Abstract
Prostatakreft består av sekretoriske celler og en befolkning på umodne celler. Funksjonen av umodne celler og deres innbyrdes relasjon med sekretoriske celler er fremdeles dårlig forstått. Umodne celler enten ha et hierarkisk forhold til sekresjonscellene (stamcelle modell) eller representerer en induserbar befolkning voksende på riktig stimulering av differensierte celler. Hepatocytter Growth Factor (HGF) reseptoren c-MET er spesielt uttrykt i umodne prostata celler. Vårt mål er å finne ut hvilken rolle umodne celler i prostata kreft ved analyse av HGF /c-MET veien.
Gene-uttrykk profilering av DU145 prostata kreft celler stimulert med HGF avslørte induksjon av en molekylær signatur i forbindelse med stamceller, karakterisert ved oppregulering av CD49b, CD49f, CD44 og SOX9, og nedregulering av CD24 ( «stilk-lignende signatur «). Vi har bekreftet kjøpet av en stamme-lignende fenotype av kvantitativ PCR, FACS analyse og Western blotting. Videre HGF førte til aktivering av stamcelle relatert Notch sti ved oppregulering av sine ligander Jagged-en og Delta-lignende 4. Små molekyler SU11274 og PHA665752 målretting c-MET aktivitet var både i stand til å blokkere de molekylære og biologiske effekter av HGF. Knock-down av c-MET av shRNA infeksjon førte til betydelig reduksjon og forsinkelse av orthotopic svulst-formasjonen i NMRI mus. Immunhistokjemisk analyse i prostatectomies avdekket betydelig berikelse av c-MET positive celler i invasiv front, og viste samtidig uttrykk for c-MET med stilk-lignende markører CD49b og CD49f.
I konklusjonen, aktivering av c-MET i prostatakreftceller indusert en stilk-lignende fenotype, som indikerer en dynamisk forhold mellom differensierte og stilk-lignende celler i dette malignitet. Dens formidling av effektiv tumor-formasjon
in vivo Hotell og dominerende reseptor uttrykk ved invasiv foran implisere at c-MET regulerer tumorinfiltrasjon i omkringliggende vev putatively ved oppkjøp av en stamme-lignende fenotype.
Citation: van Leenders GJLH, Sookhlall R, Teubel WJ, de Ridder CMA, Reneman S, Sacchetti A, et al. (2011) Aktivering av c-MET induserer en stilk-Like Phenotype i Human prostatakreft. PLoS ONE 6 (11): e26753. doi: 10,1371 /journal.pone.0026753
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 14 januar 2011; Godkjent: 03.10.2011; Publisert: 14.11.2011
Copyright: © 2011 van Leenders et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Nederland Organisasjonen for Health Research and Development (ZonMW, gi 907-00-138, personlig stipend til Dr. van Leenders, https://www.zonmw.nl/); Stiftelsen for industriell Urologisk forskning (SUWO); Foundation Adessium; Foundation Zabawas, Nederland. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Innenfor prostata epitel, er vev homeostase mediert av stamceller bosatt i basal glandular epitel [1]. Etter asymmetrisk fordeling stamceller gi opphav til transitt-amplifisering av celler, som er til stede i både basal og luminale epitel, og som til slutt skiller inn i luminal sekretoriske celler. Ulike membran markørene er forskjellig uttrykt i stammen og differensierte celler i benign gnager og menneskelige prostata epitel inkludert Sca-en
+, α
6-integrin /CD49f
+, α
2-integrin /CD49b
+, CD133
+, CD117
+, CD44
+ og CD24
– [2] – [9]. Kombinasjonen av disse markørene kan fremme delimitate stilk, transitt-forsterkende og terminalt differensierte celler i normal epitel. For eksempel stamceller putatively uttrykkelig α
2β
1-inte
+ /CD133
+, er transitt-forsterke celler a
2β
1-inte
+ /CD133
– og terminalt differensierte celler er a
2β
1-inte
– /CD133
-. [3], [7] Hotell
Cell populasjoner med biologisk egenskaper som ligner de til godartede stamceller har også blitt identifisert i maligne tumorer [10] – [13]. I prostatakreft, α
2β
1-inte
+ /CD133
+ celler har potens for selvfornyelse og multi-directional differensiering
in vitro product: [8], [ ,,,0],14]. I tillegg CD44
+ /CD24
– celler isolert fra prostatakreftcellelinjer demonstrere høy tumordannende potensial
in vivo product: [4]. Til tross for deres tilsynelatende variasjon i klonogene og tumor-initiering potensial, blir den innbyrdes relasjonen mellom umodne og differensierte celler fremdeles dårlig forstått. I korrespondanse til deres relasjon i normalt vev, har et strengt hierarkisk relasjon mellom såkalte kreft stamceller (CSC) og differensierte celler postulert [12] – [14]. Ifølge denne modellen, CSCs er direkte og irreversible stamfedre av differensierte celler. Nylig ble det imidlertid vist at differensierte celler kan skaffe CSC funksjoner i bryst og tykktarmskreft [15], [16]. Spesielt fenotypiske og biologiske egenskaper har bidratt til stamceller kan oppnås, når mer differensierte celler gjennomgår epitelial-mesenkymale overgang (EMT) enten ved tvungen depresjon av E-cadherin, eller av faktorer som utskilles av den mikro-miljø slik som hepatocytt-vekstfaktor (HGF ) [15], [16]. Siden den eksakte natur og relasjon med andre celletyper er fortsatt kontroversielt, henviser vi til cellepopulasjonen viser stamcelleegenskaper som stilk-lignende celler.
HGF og dens tyrosin kinase reseptor c-MET er viktige formidlere av organogeneseperioden , vev regenerering og sårtilheling [17]. Innenfor normal prostata epitel, er c-MET spesifikt uttrykt i basal og atrofisk luminal cellene, der det putatively formidler regenerering av skadet sekretoriske kjertler [18], [19]. I prostatakreft, er c-MET til stede på et lavt nivå, med et mindretall av celler som viser høy protein uttrykk [18], [20], [21]. Tidligere andre, og vi har vist at c-MET og basalcellemarkør Keratin 5 er ko-uttrykt i den samme cellepopulasjon i prostatakreft [14], [18]. Siden HGF /c-MET veien har en regulerende funksjon i migrasjon og invasjon
in vitro
, vi har antydet at denne cellen befolkningen er spesielt utsatt for infiltrasjon i omliggende vev [18], [22].
lite er kjent om rollen til c-MET i forhold til å demme-lignende celler i prostata kreft og hvordan
in vitro
studier på stilk-lignende celler sette til selve kreft hos pasienter. I denne studien viser vi at aktivering av c-MET fører til induksjon av en stilk-lignende fenotype i prostata kreft. Knock-down av c-MET ytterligere sterkt redusert tumordannelse i nakne mus. Til slutt viser vi at c-MET er fortrinnsvis uttrykt ved yttergrensen av menneskelige prostatektomi eksemplarer og er samlokalisert med sine nedstrøms målene a
2-integrin og α
6-inte. Disse dataene indikerer at stilk-lignende celler megle svulstvekst på invasiv forsiden av prostatakreft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Studiet ble godkjent av den nasjonale Animal Eksperimenter Committee (DEC, 102-08-01, EUR1396). Alle pasientprøver ble anonymt brukt etter passende skriftlig informert samtykke og under godkjenning av menneskelig etikk Institutional Review Board (METC; MEC02.0957).
Cells og materialer
DU145 prostatakreft cellelinje og human embryonisk nyre (HEK) 293T-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). DU145 ble holdt ved 37 ° C /5% CO
2 i RPMI 1640 inneholdende 5% føtalt kalveserum (FCS) og penicillin /streptomycin (P /S) (Lonza, Verviers, Belgia). For stimulering eksperimenter ble DU145 cellene sådd over natten i RPMI /FCS medium. Etter en dag, ble medium erstattet med 5% dekstran Charcoal (DCC) behandlet RPMI (Sigma, St. Louis, MO, USA). Etter tilpasning over natten, HGF (25 ng /ml; Sigma) ble tilsatt til kulturmediet og cellene ble høstet ved inkubering med 2 mM EDTA (Sigma) i 20 min. Små molekyler SU11274 (1,0 mikrometer, Sigma) og PHA665752 (0,1 mikrometer, Calbiochem, Nottingham, UK). Oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) ble brukt for c-MET hemming
Microarray analyse
DU145-celler ble stimulert i 2, 8 og 24 timer med HGF eller kjøretøy, og RNA ble isolert ved anvendelse av RNAzol B-reagens (Tel-test Inc., Friendswood, USA). Etter RNA isolering med kloroform, isopropanol og etanol, ble DNA spaltet ved bruk av DNA-settet (Ambion, Huntingdon, UK). RNA kvalitet og kvantitet ble målt ved hjelp av RNA 6000 Nano kit på en 2100 Bioanalyzer (Agilent, Palo Alto, CA, USA). Prøver med RNA integritet antall 8,5 ble valgt. 5 pg av total RNA fra stimulerte og kontrollprøver ble anvendt for fremstilling av antisense-RNA biotinylert i overensstemmelse med fabrikantens en syklus protokoll (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Hybridisering til Affymetrix Menneskelig U133plus2.0 GeneChips (54,614 probe sett, som representerer ca 47 000 utskrifter), farging, vasking og skanning prosedyrer ble utført som beskrevet av Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), og utført av Erasmus MC Senter for Biomics. Microarray data ble behandlet og normalisert med Affymetrix Microarray Suite-programvaren. RMA quantile normalisering ble utført og uttrykksverdier (EVS) mellom matriser ble normalisert ved å sette den gjennomsnittet av hver av de 6 matriser til 150; Verdiene 30 ble satt til 30. For hvert tidspunkt
2log forhold mellom HGF og kjøretøy behandlede celler ble beregnet. Array data er MIAME kompatibel og har blitt sendt til GEO (GSE16659). Kobling til andre databaser ble utført ved hjelp SRS7; Treeview programmet ble brukt for å generere heatmap bilder [23], [24].
kvantitativ real-time PCR
kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av TaqMan Rxn PCR kjerne Reagenser inkludert MQ, Taq Buffer, MgCl
2, dNTP, AmpliTaq G (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Følgende prober ble anvendt: Hs02379687_s1 (CD24); Hs00174139_m1 (CD44); Hs01041017_m1 (CD49f); Hs00165814_m1 (SOX9); Hs00158148_m1 (CD49b). Mengden av target gen ble normalisert til GAPDH (Hs99999905_m1).
For analyse av c-Met-hemmere på CD49b, ble totalt RNA isolert med RNAzol B reagens (Tel-Test) i henhold til produsentens protokoll. RT-reaksjonen ble utført med oligo (dT) 12-18 primer (Invitrogen, La Jolla, CA). Etter tilsetning av første-tråd buffer, dithithreitol, dNTP og RNasin, ble RT-reaksjoner initiert av MMLV-RT (Invitrogen) og inkubert i en time ved 37 ° C. Kvantitativ PCR ble utført ved anvendelse av SYBR-grønn Mastermix (Applied Biosystems). CD49b frem 5′-CAG GCA CAC CAA AGA ATT GA-3 «, reverse 5′-GAA GAA GCC GAG CTT CCA TA-3′, GAPDH frem 5»-ACT GTG GTC ATG AGT CCT TC-3 «, reverse 5» -CAT GTT CGT CAT GGG TG-3 «, og PBGD fremover 5′-CAT GTC TGG CGG TAA CAA TG-3′ og revers 5»-GTA CGA GGC TTT CAA TGT TG-3 «. Signaler ble analysert ved ABI Prism 7700 system (Applied Biosystems). Antall målgener ble bestemt ved bruk av standardkurver fra seriefortynninger. For bestemmelse av Notch-reseptorer og ligander, ble RT-PCR utført ved anvendelse av primersettene og cycli som vist i tabell S1 ved en glødetemperatur på 60 ° C.
Strømningscytometri og Western blotting
for analyse av membran proteiner 0,5 × 10
6 DU145 cellene ble inkubert med anti-CD49b (1:500; Chemicon, Hampshire, UK), anti-CD49f (1:10,000; Abcam, Cambridge, UK), anti- CD44-FITC (1:200, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), anti-CD24-PE (1:10; BD) og anti-CD133-PE (klone AC133, 1:100, Miltenyibiotec, Bergisch Gladbach, Tyskland ) i 50 ul PBS /2% FCS i 30 minutter. på is. Etter vasking ble cellene inkubert med sekundære antistoffer merket med Alexa Fluor 488 (1:500) i 15 min. Etter suspensjon i 300 ul PBS /2% FCS med Hoechst 33258 (2 ug /ml) for å selektere for levende celler, ble protein ekspresjon målt ved anvendelse av en FACSAria strømningscytometer (BD) er utstyrt med tre lasere (407, 488 og 633 nm).
for analyse av SOX9 og c-MET-protein, stimulerte og kontrollceller ble lysert i RIPA-buffer (10 mM tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton x 100, 1% deoksycholat, 0,1% SDS, 5 mM EDTA) inneholder proteinaseinhibitorer (Complete, Roche, Basel, Sveits). Protein konsentrasjoner ble målt ved hjelp av Biorad protein reagenser (Biorad Laboratories, München, Tyskland). 40 ug av totalt protein ble applisert på en 10% SDS-PAGE-gel og overført til nitrocellulosepapir (Protan, Schleicher og Schuell, Dassel, Tyskland). Etter blokkering i 5% NFDM /TBST (Protifar, Nutricia, Zoetermeer, Nederland) i 1 time, Blottene ble inkubert ved 4 ° C over natten med 0,2 ug /ml anti-SOX9 (klon AF3075; R Applichem, Darmstadt, Tyskland) i 4 timer, hvoretter den metabolske produktet ble suspendert i 100 pl buffer DMSO og målt ved 570 nm med et BIO-RAD 550 mikroplateavleser (Biorad). For kvantifisering av celleadhesjon, 3,0 x 10
5 stimulerte DU145-celler ble sådd ut på 12-brønn plater belagt med kollagen (Becton Dickinson Labware, Bedford, UK). Etter adhesjon i 15 min., Ble platene vasket, inkubert med 1 ml DCC medium inneholdende 5 mg /ml MTT, og optisk tetthet ble bestemt.
Lentiviral infeksjon
HEK-293T-celler ble sådd ut i kolber belagt med 0,1% gelatin /PBS og vokst til 50-60% samløpet. Lentiviral partiklene ble produsert etter transfeksjon av HEK 293T celler med 20 ug av vektor DNA (pLKO.1 shRNA, ID167, klone NM_000245.x-502s1c1, Sigma) sammen med 15 mikrogram pPAX
2 og 6 mikrogram PMD
2G ved bruk av capo
4 presipitering, hvoretter dH
2o, 2,5 M CaCl
2 og HEPES-bufret saltløsning (pH 7,05) ble tilsatt. Transfeksjon Blandingen fikk stå inkuberes i 20-30 min. ved romtemperatur før den ble tilsatt til HEK 293T celler. De shRNA lentivirus-inneholdende cellekultur-supernatanter ble samlet 24 og 48 timer etter transfeksjon, og ført gjennom en 0,45-um filter. For å bestemme transfeksjonseffektiviteten HEK 293T celler ble samtidig tilført med grønt fluorescerende protein (GFP). Egge shRNA (Sigma) ble anvendt som kontroll. DU145 ble deretter infisert med de innsamlede virus (01:01) over natten og infiserte kloner ble utvalgt ved Utvanningshyponatremi kloning.
ortotopisk injeksjon
1,0 x 10
5 DU145-celler ble injisert i dorsolateral flik av mannlige nu /nu Naval Medical Research Institute (NMRI) mus sammen med 1,0 × 10
6 PRSC prostata fibroblaster i 20 ul RPMI /DCC medium inneholder humant HGF (25 ng /ml) [25]. Injeksjoner ble utført med en 30G microlance nål (Becton Dickinson, Alphen a /d Rijn, Nederland) på en Luer tips mikroliter 700 sprøyte (Hamilton, Bonaduz, Switserland) etter abdominal snitt under narkose. Tumor volum (TV) ble overvåket hver uke ved transrectal ultralyd (Endosonics Europe BV, Rijswijk, Nederland). Mus ble ofret på en TV 1000 mm
3 eller etter 3-4 måneder. Prostata ble histologisk analysert sammen med abdominal lymfeknuter og lunger.
Immunohistochemistry
Immunhistokjemi for c-MET ble utført på 94 formalinfiksert, parafininnstøpte radikale prostatectomies (RP). Deler av 4 pm ble avvokset og utvannet ved hjelp av xylen og etanol. Endogen peroksidase ble stanset og antigen gjenfinning ble utført i løpet av 15 min. av mikrobølgebestråling (700 W) i Tris-EDTA (pH = 9). Glassene ble inkubert med kanin-anti-human c-MET (1:100, C12, Santa Cruz) over natten ved 4 ° C, og visualisert ved hjelp av EnVision systemet (DAKO). For kvantifisering av c-MET ble forekomsten av sterkt positive celler scoret i den ytre, vilkårlig definert som ytre 2 mm av svulsten og sammenlignet med sentrum.
For samlokalisering studier, seks flytende N
2 frosne RP lysbilder var aceton-fiksert og inkubert med anti-c-MET (1:100), og mus anti-human CD49b (1:100, HAS-3; Abcam) eller rotte anti-human CD49f (1 :100; Abcam) over natten ved 4 ° C. Etter vasking, ble objektglass inkubert med svin-anti-kanin biogenin (1:150; DAKO). I kombinasjon med anti-mus eller anti-rotte antistoff merket med Alexa 488 (1:100) i 30 minutter, fulgt av avidin-Cy3 (1 :100) kompleksdannelsen i 30 minutter. ved romtemperatur.
statistikker
Vekst effekten av HGF og c-MET-hemmere ble evaluert med Student
t
-test. Immunhistokjemisk uttrykk for c-MET i RP ble analysert med Pearson χ
2 test. Tumor dannelse hos mus ble evaluert ved bruk av begge testene, alt ved hjelp av SPSS versjon 15.0 (SPSS Inc, IL, USA). En tosidig p-verdi under 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Funn av HGF /c-MET regulert gener
Forrige RT-PCR og Northern blot analyse demonstrert at c-MET er uttrykt i androgen-uavhengig prostatacancer-cellelinjer DU145 og PC3, men ikke i androgen-avhengige LNCaP [18], [20]. Stimulering av DU145 med HGF resulterte i celle spredning og migrasjon i 2D-kultur (figur 1A), mens stel spirer dannes i 3D Matrigel matriser (Figur 1b). Under spredning, DU145-celler oppnådd en spindel form i motsetning til deres normale epithelioid form, mens cellevekst ble betydelig inhibert med 21% etter 3 dager (p 0,003) og 10% etter 6 dager (p = 0,024) (figur 1C). Selv PC3 besitter c-MET protein, gjorde HGF stimulering ikke forårsake morfologiske endringer (upubliserte observasjoner) putatively grunn av sin mangel av en funksjonell α-catenin /E-cadherin kompleks [26].
A
, HGF indusert transformasjon fra epiteloide celleclustere mot enkelt spindel celler i to-dimensjonale kultur.
B
, In 3-dimensjonale Matrigel spirer stammer fra kompakte mobil knuter etter HGF stimulering.
C
, Celleproliferering hemmes med 21% (p 0,003) etter 3 dager og 10% (p = 0,024) etter 6 dager med HGF stimulering (kontroll
svarte striper
-; HGF
grå søyler
+).
En
,
B
Original forstørrelse 40 ×.
For å utforske de molekylære stier relevante for c-MET funksjon i prostatakreft, utførte vi microarray uttrykk analyse av DU145 cellene stimulert med HGF. Gener ble utvalgt basert på en to-ganger opp eller ned-regulering av minst en sonde innstilt på 24 timers tidspunkt og en gjennomsnittlig uttrykk med en 1,41 gangers forskjell. Totalt 371 gener oppfylte disse kriteriene hvorav 238 var opp- og 133 nedregulert av HGF (tabell S2); de beste 20 opp- og ned-regulerte gener er avbildet i figur 2A.
En
, Top 20 opp- og ned-regulert gener etter HGF stimulering i 24 timer, kombinert med respektive genet ekspresjon profiler etter stimulering for 2 og 8 timer. .
B
, Effekt av HGF på gener assosiert med prostata stamcelle fenotype
Vi fant at ulike membran markører benyttes for stamcelle utvalget ble forsterket etter 24 timer: α
2-integrin /CD49b, α
6-integrin /CD49f og CD44, mens CD24 ble nedregulert (figur 2B). Transkripsjonsfaktor SOX9 ble også indusert av HGF. SOX9 er nødvendig for tidlig differensiering av prostata epitel under embryogenese og reaktiveres i prostata kreft impliserer en relevant funksjon i umodne prostataceller [27]. Uttrykk av to andre antatte prostatahyperplasi stamcellemarkører CD133 og LGR5 var under deteksjonsgrenser [14], [28].
Validering av fenotypiske stilk-lignende celle induksjon
Regulering av stamcelle forbundet gener av HGF /c-MET veien ble validert i tre uavhengige DU145 eksperimenter ved hjelp av kvantitativ PCR. En regulerende effekt av HGF ble demonstrert for alle utvalgte gener (figur 3). Etter 24 timers stimulering CD24 (0,4 ganger) ble nedregulert, mens CD49b (2,6 ganger), CD49f (2,0 ganger), CD44 (1,8 ganger) og SOX9 (2,9 ganger) ble alle forbedret. Deretter ble bekreftet FACS-analyse oppregulering av membran-proteiner CD49b, CD49f, CD44, og undertrykkelse av CD24 (figur 4A). Virkningene på protein uttrykk var mest fremtredende for CD49b med en generell økning på 240%. Membranøs ekspresjon av CD49f og CD44 var bare litt forsterket etter stimulering HGF (22% og 26%, resp.). Siden SOX9 er lokalisert i kjernen, utførte vi Western blot analyse for å bekrefte sin regulering av HGF. Som ventet ble uttrykk for SOX9 protein sterkt indusert i stimulert DU145 celler opp til 521% etter 24 timer (figur 4B).
kvantitativ real-time PCR bekreftet induksjon av CD49b, CD49f, CD44 og SOX9 mRNA, sammen med nedregulering av CD24.
En
, FACS demonstrerte oppregulering av CD49b (240%), CD49f (22%), CD44 (26%), sammen med nedregulering av CD24 (-69%) etter stimulering HGF. Tynn grå linjen representerer merking med sekundært antistoff bare (negativ kontroll), tynn svart linje DU145 uten HGF, og tykk svart linje DU145 med HGF.
B
, Western blot viste forbedring av SOX9 uttrykk på HGF stimulering fra 2 til 24 timer.
C
, FACS demonstrerte induksjon av dobbeltmerket CD44
+ /CD24
– DU145 cellene (kontroll 8%
versus
HGF 26%)
.
Begge CD44
+ /CD24
– og α
2β
1-inte
+ /CD133
+ profiler velge for stilk-lignende celler i prostata kreft [4] , [14]. Ved HGF stimulering, den CD44
+ /CD24
– befolkningen ble beriket 3,25 ganger (fra 8% til 26%) kombinert med en 0,8 gangers nedgang (fra 91% til 73%) av mer moden CD44
+ /CD24
+ celler (Figur 4C). Utvalg for α
2β
1-inte
+ /CD133
+ celler blir ofte forfulgt først etter kortsiktig vedheft til kollagen jeg matrise, som velger for høy inte uttrykke celler [3] . For å kontrollere om c-MET aktivering forbedrer brøkdel av raskt å feste umodne celler, kvantifisert vi vedheft til kollagen jeg etter 15 min. Innenfor denne perioden, 0,037% (gjennomsnitt; SD 0,006%) av kontrollceller festet til kollagen I. HGF aktivering av DU145-celler signifikant (p 0,01) anriket for hurtig holde celler (gjennomsnitt 0,055%; SD 0,011%). Med FACS analyse, CD133 uttrykk i DU145 var under deteksjonsgrenser og påvirkes ikke av HGF stimulering (data ikke vist).
HGF aktiverer Notch pathway
Notch signale spiller en viktig rolle i prostata utvikling og har vært implisert i CSC funksjon [29] – [31]. Analyse av den gene-ekspresjon profil vist over-uttrykket (3.0 x) av nedstrøms Notch target HES-1 på HGF stimulering. Derfor, undersøkte vi effekten av HGF på Notch-reseptorer og deres ligander. Vi fant at c-MET aktivering førte til oppregulering av Notch ligander taggete-1 og Delta-lignende (Dll) 4 (figur 5). Liganden Jagged-2-reseptorer Notch-2 og Notch-3 var upåvirket, mens Notch-1 reseptoren ble nedregulert ved HGF stimulering (data ikke vist), som impliserer at hakk aktivering resultat av over-ekspresjon av ligander Ujevne-1 og dll-4.
HGF stimulering førte til overuttrykk av Notch ligander Jagged-en og dll-4 RNA, og nedstrøms Notch target HMS-en.
hemmere av c-MET blokk utvikling av stilk-lignende fenotype.
Godkjenning av umodne celler i menneske maligniteter initiert utvikling av spesifikke farmasøytiske midler rettet mot denne biologisk viktig befolkning. De små molekyler SU11274 og PHA665752, som både hemmer c-MET enzymatiske aktiviteten fullstendig blokkert celle spredning i kultur og dannelse av stel spirer i Matrigel (data ikke vist) [32], [33]. HGF-medierte vekstreduksjon var signifikant tilbakestilt til referansenivået (p 0,001) med PHA665752, men ikke ved SU11274 (p = 0,186) (figur 6A). SU11274 (p 0,001) og PHA665752 (p = 0,016) vesentlig tilbake både induksjon av CD49b (figur 6B), så vel som inhibering av CD24 (både p 0,001) i løpet av 24 timer (Figur 6C). Fordi HGF bare moderat påvirket CD49f og CD44 nivåer, kan vi ikke vurdere farmakologiske effekter på disse markørene.
En
, Celleproliferering hemmes av SU11274 i både kontroll (
svarte striper
-) og HGF stimulerte celler (
grå søyler
+), slik at det ikke reversere HGF mediert vekstreduksjon (p = 0,186). PHA665752 ikke påvirker celleproliferasjon i kontrollceller, og blokkerte HGF indusert vekstinhibisjon (p 0,001).
B
,
C
, både SU11274 og PHA665752 blokkert HGF mediert induksjon av CD49b (
B
) og hemming av CD24 (
C
). Standardavvik representerer tre uavhengige eksperimenter.
Uttrykk av c-MET modulerer effektiv svulstdannelse
in vivo
For å analysere rollen som c-MET i tumor -formation
in vivo
, infisert vi DU145 cellene med lentivirus uttrykker shRNA targeting c-MET reseptor og valgt tre c-Met negative kloner (figur 7A). C-MET negative DU145 kloner hadde lignende morfologi som foreldrelinjen, når dyrket i 2D eller 3D kultur, men reagerte ikke på HGF ved spredning eller dannelse av stel spirer (data ikke vist). Orthotopic injeksjon av foreldre DU145 resulterte i 90% (9/10) tumordannelse; disse musene ble ofret med en TV av 1357 mm
3 (gjennomsnittlig; range 1016-1860 mm
3) etter 42,6 dager (gjennomsnittlig; range 38-52 dager). Kontroll DU145 celler infisert med egge shRNA førte til tumordannelse i 100% (5/5). Disse musene ble alle ofret på grunn av stor TV etter 59 dager (gjennomsnittlig; range 52-66 dager) (figur 7B). Betydelig reduksjon av tumordannelse skjedde i DU145 kloner med taushet c-MET. I alt 55% (11/20) av klonene (6/10 Sh167 # 14, 3/5 Sh167 # 5 og 2/5 Sh167 # 6) ga opphav til svulster, hvorav bare en ble avlivet på grunn av stor TV ( 1013 mm
3; 81 dager). Femten mus ble ofret på 119 dager (gjennomsnitt; range 109-124 dager), hvorav seks hadde små svulster (mener TV 477 mm
3; range 137-788 mm
3). Fire mus døde brått mellom 52 til 102 dager, alle viser små svulster (TV bety 225 mm
3; range 137-304 mm
3) (figur 7C). Ikke i noen av muse metastaser ble observert. Til sammen funksjonell c-MET mediert effektiv svulstdannelse i foreldre DU145 (p 0,02) og resulterte i betydelig større svulster i kontroll DU145 cellene (p 0,001).
En
, Tre DU145 kloner (5, 6, 14) med lav til negativ c-MET proteinekspresjon (Western blot) ble samlet ved stabil shRNA infeksjon.
B
, ortotopiske injeksjon av 1,0 × 10
5 DU145 med funksjonell c-MET førte til effektiv tumor-formasjonen i 9/10 foreldre (
svart
) og 5/5 kontroll DU145 celler (
grønn
) infisert med egge RNA.
C
, ortotopiske svulst-formasjonen ble betydelig redusert i DU145 med lav c-MET uttrykk. Totalt 6/10 DU145Sh167 # 14 (
Svart
), 3/5 DU145Sh167 # 5 (
grønn
) og 2/5 DU145Sh167 # 6 (
rød
) injeksjoner resulterte i tumor-formasjon. Bare en tumor nådd en TV på 1000 mm
3 i løpet av studieperioden på 52-124 dager.
Celler som uttrykker c-MET er plassert på invasiv foran prostatakreft.
Tumor celler med høy c-MET uttrykk er spesielt beriket ved invasiv foran kolorektal karsinom, hvor de formidler EMT, migrasjon og matrise invasjon [34], [35]. For å bestemme c-MET uttrykk ved invasiv fram i prostata cancer, vi sammenlignet nærværet av høy c-MET uttrykkende celler ved omkretsen og i sentrum av godt fast RP prøver (N = 94). Samlet høy c-MET uttrykke celler (figur 8A) ble funnet i 37 tilfeller (39,4%). Omkretsen inneholdt mer høy c-MET uttrykker celler enn svulsten sentrum i 27 tilfeller (73,0%). I 6 tilfeller (16,2%) disse cellene var mer rikelig i sentrum, mens i fire RP-tallet (10,8%) var det ingen forskjell i uttrykket (Pearson χ
2; p 0,001). Uttrykk av c-MET i pre-eksisterende godartede basal celler i hele lysbildet fungert som en intern kontroll for å utelukke feste-indusert flekker gjenstander. Totalt 25 tilfeller avslørt svulst ekspansjon inn ekstra prostatahyperplasi fettvev; i 10 ekstra prostatatumorområder (40,0%) høy c-MET uttrykker celler ble møtt (8B).
c-MET er sterkt uttrykt i spredt prostatakreftceller (
A
) , og spesielt ved invasive fronter i peri-prostata fettvev (
B
); pilspisser indikerer positive celler. Original forstørrelse 100 ×.
Til slutt ble co-uttrykk studier utført i RP prøver å validere c-MET co-uttrykk med stilk-lignende cellemarkører hos pasienter. Immunofluorescent stainings for c-MET, CD49b og CD49f demonstrerte diffuse uttrykk av alle merkene i basal celler av pre-eksisterende kjertler. Expression var lav til fraværende i de aller fleste normale og maligne luminal celler. Receptor c-MET ble uttrykt sporadisk på høye nivåer i enkelte ondartede celler. Disse cellene ko-uttrykt CD49b og CD49f, noe som indikerer at c-MET-positive celler faktisk ko-uttrykker en stilk-lignende celle fenotype i human prostatacancer (figur 9).
Immunofluorescent dobbeltmerking av c-MET ( Cy3, rød) med CD49b eller CD49f (Alexa 488, grønn). Co-uttrykk for c-MET med både CD49b og CD49f var til stede i spredt prostatakreftceller (
piler
). Original forstørrelse 100 ×.
Diskusjoner
Minst tre forskjellige cellepopulasjoner kan bli diskriminert i human prostatakreft. Mens differensierte eksokrine og nevro-endokrine celler representerer de dominerende celletypene, er bevis øker som en mindre bestand av umodne celler er bestemmende for den biologiske oppførsel av prostatakreft. Analogisk til normal kjertel prostata epitel, Collins et al. fornem umoden stammen (α
2β
1-inte
+ /CD133
+) og transitt forsterkende celler (α
2β
1-inte
+ /CD133
-) i menneskelige prostata kreft eksemplarer av klonogene, proliferativ og differensierende kapasitet
in vitro product: [14]. Selv om CD133 er foreslått som en generell markør for tumor stamceller, er dens spesifisitet for selve tumor stamceller fortsatt under debatt [10] – [12], [14], [36], [37]. I tykktarmskreft, for eksempel, har det blitt foreslått at CD44
+ /CD24
– /CD133
– profil representerer svulsten stamcelle befolkningen mens CD133
+ heller markerer mer differensierte celler [38
