Abstract
histondeacetylase inhibitorer (HDACIs) har potent anti-cancer-aktivitet i en rekke cancermodeller. Forstå de molekylære mekanismene som er involvert i den terapeutiske responsen HDACI er nødvendig før klinisk anvendelse. Denne studien hadde som mål å finne ut om en potent HDACI, LBH589 (Panobinostat), hadde differensial terapeutisk respons mot LNCaP og PC-tre prostatakreft (PCA) celler. Den tidligere viste prometafase arrest med påfølgende apoptose på LBH589 behandling, mens sistnevnte var mindre følsom og hadde sen G2 arrest. Den LBH589 behandling nedregulert HDAC6 og vedvarende ERK-aktivering, og bidro til prometafase arrest. Mekanistisk, LBH589 hemmet HDAC6 aktivitet, forårsaket sin dissosiasjon fra protein fosfatase PP1α, og økt 14-3-3ζ acetylering. Acetylert 14-3-3ζ lansert sin maske effekt på serin 259 av c-Raf og serin 216 av Cdc25C påfølgende til de-fosforylering av PP1α, noe som bidro til ERK-aktivering. Forbedret ERK aktivitet ved LBH589 videre nedregulert HDAC6 protein nivåer og vedvarende ERK-aktivering av gratis-forward regulering. Den vedvarende Cdc25C og ERK-aktivering resulterte i tidlig M-fase (prometafase) arrestasjon og påfølgende apoptose i de mest følsomme LNCaP celler, men ikke i PC-3 celler. Denne studien gir pre-kliniske bevis på at HDAC6 kan tjene som en sensitiv terapeutisk mål i behandling av prostatakreft med HDACI LBH589 for klinisk oversettelse. Denne studien tar for gitt også en ny mekanisme for HDAC6 deltakelse i regulering av c-Raf-PP1-ERK signalveien og bidra til M fase cellesyklus overgang
Citation. Chuang MJ, Wu ST, Tang SH, Lai XM, Lai HC, Hsu KH, et al. (2013) The HDAC hemmer LBH589 induserer ERK-Dependent prometafase Arrest i Prostate Cancer via HDAC6 Inaktive og nedregulering. PLoS ONE 8 (9): e73401. doi: 10,1371 /journal.pone.0073401
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 20 februar 2013; Godkjent: 19 juli 2013; Publisert: 04.09.2013
Copyright: © 2013 Chuang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Council (97-2314-B-016-023-My3 og 99-2628-B-016-012-My3) og fra Tri-service General Hospital Research Foundation (TSGH-C101-009 -S02, TSGH-C100-128 og TSGH-C99-012-13-S03), Taiwan, ROC. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den raske utviklingen av HDAC hemmere (HDACI) som kreftbehandling har blitt inderlig brukt i mer enn 80 kliniske studier [1]. Forstå de detaljerte molekylære mekanismene for hvordan HDACI formidler anti-kreft aktivitet er nødvendig for å kunne legge til rette for klinisk oversettelse. Det undertrykker kreft celle overlevelse gjennom ulike mekanismer, inkludert blokkering angiogenese, hemme intracellulære stressrespons veier, økt generering av reaktive oksygenforbindelser, og påvirke endoplasmatiske retikulum stressrespons på grunn av svekket håndtering av mis-foldede proteiner [2-4]. Blant disse anti-kreft-aktivitet, bevirker HDACI-mediert G1 cellesyklus-stans en økning i ekspresjon av genet p21 tumor suppressor i en transkripsjonsavhengig måte [5]. Det har også vist seg at HDACI induserer G2 /M-cellesyklus-stans ved en transkripsjons uavhengig vei via nedregulering av Aurora A- og B-kinaser [6-8]. I tillegg utløser HDACI en G2 checkpoint fase respons i normale humane celler, og at dette sjekkpunkt responsen er defekt i en rekke tumorceller [9]. Derfor, rettet mot inhibering av G2 /M cellesyklusprogresjon er en mer fordelaktig strategi for å spesifikt undertrykke veksten av kreftceller uten å inhibere normale celler.
Induksjon av mitose av cellesyklusen er strengt regulert av aktivering og koordinert inaktivering av flere protein kinaser og fosfataser. Ved starten av mitose, er Cdc25C (en dobbel fosfatase) aktiverings et kritisk trinn for aktivering av Cdc2 /cyclin B-komplekset. Den inhibitoriske rest av Ser216 på Cdc25C må defosforylert ved PP1 for å aktivere Cdc25C [10,11]. Den fulle aktivitet av Cdc25C reguleres av ERK på mitogen stimulering i løpet av G2 /M overgang i pattedyrceller [12]. ERK tilhører MAPK kaskade, og dets aktivitet er kontrollert av oppstrøms-Raf /MEK signalering. I hvilende celler, 14-3-3 binder seg til c-Raf via S259 og S621 fosforylering og vedlikeholder c-Raf inaktive [13,14]. Når cellene inn i mitose, er det PP1 eller PP2A mediert defosforylering av S259 en forutsetning for fosforyleringen av S338 på c-Raf og ytterligere triggere c-Raf og ERK-aktivering [15,16].
Spesielt, PP1 og ERK aktiviteter~~POS=HEADCOMP er avgjørende for Cdc25C aktivering ved starten av mitose, etterfulgt av avtagende ERK-aktivitet i løpet av M faseovergang [12,17]. PP1 kan direkte binde til den katalytiske subenheten til C-terminalen i HDAC6. Samspillet mellom HDAC6 og PP1 kan bli forstyrret ved å hemme aktiviteten av enten HDAC6 eller PP1 [18]. HDAC6 er den viktigste deacetylase som er ansvarlig for deacetylering av α-tubulin og varmesjokkprotein 90 (HSP90) [19]. Men om HDAC6 bidrar til regulering av G2 /M cellesyklus overgangen er fortsatt uklart.
LBH589 (Panobinostat), en HDACI, utstillinger minst ti ganger mer potent hemmende aktivitet mot alle klasse I, II, og IV HDACs sammenlignet med Saha (vorinostat) [20]. LBH589 innehar potent vekst-inhiberende effekter på forskjellige typer kreftceller, men med varierende terapeutisk virkning, noe som kan representere potensielle motstand av visse krefttyper og hindre den kliniske av LBH589. Selv LBH589 induserer G2 /M cellesyklus arrest gjennom nedbrytning av både Aurora A- og B-kinaser [6,7], de detaljerte molekylære mekanismene som er involvert, så vel som potensielle HDACs målrettet av LBH589 fortsatt ikke fastslått.
Den nåværende studien preget to forskjellige typer av G2 /M cellesyklus arrest formidlet av LBH589 i prostatakreftceller. LBH589 ikke bare hemmet HDAC6 og forbedret 14-3-3ζ acetylering, men også utarmet HDAC6 å utløse dissosiasjon av PP1α fra HDAC6. LBH589 deretter blandet i reguleringen av c-Raf-ERK signalveien, noe som bidrar til M fasecellesyklus overgang. I konklusjonen, antyder denne studien at HDAC6 kan være en følsom terapeutisk mål i behandling av prostatakreft ved hjelp LBH589 for klinisk oversettelse i fremtiden.
Resultater
LBH589 indusert G2 /M cellesyklus arrest og veksthemming i prostatakreftceller gjennom forskjellige mekanismer
Som et første forsøk på å undersøke cytotoksiske effekten av LBH589, fire prostata kreft cellelinjer, LNCaP, PC-3, DU-145 og 22Rv1, ble behandlet med ulike konsentrasjoner av LBH589 og cellenes levedyktighet ble målt ved MTT-analyse. Generelt viste LBH589 potent vekstinhibering virkning på hver kreftcellelinje i en dose- og tidsavhengig måte. Blant de cellelinjer, LNCaP og PC-3 var den mest følsomme og resistente mot LBH589 behandling, henholdsvis (figur 1A). Gransker cellesyklus profiler påfølgende til LBH589 eksponering, gjorde LBH589 behandling ikke føre til G2-M, men ikke G1, vekst arrest i fire prostata kreft cellelinjer i 24 timer (Figur 1b). LBH589-indusert G2-M vekst arrestasjonen var mest fremtredende i PC-3 og LNCaP. Selv LBH589 induserte en tilsvarende grad av G2-M arrest i LNCaP og PC-3 celler, signifikant forskjell på apoptose mellom disse to cellelinjene ved lengre tids LBH589 eksponering (figur 1C) foreslo at de underliggende mekanismene som er involvert kan være forskjellig.
(A) LBH589 hadde en doseavhengig effekt på veksthemmingen på prostatacancercellelinjer. Cellelinjene ble behandlet med 50, 75, 100, og 150 nM av LBH589. Celleoverlevelse ble målt ved anvendelse av MTT-analysen som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Grafer sammenlignet andelen av veksthemming til kjøretøy kontroll på 24 (øverst) og 48 (lavere) timer. (B) LBH589 indusert G2 /M cellesyklus arrest. Alle cellelinjer ble behandlet med LBH589 eller bærerkontroll i 24 timer. Celle sykluser ble analysert ved PI-farging og flowcytometri i henhold til DNA-innhold. Den økte prosentandeler av G2 /M-celler ble sammenlignet med bærerkontroll. (C) LBH589 indusert apoptose i PC-3 og LNCaP-celler. Begge cellelinjer ble behandlet med 75nM LBH589 eller bærerkontroll for 24 (øvre) og 48 (nedre) h. Prosentandelene av apoptotiske celler ble analysert ved å telle populasjon av DNA-fragmentering ved strømningscytometri. (D-E) HDACIs indusert Aurora-kinase degradering funnet i PC-3, men ikke i LNCaP. PC-3 og LNCaP-celler ble behandlet med forskjellige HDACIs ved indikerte konsentrasjoner av LBH589, Saha og SBHA i 24 timer og cellelysatene ble analysert ved Western-blotting ved å bruke de angitte antistoffer. (F) Profil av proteiner av progresjon av G2 /M cellesyklusen. Cellene ble behandlet med forskjellige doser av LBH589 i 24 timer. Lysatet ble analysert ved Western blotting.
En tidligere studie har vist LBH589-mediert G2 /M cellesyklus arrest via nedregulering av Aurora A og B kinase i nyrecellekreft [6]. LBH589 behandling økte de samme nivåer av histon H3-acetylering i både LNCaP og PC-3-celler, noe som indikerer at LBH589 var funksjonelt i begge prostatacancercellelinjer. Imidlertid, nedregulering av Aurora A- og B-kinaser ved LBH589 ble bare observert i PC-3-celler, men ikke i LNCaP-celler (figur 1D). For å undersøke hvorvidt andre hydroksaminsyrederivater hadde lignende effekt på LNCaP og PC-3-celler, to andre HDACIs, Saha og SBHA, ble testet og viste at nedregulering av Aurora A- og B-kinaser bare forekom i PC-3-celler men ikke i LNCaP (figur 1E). For ytterligere å løse uoverensstemmelsen mellom LNCaP og PC-3 celler under LBH589 behandling, ble to G2-M overgangs molekyler Cdc2 og Cdc25C forhold. LBH589 redusert Cdc25C og fosforylerte Cdc2 nivåer i PC-3-celler, men ikke i LNCaP-celler. LBH589 også induserte et band skift mønster av Cdc25C i LNCaP celler i en dose- og tidsavhengig måte (figur 1F).
LBH589 indusert ERK aktivisering og Cdc25C hyper-fosforylering
De molekylære mekanismene som er involvert i de forskjellige LBH589-medierte effekter mellom de to PCA-celler ble undersøkt. De signalbaner som er involvert i celle-proliferasjon og overlevelse, herunder Akt og p38, viste ingen signifikant forskjell mellom LNCaP og PC-3-PCa-celler (figur 2A). Interessant, LBH589 behandling resulterte i økt ERK-fosforylering bare i LNCaP-celler, ikke i PC-3-celler. Nedregulering av den histon H3-serin 10 fosforylering (som en M-fase markør) forekom i PC-3-celler, men ikke i LNCaP-celler (figur 2A).
(A) LBH589 indusert ERK-aktivitet er selektivt aktivert i LNCaP celle. PC-3 og LNCaP-celler ble behandlet med 75nM LBH589 eller bærerkontroll i 24 timer. Nivåene av angitte proteinene ble immuno-strøket mot enkelte antistoffer. GAPDH var en intern lasting kontroll. (B) dose- og tidsavhengige korrelasjoner av LBH589-mediert ERK-aktivering og Cdc25C hyper-fosforylering. LNCaP ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av LBH589 i 24 timer (til venstre) eller 25 nM LBH589 til forskjellige tider (til høyre). (C) Doseavhengig korrelasjon av LBH589-indusert G2 /M arrest. LNCaP ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av LBH589 i 24 timer. Cellesyklus ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. (D) Cdc25C hyper-fosforylering ble bekreftet ved defosforylering assay. LNCaP ble behandlet med 50 nM LBH589 i 24 timer. Lysatene ble inkubert med fosfatase (CIP) eller i kombinasjon med fosfatase-inhibitor. Den hyper-fosforylert og dephosphorylated Cdc25C ble analysert ved immunblotting med Cdc25C antistoff. (E) Cdc25C hyper-fosforylering ble undertrykket ved MEK-inhibitorer. LNCaP ble behandlet med MEK-inhibitorer, PD (100 uM PD98059) eller UO (20 uM UO126) i 30 minutter. LBH589 ble deretter tilsatt til kulturen etter 24 timer. ERK aktivitet og Cdc25C hyper-fosforylering ble analysert ved Pi-ERK og Cdc25C antistoffer i western blotting.
Videre resulterte LBH589 behandling i økt ERK-fosforylering og bandet skiftet av Cdc25C i en dose- og tids avhengig måte i LNCaP-celler (fig. 2B) som korrelerte med økende befolkning av G2 /M fase celle (fig. 2C). For å undersøke hvorvidt båndet forskyvning av Cdc25C representerte hyper fosforylering i henhold LBH589 behandling ble LBH589 behandlet LNCaP-lysat ble behandlet med CIP (fosfatase) alene, eller kombinert behandlet med en fosfatase-inhibitor. Bandet skiftet av Cdc25C indusert av LBH589 ble fjernet av CIP, men ble restaurert av fosfatase inhibitor (figur 2D), noe som indikerer Cdc25C hyper-fosforylering.
Videre undersøker sammenhengen mellom ERK-aktivering og Cdc25C hyper-fosforylering av celler under LBH589 behandling ble Cdc25C hyper-fosforylering indusert ved LBH589 blokkert av MEK-inhibitorer U0126 og PD98059 i LNCaP-celler. Dette indikerte at Cdc25C hyper-fosforylering var en nedstrøms ved LBH589-indusert ERK-aktivering (figur 2E).
LBH589 indusert G2 eller M fase arrest og ERK-aktivering og bidro til prometafase cellesyklus arrest
Ved immuno-fluorescens, fordelingsmønstre Cdc2 og Cdc25C mellom LNCaP og PC-3 celler ble videre undersøkt. LBH589 behandling resulterte i et tap av immuno-fluorescens intensitet av Cdc25C i PC-3-celler, men ikke i LNCaP-celler. Cell morfologi og DAPI nukleær farging representerer LBH589 behandlet PC-3 og LNCaP celler ble arrestert i slutten av G2 og tidlig M fase, henholdsvis (figur 3A, grønn, piler). For å bestemme om LBH589 indusert celle arrestert i G2 eller M-fase, er effekten av LBH589 på sentrosomen separasjon, morfologiske kjennetegn på tidlig mitose, ble undersøkt ved immunofarging med y-tubulin-antistoffer. Utskillelsen av to centrosomes ble kun observert i LBH589 behandlet LNCaP celler (Figur 3B), noe som tyder på at ved LBH589 behandling, ble PC-3 celler arrestert i slutten av G2 fase og LNCaP celler ble arrestert i begynnelsen av M fase (mest sannsynlig prometafase ).
(A-B) Immuno-farging av LNCaP og PC-3. Begge celler ble behandlet 75 nM LBH589 i 24 timer. Immuno-farging (A) med Cdc2 og Cdc25C antistoffer og (B) av γ-tubulin (grønn) og DAPI (blå) i kjøretøykontroll (til venstre) og LBH589 behandling (til høyre) i LNCaP. (C-D) MEK hemmer svekket LBH589-indusert prometafase arrest i LNCaP. Cellene ble forbehandlet 30 med UO126 i 30 minutter og sekvensielt behandlet med LBH589 i 24 timer. (C) Celle sykluser ble analysert ved PI-farging og flowcytometri. (D) De metafase celler ble talt ved DAPI farging presentert som kondensat kromatin.
For å undersøke involvering av ERK-aktivering, LNCaP celler ble behandlet med MEK-inhibitor, U0126, for å hemme ERK aktivitet i tilstedeværelsen av LBH589. Den LBH589-mediert G2 /M rest ble dempet av ERK-inhibering i celler behandlet med UO126 (figur 3C). Videre ERK hemning redusert LBH589-mediert prometafase celler fra 24% til 13% (figur 3D), hvilket antyder at ERK-aktivering spilte en viktig rolle i LBH589-mediert prometafase arrest i LNCaP-celler.
LBH589 nedregulert HDAC6 og vedvarende ERK-aktivering
effektene av LBH589 på HDAC1, HDAC3 og HDAC6 ble sjekket. LBH589 nedregulert HDAC6 i LNCaP men ikke i PC-3-celler (figur 4A). I tillegg LBH589-mediert nedregulering av HDAC6 korrelert med ERK-aktivering i doseavhengig måte, men bare i LNCaP-celler (Figur 4B). For å identifisere hvilke HDAC var ansvarlig for ERK-aktivering, ble de tre proteinene slått ned med siRNA å undersøke ERK-fosforylering status på 293T celler, siden 293T celler hadde høy transfeksjon effektivitet og LBH589 behandling også resultert i prometafase arrest og ERK aktivering av 293T celler (figurene S1, S2, S3). Knock-down av HDAC6, men ikke HDAC1 eller HDAC3, av siRNA betydelig indusert ERK-fosforylering i 293T celler (Figur 4C).
(A) Screening av HDACs involvert i ERK-aktivering. De Immuno-blottings av LBH589 behandlet cellelysater ble utført med angitt antistoffer. (B) LBH589 indusert nedregulering av HDAC6, noe som korrelerte med ERK-aktivering i LNCaP men ikke i PC-3. (C) knockdown av HDAC6 øket i ERK-aktivitet. 293T ble transfektert med siRNA av HDAC1, 3, 6, eller ikke-måls i 72 timer. Lysatene ble analysert ved immuno-blotting. (D) ERK aktivitet var involvert i LBH589-mediert HDAC6 nedregulering. Cellelysater fra celler behandlet med LBH589 eller kombinert med UO126 forbehandling ble immuno-strøket.
LNCaP cellene ble deretter behandlet med LBH589 og MEK-inhibitor, U0126. Hemming av LBH589-indusert ERK-aktivering restaurert HDAC6 protein nivåer (Figur 4D). Videre ERK ble overuttrykt i 293T-celler, noe som resulterte i nedregulering av HDAC6 proteinnivåer i forhold til EGFP-vektor alene (data ikke vist). Disse viste at inhibering av HDAC6 aktivitet ved LBH589 indusert ERK-aktivering, som deretter førte til nedregulering av HDAC6 proteinnivåer. En gjensidig regulering kan derfor eksistere mellom HDAC6 og ERK signalveien.
LBH589 indusert ERK-aktivering gjennom PP1 /c-Raf veien
En tidligere studie viste at HDACI kan øke intracellulære ROS nivåer og aktivere Ras-Raf signalveien [21]. ROS-nivåer av LNCaP og PC-3 celler under LBH589 behandling ble deretter undersøkt. LBH589 behandling indusert prometafase arrest, men ikke signifikant øke intracellulære ROS-nivåer i LNCaP, men induserte et visst nivå i PC-3 celler (figur 5A). LBH589 behandling reduserte også serin fosforylering 259 (hemmende signal) og økte serin fosforylering 338 (aktiveringssignal) av c-Raf, som korrelert med ERK-aktivering i LNCaP men ikke i PC-3-celler (Figur 5B). Disse antydet at LBH589-indusert ERK-aktivering kan medieres via c-Raf aktivering.
(A) Analyse av ROS produksjon. De angitte celler ble behandlet med 75 nM LBH589 i 24 timer. ROS ble målt som beskrevet i Materialer og metoder. (B) Et mønster av c-Raf signalveien på LBH589 behandling. Cellene ble behandlet med LBH589 i 24 timer, og lysatene ble immuno-strøket med de angitte antistoffer. α-catenin var en lasting kontroll.
LBH589 byttet PP1 samspill med 14-3-3ζ og HDAC6
Over-uttrykk for PP1α, men ikke PP2A, forbedret defosforylering av c -Raf Ser259 og fosforylering av Ser338, og deretter ytterligere aktiveres nedstrøms ERK-fosforylering i henhold LBH589 behandling i 293T-celler (data ikke vist). Disse resultatene antydet at LBH589 kan utløse PP1α å aktivere c-Raf av dephosphorylating Ser259 og deretter aktiverer ERK. Fordi begge fosfater av Cdc25C-Ser216 og c-Raf-Ser259 var substrater for PP1, ble effekten av LBH589 på Ser216 fosforylering av Cdc25C videre undersøkt. LBH589 behandling reduserte Ser216 fosforylering av Cdc25C i en dose- og tidsavhengig måte i LNCaP-celler (figur 6A).
(A) LBH589 indusert Cdc25C-S216 defosforylering i en dose- og tidsavhengig måte. LNCaP ble utsatt for 75 nM LBH589 i forskjellige tidsrom eller i det indikerte LBH589 konsentrasjoner i 24 timer. Fosforylering av Cdc25C-S216 ble utført ved immun-blotting med Pi-Cdc25C-S216 antistoff. (B-C) LBH589 behandling byttet PP1α samspill partner. De immuno-utfellinger ble utført med anti-HDAC6 eller anti-14-3-3ζ. De utfelte Prøvene ble analysert ved immunblotting ved hjelp av antistoff mot PP1α, 14-3-3ζ, Lys-Ac (Pan-acetylert lysin). IgG var en uspesifikk pull-down kontroll.
14-3-3 var en chaperon protein for å opprettholde fosforylering status for S216 fra Cdc25C og S259 av c-Raf ved å beskytte dem fra defosforylering av PP1 [ ,,,0],10,22]. Samspillet mellom 14-3-3 ble PP1α, og HDAC6 kontrolleres ved hjelp 14-3-3ζ, PP1α og HDAC6 antistoffer i co-immuno-nedbør analyse. LBH589 behandling økt 14-3-3ζ acetylering og dets interaksjon med PP1α (figur 6B). I motsetning til dette reduserte HDAC6 dets interaksjon med PP1α etter LBH589 behandling (figur 6C). Dette indikerte at HDAC6 kan være ansvarlig for 14-3-3ζ deacetylering å beskytte sine klient proteiner c-Raf og Cdc25C fra defosforylering av PP1α.
Diskusjoner
En tidligere undersøkelse viser at LBH589 behandling årsaker G2 /M cellesyklus arrest via nedbrytning av Aurora kinaser i nyrecellekreft (RCC) [6]. På tilsvarende måte, klargjør den foreliggende undersøkelsen videre at LBH589 induserer en sen fase G2 rest gjennom nedregulering av Aurora-kinaser i PC-3 prostata kreft celler med relativ resistens mot LBH589 behandling. HDACIs utløse en G2 checkpoint i normale celler som vanligvis er defekt i kreftceller, som gir en forklaring på hvorfor normale celler vanligvis er mer motstandsdyktig mot HDACI behandling [9]. De underliggende mekanismene som er involvert i LBH589 mediert G2 fase arrest mellom normale celler og prostata kreft celler kan være forskjellig. Imidlertid Resultatene her medfører at LBH589-induserte G2 rest kan være en fenotype av cancerceller som er mer tolerant overfor LBH589 behandling.
I motsetning til LBH589-mediert G2 faserest fra PC-3-celler, LBH589 induserer prometafase arrest etter at dyp apoptose av LNCaP celler. Selv om de genetiske bakgrunn av prostatakreftcellelinjer er forskjellige, induserer LBH589 behandling ERK-aktivering og HDAC6 nedregulering i 22Rv1 og DU 145 PCa cellelinjer andre enn LNCaP celler (figur S4). Men den prominente prometafase stans bare i PCA celler med lav baseline nivåer av ERK-fosforylering, som kan bærekraftig indusert av LBH589. LBH589 transient induserer ERK-aktivering etter en times behandling, som blir raskt eliminert i løpet av 6 timer etter behandling LBH589 i PC-3 (data ikke vist).
Inhibering av HDAC6 aktivitet ved LBH589 induserer bare forbigående ERK-aktivering og ingen HDAC6 protein nivå endringen er registrert i PC-3 celler. Dette fenomenet er lik forbigående ERK-aktivering indusert av mitogener, såsom EGF i PC-3-celler. Denne studien viser at inhiberingen av HDAC6 ved LBH589 direkte opp-regulerer ERK-aktivering via c-Raf /PP1 veien, noe som ligner på mitogen stimulering, men med en helt motsatt biologisk resultat av cellesyklus-stans i stedet for celleproliferasjon.
ERK-aktivering, noe som svarer til en rekke forskjellige ekstracellulære stimuli som mitogener eller påkjenninger, resulterer i dramatisk forskjellige biologiske konsekvenser som proliferasjon, differensiering, og celledød [23-25]. Konstant ERK-aktivering kan indusere celledød når cellene var under stress [26]. LBH589 induserer vedvarende ERK-aktivering gjennom en gratis frem regulering mellom HDAC6 og ERK i kreftceller, som ikke bare induserer prometafase arrest, men også utløser apoptose. Det er ingen detekterbar ekspresjon endring av HDAC6 mRNA i LNCaP-celler etter LBH589 behandling (data ikke vist). Den proteasominhibitor gjenoppretter HDAC6 proteinnivåer etter LBH589 behandling, hvilket antyder at uttømming av HDAC6 proteiner kan avhenge av en proteasom-mediert nedbrytning reaksjonsvei (data ikke vist). Men hvorfor LBH589 selektivt å nedregulere HDAC6 proteiner og Aurora kinaser A og B i visse kreftcellelinjer er fortsatt uklart.
HDAC6 tilhører klasse IIa subtype av HDAC familier. Det skyttelbussene mellom kjernen og cytoplasma å nå sine biologiske funksjoner. HDAC6 er den viktigste deacetylase som er ansvarlig for deacetylering av α-tubulin og HSP90 å modulere microtubulin avhengig transport, rekruttere mis-foldete proteiner, og transport til aggresomes for nedbrytning [27-29]. Bortsett fra å delta i mange normale cellefunksjoner, kan HDAC6 være nødvendig for effektiv onkogene transformasjon, og kan være involvert i kaskaden av den transformerende vekstfaktor β1 (TGF-β1) -indusert epitelial-mesenkymale overgang [30,31]. Disse indikerer de viktige rollene HDAC6 i onkogene prosesser.
Det har blitt rapportert at akutt myelogen leukemi cellene mangler i HDAC6 er svært motstandsdyktig mot hydroxamat gruppe HDACIs [32]. Således kan HDAC6 tjene som et svinge terapeutisk mål for HDACIs i kreftbehandling. Siden LBH589 er en potent hydroksamat gruppe HDACI med sterk hemmende virkning på HDAC6, har LBH589 fordelen av klinisk anvendelse ved behandling av kreft med HDAC6 uttrykk. Selv om enzymaktiviteten av HDAC6 kan inhiberes ved LBH589 både i LNCaP og PC-3-celler PCA, LBH589 selektivt tømmes enten HDAC6 eller Aurora-kinaser i LNCaP og PC-3 PCA-celler med forskjellige biologiske resultater, respektivt. Denne studien berører det viktige spørsmålet om hvorfor LBH589 selektivt tapper enten HDAC6 eller Aurora kinaser gjennom en proteasome degradering sti i ulike PCA celler. Forstå de molekylære mekanismene bak dette avviket i den terapeutiske responsen LBH589 på ulike PCA celler kan gi mer innsikt for klinisk anvendelse av LBH589.
Resultatene her beviser at LBH589 induserer ERK-aktivering ved å hemme HDAC6 aktivitet i visse celler . ERK-aktivering styres av oppstrøms Ras /Raf /MEK sti [33]. Defosforylering av S259 av c-Raf av to fosfataser, PP1 eller PP2A, resulterer i c-Raf-frigjøring fra 14-3-3 og gir mulighet for reaktivering av c-Raf, som i sin tur utløser ERK-aktivitet [34]. HDAC1, 6, og 10 har blitt rapportert til å danne et kompleks med PP1, respektivt. HDACIs selektivt forstyrre HDAC-PP1 kompleks og øke foreningen av PP1 og Akt, noe som bidrar til de anti-neoplastiske aktiviteter HDACI [35]. Denne studien viser at LBH589 forstyrrer HDAC6 /PP1α kompleks og fremmer samspillet mellom PP1α og acetylert 14-3-3ζ. Når PP1α er assosiert med 14-3-3ζ opprettholder PP1α fortsatt sin fosfatase-aktivitet [36]. Med LBH589 bytte sin samspill partner, kan PP1α endre sin affinitet eller spesifisitet til underlag. Igjen, er et viktig spørsmål reist om HDACs er involvert i cellesyklusregulering ved å endre underlag «affinitet eller spesifisitet PP1α.
I tillegg til ERK-aktivering, hemming av HDAC6 av LBH589 induserer også Cdc25C hyper- fosforylering av fjernelse av inhiberende fosforylering av serin 216 av Cdc25C. LBH589-indusert defosforylering av S216 av Cdc25C er også regulert av PP1α og 14-3-3ζ med de samme mekanismene som er ansvarlig for S259 defosforylering av c-Raf. Dermed HDAC6 ikke bare deltar i reguleringen av c-Raf /PP1 /ERK signalveien, men koordinerer også ERK signalkaskade til M fase cellesyklus overgang.
Denne studien foreslår en modell for å forklare hvordan LBH589 induserer prometafase arrestere. Når HDAC6 binder seg med en HDACI, slik som LBH589 i denne studien, kan det føre til en konformasjonsendring i HDAC6, som fører til dissosiasjon av PP1α og forbedring av 14-3-3ζ acetylering. Acetylert 14-3-3ζ har høy affinitet for binding med PP1α og moduler affinitet PP1α binding til sine underlag. Videre er fosfater av c-Raf-Ser259 og Cdc25C-Ser216 defosforylert ved PP1α og disse indusere konstant ERK-aktivering. Sustain ERK-aktivering kan destabilisere HDAC6 proteiner og hyper-phosphorylate Cdc25C, som fører til prometafase cellesyklus arrest av LNCaP celler (figur 7).
LBH589 binding til HDAC6 kan forårsake konformasjonsendring på HDAC6, som fører til dissosiasjon av PP1α og forbedring av 14-3-3ζ acetylering. Acetylert 14-3-3ζ økt samspill slektskap med PP1α og blandet seg inn i affinitet PP1α binding med underlaget. PP1α da dephosphorylated S259 av c-Raf og S216 av Cdc25C, utløser ERK-aktivering. Konstant ERK-aktivering på grunn av aktivering av c-Raf kan destabilisere HDAC6 proteiner og hyper-phosphorylate CDC25C, som fører til prometafase cellesyklus arrest av LNCaP celler.
I konklusjonen, induserer LBH589 vedvarende ERK-aktivering gjennom fri fremover regulering som inhiberer HDAC6 enzymaktivitet, etterfulgt av nedregulering av HDAC6 proteinekspresjon. Disse funnene svare på spørsmålet om hvordan ERK-aktivering kan være ansvarlig for både celle spredning og vekst hemming fenotyper. HDAC6 er en avgjørende faktor avgjørende for samspillet mellom Raf /ERK signalveien og biologisk M fase cellesyklus overgang, noe som gjør det til et perfekt mål for HDACI LBH589. Denne studien belyser videre LBH589-mediert sent G2 og tidlig M fase cellesyklus arrest gjennom forskjellige molekylære mekanismer i PC-3 og LNCaP PCA celler med ulike terapeutiske utfall. Derfor er de detaljerte mekanismene som er ansvarlig for LBH589-mediert veksthemming av prostata kreft celler raknet for å gi ny innsikt som kan lede utformingen av mer effektive strategier som vil optimalisere HDACI anti-kreft terapi for klinisk oversettelse.
Materialer og metoder
Reagenser
LBH589 ble gitt av Novartis Pharmaceuticals (East Hanover, NJ) oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO). Suberoyl Bishydroxamic Acid (SBHA) og Suberoylanilide hydroxaminsyren (Saha) var fra ATON Pharma (Tarrytown, NY). Propidiumjodid (PI), 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ble RNase A og en proteasehemmere cocktail innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . UO126 og PD98059 ble kjøpt fra Calbiochem.
Cell kultur
LNCaP, PC-3, og 22Rv1 ble vennlig levert av Dr. Pei-Wen Hsiao (Agricultural Biotechnology Research Center, Academia Sinica, Taiwan ) [37]. DU 145 og 293T ble kjøpt fra Bioresource Collection og Research Center (BCRC, Taiwan). PC-3 og 293T cellelinjer ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium, mens LNCaP og 22Rv1 ble dyrket i RPMI-1640. DU 145 ble opprettholdt i modifisert Eagles medium. Alle media ble supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 50 U /ml penicillin og 50 mg /ml streptomycin. Cellene ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 /luftatmosfære.
MTT-analyser
Cellene ble sådd ut i 96-brønns plater ved en densitet på 3000 -5000 celler per brønn, avhengig av cellelinjen, ble behandlet med vehikkel (DMSO) eller forskjellige doser av LBH589, Saha, og SBHA ved hjelp av fem brønner pr behandling. Ved 24, 48 og 72 timers behandling, ble mediet beveges, og 100 ul av 1 mg /ml MTT ble tilsatt før inkubasjon ved 37 ° C.
