for å isolere total RNA fra MS17-57 hybridomceller. Den MS17-57 cDNA bibliotek ble opprettet fra mRNA i revers transkripsjon reaksjoner med en Super III første-strand kit (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). De MS17-57 IgG Fab-fragment Ag-bindende variable regioner ble forsterket av polymerase chain reaction (PCR) med 21 par av tung-kjeden og lys-kjeden primere, som ble hentet fra mus IgG Bibliotek Primer Set (Progen Biotechnik, Heidelberg, Tyskland). PCR-produktene ble brukt til DNA-sekvensering, som ble utført ved Lee Lu lab ved MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA. Komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) og rammeområdene (FWRs) av MS17-57 ble identifisert ved hjelp av tilgjengelige ressurser ved Nasjonalt Senter for Bioteknologi Information nettsteder og bestemme justeringer av cDNA og aminosyresekvenser [15-18].
Indirekte ELISA
Ag (protein) (0,2 ug /ml i PBS) ble belagt på Immulon-II HB 96-brønners ELISA-plater (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og inkubert i et fuktig -boks over natten ved romtemperatur (RT). Ag-belagte plater ble vasket og blokkert med 1,0% BSA /PBS-Tween 20 (PBST) buffer, og 100 ul av primære antistoffer individuelt fortynnet i 1,0% BSA /PBST ble tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur og vasket med PBST. Etter vasking ble 100 pl av fortynnet (1: 2500) pepperrot-peroksidase (HRP) -konjugert geite-anti-mus-IgG-Fc-polyklonalt sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 1 time ved RT. Etter en ytterligere vask med PBST, 150 ul av peroksidasesubstrat (tetrametylbenzidin i 0,02 M [pH 6,0] citrat /acetatbuffer og 0,003% H
2o
2) ble tilsatt til hver brønn for å utvikle farge til å binde signaler; Utvikling ble stanset ved tilsetning av 50 ul 0,2 M H
2SO
4 til hver brønn. Absorbans (optisk densitet, OD) av reaksjons platene ble avlest ved 450 nm med referanse turbiditet innstilt på 620 nm.
Immuocytochemical Analyse med Cytospin Slides
For å gjøre 1×10
6 GC celler i 50 mL /hver, Cytospin kammer hull ble spunnet på lysbilder og festes med 4% paraformaldehyde /PBS løsning, dehydrert med 70% etanol og lufttørket. Glass ble rehydrert i PBST i en flat posisjon i 5 minutter og deretter inkubert i 10% geiteserum /PBS. Glassene ble inkubert med primære antistoffer ved en passende fortynning i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C, skyllet i PBST to ganger i 5 minutter hver i en /horisontal stilling. Platene ble deretter inkubert med HRP-merket sekundært antistoff (geite-anti-mus-IgG-Fc-HRP, Jackson Immunoresearch Laboratories) ved 1: 500 fortynning i PBS i 30 minutter ved RT. Deteksjon mAb flekker på kreftceller ble utført med 0,125% aminoethylcarbazole kromogent substrat i 5-10 minutter ved RT, og mAb fargede Cytospin Glassene ble motfarget med hematoksylin Gill (Dako, Carpinteria, CA, USA). Anti-fade montering medium (Vector Labs, Burlingame, CA, USA) ble brukt til å montere lysbildene.
Cancer Cell Proliferation hemningsmetoden
Den kreftcelle spredning hemming analysen ble utført ved bruk av Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Santa Clara, CA, USA) og var basert på påvisning av dehydrogenase aktivitet i levende celler. En total på 5000 celler /150 ul valgt BGC823, MKN45, eller begge typer av celler fra 4 GC-cellelinjer benyttet i immuniseringen ble dispensert i hver brønn av 96-brønners plater for hver av quadruplicated testforhold. Platene ble pre-inkubert i 24 timer i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO
2. 50 ul /brønn av MS17-57 (8 og 2 ug /ml), et irrelevant (isotype kontroll) mAb (30 og 8 ug /ml) og en medium alene (blindprøve) ble tilsatt til prøveplatene i fire for å redusere variasjon. Forsøksplatene ble inkubert ved bruk av de samme betingelsene som de pre-inkubering. CCK-8-løsning ble tilsatt til platene (10 pl /brønn), tatt som en plate for hver testbetingelse per dag fra dag 1 til 7. Platene ble inkubert i 3 timer, og absorbansen ved 450 nm ble målt ved anvendelse av en VERSAmax mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
Cancer Cell Migration hemningsmetoden
hemming av kjemotaksisk kreft celle migrasjon ble vurdert ved hjelp av QCM 24-brønnen kolo celle migrasjon analysen ( EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Ved RT, 300 ul av cellesuspensjonen (1,0 x 10
5 celler /ml i MD6), med eller uten hverandre 5, 10 og 20 mikrogram /ml MS17-57 pluss irrelevant mAb tilsatt til hver sette inn, ble det tilsatt til hver av de 24 brønner i migrerings kammeret, og 500 ul av MD6 med 5% bovint fosterserum ble tilsatt til hver brønn i det nedre kammer. Forsøksplatene ble inkubert i en vev kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO
2 for 24 timer, og ikke-migrerende celler ble forsiktig fjernet fra det indre av innsatsene med en bomullspinne. Celler på den nedre overflate av membranen ble farget ved å dyppe skivene i krystallfiolett (en nukleinsyre fargestoff) fargeløsning (500 pl /brønn) i 20 minutter. Innsatsene ble vasket i vann flere ganger, tillatt å lufttørke, og fotografert. De farget celler ble porsjonert i 96-brønns plate og telles ved VERSAmax mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
tumorvekst i Balb /C Nude Mice
Den antitumor aktivitet av den MS17-57 ble undersøkt med xenotransplantater av human GC i Balb /C-nakne mus som tidligere beskrevet [12]. I korthet, 1 x 10
6 valgt BGC823 eller MKN45 celler i MD6 med eller uten MS17-57 pluss irrelevant mAb ble injisert i.p. i hver mus. Denne injeksjon produserte svulster i alle musene ved 6 uker etter celle implantasjon, og vekten av svulsten nodul av hver var omtrent 0,3-1,0 gram, noe som avhenger av hvor mange innledende celler ble inokulert. Behandling med MS17-57, irrelevante mAbs, og PBS (som mellom tomme kontroller) (alle ip) startet dagen etter kreftcelle injeksjon (dvs. på dag 1) og ble gjentatt på dag 15 og 29. Hver behandlingsgruppe besto av ved minst fire dyr. Antall tumorknuter ble tellet, og den nodul diameter ble målt én gang. Musene ble avlivet ved CO2 innånding på dag 48 og alle anstrengelser ble gjort for å bøte dyrs lidelser.
Immunoutfelling (IP) og massespektrometri (MS) Analyse
For indirekte IP, magnetiske Dynabeads belagt med protein-A (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) ble inkubert med 50 ug MS17-57 i 30 minutter ved romtemperatur med konstant risting. Perlene ble deretter vasket og inkubert med lysat av utvalgte BGC823 eller MKN45 GC-celler, som lysatene ble fortynnet på riktig måte. Inkubasjon skjedde i nærvær av 0,1% TritonX-100 i radioimmunopresipitasjon assay-ekstrakter (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). mAb mot anti-β-aktin (omtrent 42 kDa på natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese [SDS-PAGE] gel) ble anvendt som en indre kalibreringsstandard. Lysatet ble suksessivt utsatt for MS17-57-belagte perler i 30 minutter under rotasjon. Bundet Kulene ble vasket med 0,5% TritonX-100 etterfulgt av vann. Prøvene ble eluert ved oppvarming i kokende vann sammen med 50 pl /hvert eluat av Laemmli prøvebuffer denaturerende (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Deretter ble prøvene lastet og separert på 10% Bis-Tris-gel (Bio-Rad) i 1 x 2 – (
N
-morpholino) etansulfonsyre rennende buffer og SDS-PAGE. Gelen ble farget med et sølvfarging kit (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). De fargede målet bånd ble kuttet og analysert med en ProteinChip system serie 4000 (Enterprise Edition) massespektrometer (Bio-Rad).
Direct IP ble utført ved hjelp av Dynabeads antistoff koblingssett (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) til direkte par perlene med MS17-57. De resterende trinn var de samme som beskrevet for indirekte IP.
mRNA uttrykk ved kvantitativ revers transkripsjon (QRT) -PCR Analyse
Utvinning av total RNA fra 10 GI kreft cellelinjer ble utført med TRIzol reagens (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) [19]. RNA ble kvantifisert ved hjelp av A260 /A280-nm absorpsjon ratio. For å konvertere RNA til cDNA, ble en 1 mL av total RNA prøven anvendt i en revers transkripsjonsreaksjon med RNase inhibitor (Invitrogen), Superscript III revers transkriptase (Invitrogen), ditiotreitol, og første-tråd buffer. Blandingene av prøvene ble inkubert ved RT i 10 minutter og deretter ved 42 ° C i 50 minutter. Reaksjonsblandingen ble deaktivert ved 70 ° C i 15 minutter.
forover og bakover primere ifølge IALP, PALP, og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (5′-TCCATCTTCGGGTTGGCCCCC-3 «og 5»-TCCGTGGGTCTCGGACGACAG-3- «; 5′-CCTGGGTGCTGCTCCTGCTGGG-3′ og 5»-CGTAGACACCCCCATCCCGTCAC-3 «, og 5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′ og 5»-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 «, respektivt) ble syntetisert og benyttet i en real-time PCR-reaksjon med SYBR grønne reagenser (Life Science, Hercules, CA, USA) og lastet opp på en 96-brønns plate. Blandingen av prøvene ble kjørt i en CFX96 Touch real-time PCR deteksjon system (Bio-Rad) under de følgende betingelser: 93 ° C i 2 minutter for pre-denaturering, 93 ° C i 1 minutt for denaturering, 55 ° C i 1 min for gløding 72 ° C i 1 min for forlengelse i 40 sykluser, og 72 ° C i 7 min for den endelige inkubering. Data ble analysert ved hjelp av Opticon Monitor programvare (Life Science, Hercules, CA, USA).
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med SPSS programvare (IBM). Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittene. Forskjeller ble analysert ved t-test;
P
verdier 0,05 ble ansett som vesentlig
Resultater
MS17-57 hybrid ble generert ved immunisering med levende GC Cells
Etter prinsippene. av mAb generasjon [10], ble det benyttet en blanding av levende MKN45, BGC823, SGC7901, og MKN28 GC-celler som immunogen for å immunisere A /J mus tre ganger. Før den siste forsterkningsinjeksjon, ble serum fra en hale-blø av hver immunisert mus oppsamlet. SGC7901 og BGC823 celler ble tilfeldig valgt fra de fire GC cellelinjer som ble brukt i levende celle immunisering. Humane PBMC isolert fra fullblod fra en frisk donor ble benyttet som en kontroll noncancer. Menneske GC celler og PBMC ble bundet med serum fra hver immunisert mus og med ikkeimmunisert musserum for kontroll (figur 1). Alle tre mus i hver cellelinje gruppe oppviste binding signaler til GC-cellelinjer og PBMC, selv om PBMC hadde forholdsvis svakere signaler.
Menneskelige PBMC ble isolert fra helt blod fra en frisk donor valgt for normal celle kontroll. MKN45, BGC823, SGC7901, og MKN28 celler ble anvendt i forsøkene, men SGC7901 og BGC823 cellelinjer ble tilfeldig valgt som eksempler i denne figuren. MFI var høyere i disse celler enn i PBMC. Alle tre mus viste sterke immunresponser mot de menneskelige GC cellelinjer.
miltceller fra fire menneske GC cellelinjer immunisert mus ble smeltet sammen med mus myelom SP2 /0-cellene til å generere antistoff hybridom. FACS-HTS ble brukt til å screene for sterkere Ag binding fra en stor pool av bindemidler (dvs. mAbs) i hybridom repertoar. De mAb bundet hovedsakelig til konformasjonelle epitoper på overflaten av levende cancerceller. Ved hjelp av FACS-HTS, valgte vi hybridoma kolonier med sterke bindende signaler ved hjelp av en total på 20.000 kolonier i seksti-syv 96-brønners plater mot de blandede levende GC-celler og normale humane PBMC (benke screening celler). Etter disse hybridomceller ble avvent fra seleksjonsmedium, ble de fem hybridomer med den høyeste bindings signalene er valgt for subkloning og antistoff affinitetsrensing. Vi valgte MS17-57 klone for videre studier. (De fire andre mAbs vil bli vurdert på et senere tidspunkt.)
MS17-57 Karakterisering
Vi preget MS17-57 mAb med en rekke metoder. Informasjon om IgG1 for den tunge kjede og κ for den lette kjeden ble erholdt fra mus-antistoff isotyping [20]. De variable regioner (lettkjede og tungkjede) i Fab-fragmentet av MS17-57 ble sekvensert for DNA og aminosyrer (figur 2). De unike Ag-bindende regioner vist at CDR’ene mellom FWRs av de tunge og lette kjeder var tilstede i den variable region til Fab-fragment som MS17-57 identitet.
FWRs er plassert mellom CDR.
MS17-57 Binding til lysates av GI kreft celler
for å definere noen biologiske funksjoner i MS17-57 mAb, lysater av MKN45, BGC823 og GES-1 cellelinjer (sistnevnte generert og foreviget fra normale mageslimhinneceller og transformert med Simian virus 40) [21] ble individuelt belagt på ELISA-plater. Den rensede MS17-57 lagt på plate pluss sekundært antistoff-HRP forsterket bindingssignaler (figur 3). Denne indirekte ELISA viste at MS17-57 fortsatt kunne binde spesifikt til denaturert mål (r) av cellemembranprotein fra kreftcellelysatene. MKN45 cellene uttrykte MS17-57 mål på et høyere nivå enn BGC823 eller GES-1 celler gjorde, noe som indikerer at målet uttrykk nivåer kan variere mellom cellelinjer.
MKN45, BGC823, SGC7901, og MKN28 celler ble brukt i forsøkene, men MKN45 og BGC823 cellelinjer ble tilfeldig valgt som eksempler i denne figuren. MS17-57 uttrykt sterke bindende signaler til MKN45 celler og moderate forpliktende signaler til BGC823 celler og GES-1 celler. Cellelysatene ble belagt med 1,0 ug /mL PBS på Immulon-II HB 96-brønners ELISA-plater (100 ul /brønn). Proteinkonsentrasjonene av disse cellelysatene var balansert, men ikke for bindende mål (Ags) som kan være en stor variasjon. Irrelevant mAb ble anvendt som en isotype-kontroll.
Lokalisering av MS17-57 mål på kreftceller
MS17-57 bundet til alle fire GC-cellelinjer som benyttes for immunisering, selv om bindingen signaler som ikke var av lik intensitet (figur 4A). Uttrykket nivået av MS17-57 målet var høyest i MKN45 celler og lavest i SGC7901 celler. I likhet med de kontra screening resultater, gjorde MS17-57 mAb ikke binde seg til menneske PBMC. Det ble bundet til noen andre typer GC-celler (figur 4B), men ikke til GI-celler (Figur 4C). Således er målet (e) av MS17-57 ikke universelt uttrykt, selv om de synes å være mer vanlig i GC-celler enn GI-celler.
A.MS17-57 bundet til alle fire GC-cellelinjer som var brukes for live celle immunisering. B. MS17-57 utstilt sterke bindende signaler i GES-en og AGS celler, men ikke et juridisk bindende signal i menneskelige PBMC. C. MS17-57 ikke binde seg til menneske PBMC eller noen av de fem GI tumorceller. Irrelevant mAb ble anvendt som mAb isotypekontroll.
Ferske tumorvev og tilstøtende noncancerous vev fra seks GC pasienter ble farget for MS17-57 og isotypekontrollantistoff mAb og deretter kvantifisert med doseavhengig binding i FACS-HTS. Totalt sett er bindende signal fra MS17-57 var sterkere i tumorvev enn i noncancerous vev (
P
0,03) (Tabell 1 og figur 5). Dette eksperimentet viste at MS17-57 kan binde seg til sine mål i sin opprinnelige form på overflaten av ferske tumorprøver.
GC Pasient
Tissue
mAb
MFI
% Stained Peak
trekkes MFI
2
Normalisert MFI
3
Pasient-1TumorIsotype Ctrl6.150.5113.0611.56MS17-5719.2118.23NormalIsotype Ctrl11.620.3215.898.76MS17-5727.5111.58Patient-2TumorIsotype Ctrl10.962.836.155.78MS17- 5717.1111.94NormalIsotype Ctrl28.3110.48-12.592.06MS17-5715.728.26Patient-3 * TumorIsotype Ctrl —- MS17-57 – NormalIsotype Ctrl —- MS17-57 – pasient~~POS=TRUNC 4TumorIsotype Ctrl3.760.18.2711.83MS17-5712.0313 NormalIsotype Ctrl4.90.861.294.67MS17-576.193.82Patient-5TumorIsotype Ctrl8.583.2-0.53.48MS17-578.084.02NormalIsotype Ctrl9.515.32-4.651.89MS17-574.861.08Patient-6TumorIsotype Ctrl7.95.488.317.59MS17-5716.217.63NormalIsotype Ctrl10.3310.213 pylori
.
