Abstract
Innledning
I randomisert studier med EGFR-TKI bare en mindre andel av pasienter med NSCLC har genetisk profilert biopsier. Retningslinjer gi bevis for å utføre EGFR og KRAS mutasjon analyse i ikke-plateepitel NSCLC. Vi utforsket svulst biopsi kvaliteten som tilbys for mutasjonstesting, forskjellige mutasjoner distribusjon, og utfallet med EGFR-TKI.
Pasient og metoder
Kliniske data fra 8 regionsykehusene ble undersøkt for pasient- og kreft egenskaper, behandling og total overlevelse. Biopsier som sendes til det sentrale laboratorium ble evaluert for DNA-kvalitet, og deretter analysert for mutasjoner i exon 18-21 av EGFR og exon 2 av KRAS av toveis-sekvensanalyse.
Resultatene
tumorer fra 442 påfølgende pasienter ble analysert. For 74 pasienter (17%) svulster var uegnet for mutasjon analyse. Trettiåtte pasienter (10,9%) hadde EGFR mutasjoner med 79% kjente aktiverende mutasjoner. Ett hundre åtte pasienter (30%) hadde funksjonelle KRAS-mutasjoner. Mutasjonen spekteret var sammenlignbar med den kosmiske database. Etter behandling i den første eller andre linje med EGFR-TKI median total overlevelse hos pasienter med EGFR (n = 14), KRAS (n = 14) mutasjoner og villtype EGFR /KRAS (n = 31) ble det ikke oppnådd, 20 og 9 måneder henholdsvis.
Konklusjon
Én av 6 tumorprøver var utilstrekkelig for mutasjon analyse. Pasienter med EGFR aktiverende mutasjoner som ble behandlet med EGFR-TKI har den lengste overlevelse
Citation. Kerner GSMA, Schuuring E, Sietsma J, Hiltermann TJN, Pieterman RM, de Leede GPJ, et al. (2013) Felles og Rare EGFR og KRAS Mutasjoner i en nederlandsk ikke-småcellet lungekreft befolkning og deres kliniske utfall. PLoS ONE 8 (7): e70346. doi: 10,1371 /journal.pone.0070346
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 8 mars 2013; Godkjent: 17 juni 2013; Publisert: 29.07.2013
Copyright: © 2013 Kerner et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis finansiert av CTMM Air Force konsortium (https://www.ctmm.nl). CTMM betaler for GSMAK lønn og hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen andre eksterne finansieringskilder for denne studien
Konkurrerende interesser:. Den CTMM Air Force Consortium er en privat /offentlig konsortium med involvering av akademia, private selskaper og regjeringen. Det er ikke en kommersiell finansieringskilde. Gerald Kerner er finansiert av CTMM konsortium for å utføre forskningsprosjektet (translasjonsforskning og bildebehandling forskning på lungekreft) som er en del av sin avhandling. Forfatterne har rett til å publisere alt sitt arbeid og dele alle sine data offentlig. Ingen konsulenttjenester, patenter eller produkter i utvikling er involvert. Til sammen har dette ingen innvirkning på forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Alle forfattere erklært ikke å ha noen konkurrerende interesser.
Innledning
Effekten av EGFR tyrosinkinasehemmere (TKI) hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) avhenger av EGFR mutasjon status. Derfor velger de tilstrekkelige kreftprøve for mutasjonsanalyse er et viktig tema i å gjøre behandling beslutninger i NSCLC. I tidligere randomiserte studier som sammenlignet EGFR-TKI terapi til vanlig kjemoterapi, var andelen av pasienter med tilstrekkelig tumorvev for analyse varierte 10-38% [1], [2], [3], [4], [5], [6 ]. De fleste randomiserte studier brukt ulike EGFR mutasjonstester som kun undersøkt et svært begrenset antall hotspot mutasjoner som L858R og ekson 19 slettinger [2], [7], [8], [9], [10]. Hva skjedde med mindre hyppige mutasjoner er ikke alltid åpenbare. Som EGFR mutasjoner er bare til stede i ikke-plateepitel NSCLC [11], er obligatorisk for å ta avgjørelser om hvilken type kjemoterapi og for å forutsi a priori nærvær av mutasjoner nøyaktig histologisk fenotyping. Den IASLC /ATS /ERS retningslinje anbefaler mutasjonstesting i ikke-plateepitel NSCLC [12].
I kaukasiske pasienter med ikke-plateepitel lungekreft, er mest vanlig KRAS-mutasjon (20-30% av tilfellene) [13], [14], etterfulgt i frekvensen av mutasjoner i EGFR-genet (10-20% av tilfellene) [13], [15]. Innenfor histologiske fenotyper, enkelte funksjoner ser ut til å være forbundet med spesifikke mutasjoner, for eksempel micropapillary aspektet ved adenokarsinom med BRAF V600-mutasjoner [16]. Selv om det er fordelaktig for pasienter med aktiverende EGFR mutasjoner for å motta EGFR TKI [2], [3], [17], [18], [19], i [8] i pasienter med andre typer av genetiske avvik denne behandling ikke effektiv. For eksempel, i en undersøkelse på pasienter med EML4-ALK trans en mangel på tumorrespons til EGFR TKI ble rapportert [20]. Men for NSCLC pasienter med KRAS-mutasjoner bevisene er mangelfulle. Flere studier viste en fullstendig mangel på respons på behandling med en EGFR TKI [17], [21], [22], en studie vist at NSCLC pasienter med tumorer som bærer KRAS-mutasjoner hadde et lignende utfall enten EGFR TKI eller kjemoterapi [3] . Tumorer med KRAS mutasjoner er blitt vist å ha dårligere resultat sammenlignet med pasienter med villtype KRAS (WT), både når det behandles med kirurgi [23] eller med kjemoterapi [24].
Formålet er å undersøke fordelingen av vanlige og sjeldne EGFR og KRAS-mutasjoner sendt fra 8 regionsykehusene til universitetet patologi avdeling. Kvaliteten på tumor biopsier sendes i for mutasjonsanalyse ble vurdert og mutasjonsstatus var relatert til behandling med EGFR-TKI utfallet.
Metoder
Pasienter
Denne undersøkelsen gjelder alle NSCLC tumorprøver fra åtte regionale nederlandske sykehus i perioden november 2008 til april 2011 som ble testet for mutasjonsstatus av en sentral patologi avdeling. Data om kjønn, røykestatus, alder ved diagnose, stadium ved diagnose, lokalisering av metastaser, startdato og (ulike) behandlingslinjer mottatt ble samlet. Tumorprøver ble oppnådd ved enten bronkoskopi, transtorakal lunge biopsi og /eller fra lunge resections og ble sendt til de respektive patologi avdeling for histologisk undersøkelse. Histologi var i henhold til 2004 WHOs kriterier [25]. Behandlingsrespons ble utført i henhold til RECIST kriterier [26].
Prøvetaking prosedyre og DNA-ekstraksjon
Fra hver formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE) svulstvev blokk som ble sendt til patologi avdeling 4 mikrometer seksjoner ble kuttet. Etter hematoxylin og eosin-farging, ble slides evaluert av et erfarent lunge patolog for tilstedeværelse av tilstrekkelig tumorvev og beregning av prosentandelen av tumorceller. Prøver med tydelig mindre enn 50% tumorceller ble definert som utilstrekkelig for EGFR /KRAS mutasjon testing. Områder med 50% tumorceller preget av patologen på lysbildet. Dette området ble skrapt fra sleiden ved hjelp av en skalpell og oppløst i TE-4 og 20 mg /ml proteinase K (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). DNA ble ekstrahert ved inkubering over natten ved 55 ° C, etterfulgt av oppvarming til 100 ° C i 5 minutter for å inaktivere proteinase K og sentrifugert ved romtemperatur ved 13 000 rpm. Den vandige oppløsning ble anvendt direkte for PCR-analyse eller lagret ved -20 ° C. DNA-konsentrasjonen ble målt på et spektrofotometer ND1000 (Nanodrop, Wilmington, DE, USA). Alle DNA-isolater ble satt til 10 ng /pl i TE-4 før bruk. For kvalitetskontroll, ble genomisk DNA amplifisert i en multipleks PCR som inneholder et kontroll-gen primersett som resulterer i produkter av 100, 200, 300, 400 og 600 bp i henhold til BIOMED-2-protokollen [27]. Kun DNA-prøver med PCR-produkter på 300 bp og større ble anvendt for mutasjonsanalyse. Alle prøver ble undersøkt på DNA ekstrahert fra to uavhengige glidere (duplikater). Alle standard forholdsregler ble tatt for å unngå forurensning av forsterkning produkter ved hjelp av egne laboratorier for pre- og post-PCR håndtering. For å unngå krysskontaminering, ble en ny mikrotom blad brukes hver gang en ny prøve ble seksjonert.
Enten direkte sekvensering eller høy oppløsning smelting (HRM) med bekreftende direkte sekvensering ble utført i henhold til protokollen. Identiske mutasjoner i forover og bakover sekvensering var nødvendig før et positivt resultat er rapportert. Protokollen er beskrevet i Vedlegg S1. Primere som brukes for direkte sekvensering eller HRM er beskrevet i supplerende tabell 1.
Informert samtykke og etikk
Når pasienter først besøkte poliklinikk, skriftlig informert samtykke for blod og tumorvev Det ble oppnådd for mutasjonsanalyse. EGFR og KRAS tester ble utført som en del av rutinemessige diagnostiske tilnærming og utfallet av disse testene ble dokumentert i pasientjournalen og kommunisert med pasienter. Fordi dette er en retrospektiv studie for å samle inn og analysere kliniske pasientdata, under nederlandsk lov for human medisinsk forskning (WMO), ingen samtykke var nødvendig fra medisinsk etisk komité. Data ble kodet og ikke spores til den enkelte pasient.
statistikker
Beskrivende statistikk ble utført for pasient- og kreftegenskaper. Frekvenser av vanlige og sjeldne mutasjoner ble ordnet. Hyppigheten av EGFR og KRAS-mutasjoner ble sammenlignet med tilgjengelige data på lungevev fra Katalog av somatiske mutasjoner i kreft database, (Cosmic DB, https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). Forholdet mellom tilstedeværelse eller fravær av mutasjoner og forekomsten av de fleste vanlige tumormetastaser ble bestemt ved anvendelse av tosidig Fisher eksakte test. For denne analysen pasienter med enten en EGFR eller en KRAS mutasjon ble sammenlignet med pasienter som ble scoret som både EGFR og KRAS WT. Total overlevelse (OS) ble beregnet fra datoen for å diagnostisere stadium IV sykdom før sensur eller død. Kun pasienter med tilgjengelige kliniske data som hadde kommet til stadium IV sykdom og senere ble behandlet ble inkludert for å overleve analyse. Alle pasienter som behandles med en EGFR TKI uavhengig av mutasjonsstatus ble evaluert for total overlevelse.
Univariat Cox regresjonsanalyse ble utført med kovariater alder, kjønn, histologi (tilstedeværelse av adenokarsinom, plateepitelkreft og store celle karsinom) KRAS og EGFR mutasjonsstatus, metastatisk hotellet (hjerne, bein, lunge) ble også analysert. Variabler med
p
-verdi mindre enn 0,20 ble brukt for den multivariate analysen.
All statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS versjon 18.0. Nominell
P
-verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
EGFR og KRAS-mutasjoner
Fra november 2008 til april 2011 474 prøver fra 442 pasienter ble sendt til sentral patologi avdeling for mutasjonsanalyse. Den mest vanlige histologisk klassifikasjon ble adenokarsinom (80%), 8% av prøvene kom fra histologiske subtyper ikke er forbundet med EGFR mutasjoner (tabell 1).
To hundre og tyve en pasienter (60,1% av alle testede pasientene 50% av alle pasienter) EGFR og KRAS WT. Tretti åtte pasienter (10,9% av alle testede pasientene, 8,6% av alle pasienter) hadde en EGFR mutasjoner (tabell 2). I 5 pasienter, 2 forskjellige EGFR mutasjoner sammenfalt i samme svulstvev som resulterer i totalt 43 mutasjoner. Tretti av 38 pasienter med EGFR mutasjoner (79%) var aktiverer EGFR mutasjoner. Kun en pasient hadde en T790M mutasjon i den primære tumor. TTF-1 positive adenokarsinomer viste en EGFR mutasjon oftere enn de som var TTF-en negativ (26/150 vs 1/50, Fishers eksakte to-sidig test,
p
= 0,01).
i alt 110 av pasientene (30% av alle testede pasientene, 24% av alle pasienter) hadde en KRAS mutasjon med G12C (41%) og G12V (18%) er de hyppigste mutasjoner og viser en lignende fordeling som i den kosmiske databasen (tabell 3). Vi har også funnet en (1%) sjelden KRAS mutasjon i kodon 13, (p.G13Y). I tillegg 2 pasienter hadde KRAS-mutasjoner utenfor hotspot (p.V14L og p.L19F), disse er ikke-fungerende. Dette betyr at i totalt 108 pasienter en funksjonell KRAS mutasjon ble detektert i vår kohort. Sammenligningen av mutasjons resultater i ulike undergrupper av NSCLC i vår befolkning er vist i tabell 4.
Kvalitet på tumorprøver for mutasjonsanalyse
syttifem tumorprøver ( (16%) var ikke tilstrekkelig for mutasjonsanalyse. etter 59 prøvene vev inneholdt mindre enn 50% tumorceller (for det meste på grunn av omfattende sammenblanding inflammasjon) og i 16 kvaliteten av DNA viste seg uegnet for mutasjonstesting. i fire av disse pasientene en tilstrekkelig vevsprøve ble gitt ved å re-biopsi. I løpet av 3 svulster ikke lenger mutasjonsanalyse ble utført (SCC /karsinoide). Dette betyr at fra 74 (75 + 3-4) (17%) av pasientene ikke noen resultater ble oppnådd fra mutasjonsanalyse. I totalt 345 pasienter tumorprøvene var tilstrekkelig for både EGFR og KRAS analyse. en enkelt KRAS eller EGFR mutasjonsanalyse ble utført i tumorprøver av 18 pasienter og 5, henholdsvis (figur 1).
* 2 KRAS-mutasjoner er utenfor hotspot, disse er trolig ikke funksjonelle.
EGFR og KRAS mutasjoner og metastaser distribusjon
Ved hjelp av kliniske data fra 303 pasienter, var vi i stand til å analysere preferanse for de kjente vanlige metastatiske regioner for pasienter med NSCLC med KRAS og EGFR mutasjonsstatus. Lunge knuter
(p
= 0,01), vertebral (
p
= 0,03) og andre bein metastasering (
p
= 0,04) ble identifisert til å være signifikant assosiert med EGFR mutasjoner . Ingen sammenheng ble funnet mellom EGFR mutasjoner og pleural (
p
= 0,15), cerebral (
p
= 1,0), lever (
p
= 0,46) eller adrenalin (
p
= 0,37) metastaserende lokaliseringer. Ingen av disse områdene var forbundet med KRAS-mutasjoner.
Survival analyse
I univariat analyse fra de kliniske data, stor celle histologi (HR 1.8, 95% CI., 01.02 til 02.08,
p
. 0,01) og ryggbeinmetastase (HR 1,5, 95% KI, 1,0-2,2,
p
= 0,05) var assosiert med en lavere overlevelse mens EGFR mutasjoner (HR 0,4, 95 .% KI, 0,2-0,7,
p
0,01) var assosiert med en bedre overlevelse. I en multivariat modell, histologi (stor celle karsinom, HR 2.2, 95% CI, 01.04 til 03.04,
p
. 0,01)., Spinal bein metastasering (HR 1.7, 95% CI, 01.02 til 02.06
p
. 0,01), og mutasjonsstatus (EGFR mutasjon, HR 0,3, 95% KI, 0,1-0,6
p
0,01) var signifikant assosiert med overlevelse. (Tabell 5).
Når du velger pasienter som fikk EGFR-TKI behandling i første eller andre linje, median total overlevelse etter starten av denne behandlingen ikke ble nådd hos pasienter med EGFR mutasjon (n = 14 ), 20 måneder (95% KI., 0-46, n = 14) for pasienter med KRAS-mutasjon, og 9 måneder (95% KI., 0-28, n = 31) for pasienter med EGFR /KRAS WT. (Figur 2A og 2B).
Rare EGFR og KRAS mutasjoner og respons på behandling
Mutasjoner som ikke tidligere er beskrevet i COSMIC DB er beskrevet i tabell 6. Behandling med en EGFR TKI hos pasienter med disse sjeldne EGFR mutasjoner førte ikke til klinisk nytte bortsett fra i en pasient som også hadde en ekstra aktiverende EGFR mutasjon.
Diskusjoner
EGFR er en celle overflateprotein som fører til aktivering av proliferasjon og invasjon via forskjellige signaloverføringsveier [28]. KRAS er et nedstrøms mål av EGFR. Aktiverende eller sensitiverende mutasjoner forårsaker en konstitutiv aktivering av tyrosinkinase-domene av EGFR-protein, ved å destabilisere autoinhibiting konformasjon [29]. EGFR TKI som gefitinib har økt bindende evner for disse mutante proteiner. Prosenter av denne økte bindingsevnen er opp til 100 ganger sammenlignet med villtype EGFR protein [29].
De to vanligste allergifremkallende EGFR mutasjoner til EGFR-TKI, i ramme sletting av ekson 19 og L858R mutasjon , [19], [30], [31], [32], [33] representerte over halvparten av EGFR mutasjons pasienter. Andre sensibiliserende avvik ble funnet hos tre pasienter som har en G719X mutasjon og i en annen pasient en L861R mutasjon [33], [34], [35]. Vi observerte 5 sjeldne eller tidligere ubeskrevne mutasjoner (tabell 2) og har preget deres reaksjon på TKI behandling (tabell 6). Av spesiell notatet er det p.D770GY mutasjon, som ble funnet hos to pasienter, med forskjellige svar. Den første av disse pasientene hadde en kombinasjon av p.D770GY og en p.G719C mutasjon, mens den andre hadde bare en p.D770GY mutasjon. Den første pasienten svart på EGFR TKI og forblir sykdom gratis etter 15 måneder mens pasienten uten sekundær mutasjonen hadde progressiv sykdom diagnostisert på 4 uker. Tidligere 2 tilfeller av denne mutasjonen ble beskrevet uten informasjon om tumorrespons [36], [37]. Våre data antyder at den p.G770GY mutasjonen ikke gir fordeler for EGFR-TKI behandling. Videre har vi vist at også pasienter med en av de andre 4 sjeldne EGFR mutasjoner (p.K708N, p.G709_T710 M, p.L833F og p.A840T) hadde ingen nytte av EGFR-TKI
Small. tumorprøver hovedsakelig fra bronkoskopi eller transtorakal kjerne biopsier kan være et problem for tilstrekkelig mutasjonstesting. Vi identifiserte årsaker til at mutasjonsanalyse på vår lab var ikke mulig i 17% av pasientene. Dette var enten på grunn av utilstrekkelig antall av tumorceller (12%) eller på grunn av utilstrekkelig DNA-kvalitet (4%) fremhever behovet for tilstrekkelig tumorvev seleksjon for mutasjonsanalyse. Retrospektive studier hvor langvarig arkivert parafin innleiret vev ble anvendt for å bestemme status EGFR viste en lav andel av tilstrekkelig tumorvev tilgjengelige [1], [2], [3], [4], [5], [6]. En måte å få flere kreftceller er ved gjentatte biopsier eller cryobiopsies [38]. Nye teknologiske utviklingen er mye mer sensitiv enn tidligere, slik at færre tumorceller både kvalitativt (%) og kvantitativt (absolutte tall) som kreves for å detektere mutasjoner. Imidlertid, når det gjelder tumor heterogenitet, havner den økte følsomheten en økt risiko for utvalgsfeil og påvisning av mindre kloner som kan være mindre relevante for terapi. En studie viste at om lag to tredjedeler av alle somatiske mutasjoner syntes ikke å være synlig på tvers av alle tumor region [39].
EGFR mutasjoner skjedde oftest i TTF-en positiv adenokarsinom. To nyere studier viste denne cellen avstamning forening [40], [41]. Funksjonelt, TTF-en indusert ROR-en er nødvendig for å opprettholde EGFR signalveien i lunge adenokarsinom cellelinjer [42].
Vi identifiserte preferanse for EGFR muterte tumorer å spre seg til intrapulmonal og til både vertebra og andre bein lokaliseringer. Dette i motsetning til en studie av Doebele et al, som observerte bare en preferanse for levermetastatisk spredning i EGFR muterte tumorer [43] .I kontrast, observerte vi den typiske miliær mønster av svulster med EGFR ekson 19 sletting som beskrevet tidligere [44]. Våre resultater for KRAS muterte tumorer (71 pasienter) var som tidligere beskrevet av Doebele et al (49 pasienter) [43].
I vår befolkning utfallet av pasienter med KRAS mutasjon reagerte på samme måte som KRAS WT både med hensyn til kjemoterapi og til EGFR-TKI. Tidligere ble det vist at pasienter med KRAS villtype har et bedre resultat enn pasienter med KRAS mutasjoner når de ble behandlet med en EGFR TKI [22]. Andre studier viste tilstedeværelse av KRAS-mutasjoner i lungekreft for å være en indikasjon på dårligere utfall, uavhengig av behandlingen de fikk [45], [46]. I TITAN studien, var det noen bevis for en høyere risiko for død i KRAS muterte kreftpasienter behandlet med erlotinib sammenlignet med kjemoterapi men det var ingen forhøyet risiko for tumorprogresjon [4]. I vår studie fant vi ikke bassenget de EGFR mutasjonspositive pasienter med EGFR /KRAS WT når man sammenligner disse pasientene med KRAS muterte pasienter. Som pasienter med EGFR mutasjoner tendens til å ha bedre resultater deretter EGFR WT pasienter, kan dette forklare våre resultater.
I konklusjonen, vi fant i 10,9% og 30% av alle de testede pasientene en EGFR eller KRAS mutasjon, henholdsvis . Vi identifiserte også 5 nye eller sjeldne EGFR mutasjoner og to nye KRAS-mutasjoner i vår befolkning. Sytten prosent av pasientene hadde utilstrekkelig svulstvev å utføre mutasjonsanalyse, hovedsakelig på grunn av utilstrekkelig tumor volum og /eller prosentandel. Det var ingen forskjell i total overlevelse etter start EGFR-TKI hos pasienter med KRAS-mutasjon og EGFR /KRAS WT.
Hjelpemiddel Informasjon
Vedlegg S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0070346.s001 plakater (DOC)
Takk
Vi er takknemlige til Klaas Kooistra, Erik Nijhuis, Anke van de Berg for innsatsen til EGFR mutasjon analyse og Roel Soesbeek for å hjelpe med innsamling av data.
