Abstract
Pankreas ductal adenokarsinomer inneholde en delmengde av utelukkende tumorigene kreft stamceller (cscs), som er i stand til repopulating hele heterogen kreftcellepopulasjoner og er meget motstandsdyktig mot standard kjemoterapi. Her viser vi at metformin selektivt ablated bukspyttkjertelen cscs som dokumentert av redusert uttrykk for pluripotency-assosiert gener og CSC-tilknyttede overflatemarkører. Deretter evne metformin behandlet cscs å clonally utvide
in vitro
ble irreversibelt opphevet ved å indusere apoptose. I kontrast, ikke-cscs fortrinnsvis svarte med cellesyklus arrest, men ble ikke elimineres ved metformin behandling. Mekanistisk, metformin økt reaktive oksygenarter produksjon i CSC og redusert mitokondrie transmembrane potensial. Den påfølgende induksjon av dødelige energikrise i cscs var uavhengig av AMPK /mTOR. Til slutt, i primær kreft vev xenograft modeller metformin effektivt redusert tumorbelastning og hindret utvikling av sykdommen; hvis det kombineres med en stroma målretting glattet inhibitor for forbedret vev penetrasjon, mens gemcitabin faktisk dukket unnværlig
Citation. Lonardo E, Cioffi M, Sancho P, Sanchez-Ripoll Y, Trabulo SM, Dorado J et al . (2013) Metformin Målsettinger det metabolske Achilles Heel of Human kreft i bukspyttkjertelen stamceller. PLoS ONE 8 (10): e76518. doi: 10,1371 /journal.pone.0076518
Redaktør: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, USA
mottatt: 3 mai 2013; Godkjent: 01.09.2013; Publisert: 18 oktober 2013
Copyright: © 2013 Lonardo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen ble støttet av ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233 460), europeiske fellesskap syvende rammeprogram (FP7 /2007-2013) under tilskuddsavtalen n ° 256974, den Subdirección General de Evaluación y Fomento de la INVESTIGACION, Fondo de INVESTIGACION Sanitaria ( PS09 /02 129), og Programa Nacional de Internacionalización de la i + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105, både Ministerio de Ciencia e Innovación, Spania). E.L. støttes av Roche postdoktorstipend Program. M.C. støttes av La Caixa Predoctoral Fellowship Program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er fortsatt en av de mest ødeleggende kreft, og er den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i industrilandene med en 5-års overlevelse på mindre enn 5% [1]. Mange risikofaktorer inkludert røyking, alkoholforbruk, og kronisk pankreatitt har blitt anerkjent som potensielle risikofaktorer for utvikling av PDAC [2]. Epidemiologiske studier antyder også at diabetes mellitus, spesielt type 2, er assosiert med øket risiko for PDAC [3], [4]. Derfor har etterforskerne la ut på å finne en antatt sammenheng mellom bruk av antidiabetiske legemidler og redusert risiko for å utvikle og /eller progresjon av PDAC. Påfallende, i en retrospektiv analyse, ble oral administrasjon av metformin hos pasienter med diabetes mellitus type II funnet å være assosiert med redusert risiko for å utvikle PDAC [5] samt bedre utfall hos pasienter med etablert PDAC [6].
Den primære systemisk effekt av metformin (Met) representerer en nedgang i blodsukkernivået via redusert hepatisk glukoneogenese og økt glukoseopptak i perifere vev [7]. Mekanistisk aktiverer metformin indirekte AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) signal [8] og inhiberer deretter mTOR-aktivitet, som ofte økes i kreftceller [9], inkludert kreft i bukspyttkjertelen stamceller (cscs) som et sterkt tumorigen subpopulasjon [10]. Denne inhiberende virkning av metformin på AMPK /mTOR signalering resulterer i redusert proteinsyntese og celleproliferasjon [11], [12]. Videre, i etablerte cellelinjer PDAC metformin er også i stand til å inhibere PDAC [13]. Forbløffende nok en annen fersk undersøkelse antydet at cscs kan bli målrettet av metformin via re-uttrykk for miRNAs innblandet i differensiering, selv om disse dataene er basert på ikke-validert kreftcellelinje-avledet cscs [14].
I motsetning til flertallet av differensierte celler i tumoren, er cscs vist seg å være meget motstandsdyktige overfor kjemoterapi [15]. Derfor kan medikamenter som selektivt er målrettet mot cscs representerer en mer effektiv metode for å overvinne motstanden og /eller behandling tilbakefall i PDAC. Her tilbyr vi nå overbevisende bevis for at cscs avledet fra et mangfoldig sett av primære humane PDACs er svært sårbare for metabolsk omprogrammering av metformin som resulterer i langsiktig overlevelse av prekliniske musemodeller.
Resultater
Vi har tidligere vist at primær bukspyttkjertelen cscs kan anrikes
in vitro
som forankringsuavhengig tredimensjonale kuler, som er anriket for celler med stamcelle-lignende egenskaper [15]. Et totalt antall av ni humane PDAC xenotransplantater ble anvendt med A6L, 163, 185, 215, 247, 253, og 286 som tidligere beskrevet [16], [17], så vel som 354 og JH029, som ble oppnådd ved bruk av samme metode. Viktigere for
in vitro
eksperimenter alle celler ble nylig isolert fra tidlig passasje xenografter og dyrket i lave passasjer som heftende celler eller forankringsuavhengig kuler. Spheres er beriket i CD133
+ celler (fig. S1 A) og flere andre markører som har vært forbundet med en CSC fenotype sammenlignet med heftende celler [18].
Metformin reduserer uttrykk for cscs markører
Først etablerte vi et uttrykk for den organiske kation transporter 1, 2 og 3 (OCT1-3) i våre primære PDAC celler (fig. 1A), som er avgjørende for cellulært opptak av metformin. Metformin ble anvendt i konsentrasjoner som ikke er direkte giftig for primær PDAC celler og ikke-transform pankreatiske celler (PSC, pankreatiske stel celler; HDPE, human ductal pankreas epitelceller) (figur 1B.), Som er betydelig lavere sammenlignet med konsentrasjonene som benyttes i tidligere studier med PDAC cellelinjer (10-30 mM) [14]. Deretter fant vi betydelige endringer i mRNA nivåer av cscs gener (CD133, Alk4, nodal, activin og Smad2) og pluripotency-assosiert gener (Nanog, OCT4 og Sox2) etter behandling med metformin (figur 1C;. Benyttet primere er oppført i tabell S1), som også ble bekreftet ved proteinnivå (fig. 1D). Påfallende, metformin ut til fortrinnsvis eliminere cscs som CSC-markør positive celler CD133, CD44, CXCR4 og SSEA-en falt, mens epitelial differensiering maker EpCAM økt (Fig. 1E).
(A) Primære PDAC celler , men ikke normale celler uttrykker bukspyttkjertel organisk kation transportør 1, 2 og 3 (n = 3). (B) Definisjon av det terapeutiske området for metformin i grunnskolen PDAC celler. Antall celler dyrket i nærvær av de angitte konsentrasjoner av metformin i 24 timer (n = 6). (C) qPCR-analyse av cscs-assosierte gener i kuler som ble behandlet med 3 mM av metformin i 7 dager. Dataene er normalisert til husholdningsgenet og presenteres som ganger endring i genuttrykk i forhold til kontrollceller (n = 6). (D) Representative Western blot som illustrerer redusert Oct4 protein ekspresjon i respons til metformin behandling (n = 3). (E) Representant flowcytometri analyse for cscs markører i sfærer som ble behandlet i 7 dager med 3 mM av metformin sammenlignet med ubehandlede sfærer (øvre panel). Oppsummering av data for PDAC-185, A6L, 215, 253, og 354 er vist (nedre panel; n = 6)
Metformin selektivt minsker in vitro og in vivo tumorigenicity
Vi neste undersøkte funksjonelle effekter av metformin på selvfornyelse kapasitet på cscs. Kulen-analysen viste en sterk nedgang i størrelsen på dannede kuler av metformin (figur 2A P 100 ng /ml), og retning aktivering av AMPK (A769662; 10 pM) på sfære formasjon og (n = 6). (D) kolonidannelse for PDAC-215, 253, og 354-celler (n = 3). (E) Total og mitokondrielle (Mito) ROS produksjon etter 8 timer med kontroll eller metformin behandling. (F) Mitokondrie transmembrane potensial etter 8 timer med kontroll eller metformin behandling.
Deretter hypotese vi at er særlig følsomme cscs til metformin kan tilskrives anti-oksiderende egenskaper til metformin [19]. Faktisk, metformin behandling betydelig økt mitokondriell produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) i cscs avledet fra alle de benyttede tumorer, men disse endringene var mer uttalt i hurtig respondere (PDAC-253 og 354) i forhold til de tungrodde respondere PDAC-215 og 286 (der metformin effektene er ikke synlig i første generasjon sfære dannelse) (fig 4E.). Interessant nok var konsistente data oppnådd for den mitokondrielle transmembranpotensialet, noe som var mest fremtredende redusert i hurtig respondere (fig. 4F). Bruke mitokondrie sonde TMRE, viser vi at i disse svulstene metformin redusert sitt mitokondrielle transmembrane potensial (brukes som en generell markør for mitokondrietoksisitet og induksjon av apoptose), mens den forble uendret eller bare litt redusert i tungrodde respondere. Denne direkte virkning på mitokondrier, kan også forklare den forskjellig sensitivitet mellom ikke-cscs og cscs som det sistnevnte synes å være mer avhengig av deres mitokondrier for generering av energi, mens ikke-cscs hovedsak avhengig mitokondrier-uavhengige kilder slik som aerob glykolyse (Warburg effekt) [20]. I tillegg er også bekreftet vi at effekten av metformin på mitokondrier var uavhengig av AMPK /mTOR som verken direkte AMP aktivatoren A769662 og heller ikke mTOR-inhibitor rapamycin var i stand til å etterligne virkningene av metformin (fig. S4A /B).
metformin boder PDAC progresjon in vivo
Først studerte vi effekten av metformin
in vivo
ved hjelp av en kort 7-dagers metformin behandling av PDAC-185. Under den etterfølgende oppfølging av 40 dager ble det observert en signifikant reduksjon i tumorvekst og en fullstendig remisjon i tre ut 8 tumorer for metformin behandlede mus-i motsetning til ingen remisjon i (fig. S5) kontrollgruppen. Konsistente data ble oppnådd for andre PDACs med metformin monoterapi være svært effektive i å indusere sykdom regresjon (fig. 5A-F). Flere viktige observasjoner ble gjort under disse studiene. Først ble ingen brutto toksisitet observert under langvarig metforminbehandling som kroppsvekt forble uendret (fig. 5A, panel til høyre). Dernest svulster sakte, men regelmessig tilbakefall etter seponering av metformin på dag 100 (fig. 5A, venstre panel). For det tredje, mens tillegg av gemcitabin
in vitro
viste en additiv effekt på CSC befolkningen (Fig. 5C), ingen additiv effekt kunne noteres
in vivo
for metformin pluss gemcitabin (Fig. 5D)
(A)
Venstre panel
. PDAC-215 vev ble implantert og behandling ble tildelt etter første tumor take ble bekreftet. Mus ble behandlet med enten gemcitabin (Gem) eller metformin (Met). Metformin opphørte d100 for å teste potensialet av de gjenværende lesjoner for å initiere sykdom tilbakefall. Etter dokumentert sykdom tilbakefall, metformin behandling ble gjen administreres.
Høyre panel
: Kroppsvekt under behandlingen. (B)
Venstre panel
: Histologisk analyse: Hematoxylin Eosin (H E), CyclinD1, og Caspase3.
Høyre panel
: Innhold for CD44 + celler. (C) Effekter av
in vitro
behandling som angitt på sfære formasjon kapasitet. (D) PDAC-A6L vev implantert i mus og behandles som angitt. (E) Innhold for CD44 + celler (
øvre panel
) og sfære dannelse kapasitet (
nedre panel
). (F) Histologisk analyse. H E og cytokeratin19 (CK19; n = 6)
Disse data bedt oss om å hypoteser om at gemcitabin ble ikke riktig levert til PDAC vev [21] og /eller stroma beskyttet cscs fra de skadelige effektene av metformin ved å fremme deres stemness og senere motstand [22]. Derfor har vi lagt den glattes inhibitor Sibi-C1 som et stroma /stel celler-målsøkende middel til kombinasjonen av gemcitabin pluss metformin. Siden vi tidligere har vist at en kombinasjon av gemcitabin pluss glattes inhibitoren ikke hindrer tilbakefall [10] og gemcitabin utgjør i dag standard behandling for PDAC, testet vi bare denne kombinasjonen. I tillegg til å bedre vev levering av gemcitabin, [21] trippelkombinasjonen også resultert i en dobling av vev metformin konsentrasjon (23,1 ± 0,82 versus 10,8 ± 1,9 mg /g). Deretter reproduserbar sykdom regresjon ble observert (Fig. 6A-C), og, enda viktigere, denne kombinasjonen var også effektive i tumorer som tidligere vist seg å være resistente overfor inhibering mTOR (fig. 6D) [23].
( A) PDAC-185 vev implantert i mus og behandlet som angitt herunder glattes inhibitoren Sibi-C1. (B) Innhold for EpCAM + og CD133 + celler, henholdsvis (
øvre panel
) og sfære dannelse kapasitet (
nedre panel
). (C) Histologisk analyse: Hematoxylin E) og cytokeratin19 (CK19). (D) mTOR-hemmer motstandsdyktig PDAC-253 vev implantert i mus og behandles som angitt (n = 6).
Diskusjoner
Her viser vi at de heterogene populasjoner av kreftceller skjult i primære humane PDAC vev ulik reaksjon på metformin avhengig av graden av stemness. Mens mesteparten av mer differensierte kreftceller reagerte på behandling med metformin med cellesyklus arrest, en undergruppe av celler med forskjellige stemness funksjoner, nemlig cscs faktisk gjennomgikk rask apoptotisk død på grunn av energikrise. Selv den mest åpenbare effekten for metformin behandling i primær sfærer var en markert reduksjon i sfæren størrelse i samsvar med en redusert spredning rate av de mer differensierte celler næret i disse sfærene, følgende serieaging av kulene tydelig avslørt sin nesten komplett og irreversibelt tap av klonogene forplantning evne, til tross for det faktum at metformin behandling ble stoppet allerede etter første passering. Disse dataene viser at metformin nesten oppbrukt CSC brøkdel, men er også i tråd med forestillingen om at ikke-CSC ikke etterfylle bukspyttkjertelen CSC bassenget etter avslutning av metformin behandling. Konsekvent, transplantasjon av forbehandlet celler i immunsupprimerte mus viste at tumorigenitet av cellene ble faktisk drastisk redusert etter kort tids eksponering for metformin. Viktigst er imidlertid
in vivo
behandling av etablerte primære humane kreftformer sterkt svart på metformin med sykdom regresjon og påfølgende stabilisering av sykdommen.
Den identifiserte Mekanismen for metformin i cscs har vært stort sett ukjent . De fleste undersøkelser i bulk kreftceller støtte en forenklet arbeidsmodell der metformin utøver anti-tumoreffekter ved indirekte å aktivere AMPK fulgt av påfølgende undertrykkelsen av mTOR [8]. Direkte rettet mot mTOR med rapalogs har også vært ansett som et mål for kreft narkotika utvikling. Selv om dette var effektivt hos pasienter med flere typer kreft [24], prekliniske studier i PDAC ikke foreslå en spesiell høy svarprosent (23%) [23]. Viktigere, en av de ufølsomme svulster i denne studien var PDAC-215, som vi var i stand til å også teste i denne studien bruker metformin. Cscs avledet fra denne svulsten viste en robust hemming av sekundær sfære formasjon
in vitro Hotell og effektiv tumor regresjon
in vivo
. På den annen side, gjorde direkte aktivering av mTOR av A769662 eller hemming av mTOR av rapamycin ikke etterligne de sterke effekter som vi oppnådde med metformin som tyder på at behandlingseffekter av metformin i bukspyttkjertelen cscs er uavhengig av endringer av AMPK /mTOR aksen.
Menneskelige PDAC celler er kjent for sin iboende toleranse for ernæring sult, noe som gjør dem i stand til å overleve under en hypovascular (austerity) svulstens mikromiljø. Det er en ny paradigme som normale stamceller er preget av dominerende aerob glykolyse og undertrykt mitokondriell oksidasjon med etterfølgende lavere mitokondrie ATP produksjon og ROS meldingen [25]. Våre data er i tråd med forestillingen om at bukspyttkjertelen cscs faktisk bærer et høyt mitokondrie-avhengige metabolske profilen, som er i slående kontrast til normale stamceller, men også skiller dem fra bulkkreftceller. Det har tidligere vært vist at metformin langsomt akkumuleres 1000 gangers i mitochondria og direkte inhiberer kompleks 1 (NADH dehydrogenase), som translocates fire protoner fra den mitokondrielle matriks til intermembrane plass, og dermed produsere en proton-gradient. Elektrontransportkjeden og oksidativ fosforylering er koplet etter denne proton gradient over den indre mitokondrie-membran, og deres hemming synes å være spesielt dødelig for cscs [26]. Derfor stoffer som metformin som retter seg mot oksidativt mitokondrie metabolisme representerer kraftige terapeutiske verktøy for å angripe CSC bassenget.
Evnen til metformin å selektivt eliminere cscs står i sterk kontrast til effekten av gemcitabin, et kjemoterapeutisk stoff som dreper bulk kreftceller, men ikke kreftstamceller [15]. Basert på sine distinkte egenskaper, bør metformin synergize med gemcitabin å redusere både ikke-cscs og cscs i blandet befolkning. Ja, det ble nylig vist i fire genetisk forskjellige typer brystkreft cellelinjer som metformin selektivt dreper cscs og at kombinasjonen av metformin og standard kjemoterapeutiske middel doxorubicin drept både cscs og ikke-cscs
in vitro
som samt redusert tumormasse og langvarig remisjon mer effektivt
in vivo
enn enten stoffet alene [27]. Mens vi kunne bekrefte denne hypotesen for PDAC
in vitro
, vår
in vivo
behandlingsstudier tyder på at gemcitabin er faktisk unnværlig så lenge metformin fortsatte gjennom hele studien. Selv om disse data absolutt berettige ytterligere bekreftelse det synes rimelig å spekulere i at metformin monoterapi kunne representere en ny behandling for pasienter som er for skjøre til å tolerere bivirkninger av det kjemoterapeutiske midlet gemcitabin [28].
imidlertid uheldigvis , alle testede svulster slutt kommet etter metforminbehandling. Det gjenstår å fastslå om cscs utsatt for langvarig metforminbehandling bytte sin metabolsk fenotype gjør dem motstandsdyktige mot metformin er effekter på mitokondriene (ervervet resistens) eller om en forhåndsdefinert undergruppe cscs er faktisk motstandsdyktig mot metformin og til slutt blir den dominerende klone (arvet motstand). Dette problemet bør tas opp i fremtidige studier ved å sammenligne cscs isolert fra svulster som tilbakedannede henhold metformin behandling og cscs isolert fra svulster som til slutt progrediert under samme vilkår. Omfattende karakterisering av resistente kloner bør gi viktige innsikter om hvorvidt dette er faktisk forebygges eller andre linje behandling kan tilbys.
Viktigere, vises imidlertid i tillegg en stroma målretting glattet inhibitor obligatorisk for å oppnå sterkere og lengre varige svarprosenter. Den mest sannsynlige forklaringen kan være to fold. En medvirkende årsak til svikt i systemisk behandling kan være rikelig svulst stromal innhold som er karakteristisk for PDAC. Stroma utgjør størstedelen av tumormassen, og består av en dynamisk utvalg av ekstracellulære matriks-komponenter og ikke-neoplastiske celler, inkludert fibroblastiske, vaskulær, og immunceller. Nyere arbeider har vist at stroma støtter cscs, [18], [22], [29] fremmer invasivitet og metastase så vel som samtidig tjener som en fysisk barriere for legemiddelavlevering [21]. Derfor pinnsvin reaksjonsvei hemming, i tillegg til å gi bedre tilgang for systemisk administrert medikament, kan også oppheve CSC nisje som gjør dem mer utsatt for virkninger av behandlingen av metformin og /eller gemcitabin. Fremtidige mer omfattende studier må vise om utvikling av resistens kan effektivt forebygges ved denne behandlingsstrategi.
Det kan argumenteres for at metformin konsentrasjoner som brukes i våre
in vitro
studier, riktignok allerede betydelig lavere enn de som brukes i tidligere studier, er fortsatt ikke mulig
in vivo Hotell og derfor irrelevant fra et mekanistisk synspunkt. Det er imidlertid viktig å merke seg at metformin akkumuleres i vevene og spesielt i mitokondriene i konsentrasjoner flere ganger høyere enn de som ble målt i blod [26]. Dette gjelder særlig for celler som er utstyrt med de respektive transportører relevante for metformin opptak, nemlig OCT1-3. Som vi viser her, PDAC celler uttrykker alle tre isoformer, men viser spesielt høy uttrykk for Oct1. Selv om det er vanskelig å vurdere den sanne intracellulære metformin konsentrasjoner i PDAC celler på grunn av den massive stroma innhold og nekrotiske områder i høstet svulster, vår analyse av metformin konsentrasjon avslørt høyere metformin konsentrasjoner i PDAC vev (10,8 mg /g vev) enn i leveren (8,9 mg /g), og enda mer hvis metformin ble administrert i kombinasjon med glattes inhibitor Sibi-C1 (23,1 mg /g). Derfor vår mekanistisk
in vitro
studiene er faktisk svært relevant for
in vivo
setting.
Metformin bærer en eksepsjonell sikkerhetsprofil som bare hepatocytter, men ikke andre ikke- transform (stilk) celler uttrykker oktober for effektiv cellulært opptak av metformin. Flere kliniske studier (NCT01210911, NCT01167738, og NCT01488552) tester for tiden metformin i lokalavansert og metastatisk PDAC. Dette vil forhåpentligvis gi en endelig vurdering av klinisk effekt av metformin i PDAC. Det ville være av særlig interesse om pasienter vil også til slutt fremgang i løpet av metformin behandling, og om dette kan bli vurdert og /eller spådd av analyse av sirkulerende kreft (stilk) celler. Deres potensielle isolering under tilbakefall kan gi viktige mekanistiske innsikt i årsaken til tilbakefall.
Materialer og metoder
tumorprøver
Etter skriftlig informert samtykke var innhentet fra pasienter, skytende vev fra resected bukspyttkjertelen karsinom var xenopodet ved Johns Hopkins Medical Institutions (Etikk styregodkjennelse: JHMIRB: 05-04-14-02 «en mulighetsstudie for individuell behandling av pasienter med avansert kreft i bukspyttkjertelen») og Hospital de Madrid – Centro Integral Oncológico Clara Campal (FHM.06.10 «Etablering av bank for svulster og friskt vev hos pasienter med kreft»), henholdsvis under de angitte Institutional Review Board-godkjente protokoller [30]. Kort, overskytende tumorvev ikke trengs for klinisk diagnose under rutine Whipple resections utført av kirurger som ikke var involvert i denne studien ble senere implantert i immunkompromitterte mus. All informasjon om pasienten ble gjort anonym ved fjerning av en hvilken som helst informasjon som identifiserer, eller kan føre til identifikasjon av pasienten. Ingen av pasientene hadde gjennomgått neoadjuvant stråling eller cellegift før reseksjon av svulsten.
Primære humane PDAC celler
For in vitro studier, ble vev fragmenter hakket, enzymatisk fordøyd med kollagenase (Stem Cell Technologies, Vancouver, British Colombia) i 90 min ved 37 ° C [10] og etter sentrifugering i 5 min ved 1200 rpm pelletene ble resuspendert og dyrket i RPMI, 10% FBS og 50units /ml penicillin /streptomycin. For noen eksperimenter, ble den humane cellelinje PDAC L3.6pl anvendt som tidligere beskrevet [15].
Cancer stamcelle-berikende dyrknings
PDAC sfærer ble samlet og ekspandert i DMEM-F12 ( Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) supplert med B-27 (Gibco, Karlsruhe, Tyskland) og bFGF (Peprotech EC, London, Storbritannia). 10
3 celler /ml ble sådd i ultra-lave festeplater (Corning BV, Schiphol-Rijk, Nederland) som tidligere beskrevet [31] Etter 7 dager med inkubasjon, kuler var vanligvis . 75 mikrometer store med ~ 97% CD133high. For serieaging, ble syv dager gamle kuler høstet ved hjelp av 40 mikrometer celle siler, dissosiert til enkeltceller med trypsin, og deretter re-vokst for 7 dager.
