Abstract
Tumor utvikling er ledsaget av en kompleks rekke systemisk respons, som inkluderer inflammatoriske og angiogene reaksjoner. Begge tumor-avledet og systemisk respons proteiner blir påvist i plasma fra cancerpasienter. Imidlertid, gitt deres ikke-spesifikk natur, kan systemrespons proteiner forvirre deteksjon eller diagnose av neoplasi. Her har vi brukt en grundig kvantitativ proteomikk tilnærming til å analysere plasmaprotein endringer i musemodeller av subakutt irriterende drevet betennelse, autoreaktive betennelse, og matrise assosiert angiogenese og sammenlignet resultatene til tidligere beskrevet funn fra musemodeller av polyoma midtre T-drevet brystkreft og Pdx1-Cre Kras
G12D Ink4a /Arf
Lox /lox indusert kreft i bukspyttkjertelen. Blant de confounding modeller, ca 1/3 av alle kvantifiserte plasmaproteiner viste en betydelig endring i overflod i forhold til å styre mus. Av de proteinene som forandret i overflod, de fleste var unikt for hver modell. Endrede proteiner inkludert de som er involvert i akutt fase reaksjon, betennelse, ekstracellulære matrise ombygging, angiogenese, og TGFfi signalering. Sammenligning av endringer i plasmaproteiner mellom confounder modeller og de to kreft modeller avslørt proteiner som er begrenset til kreftbærende mus, reflekterer kjent biologi av disse svulstene. Denne tilnærmingen gir et grunnlag for å skille mellom protein endringer i plasma som er kreft-relaterte og de som er en del av en ikke-spesifikk vertsrespons
Citation. Kelly-Spratt KS, Pitteri SJ, Gurley KE, Liggitt D, Chin A, Kennedy J et al. (2011) Plasma Proteome Profiles er forbundet med betennelse, angiogenese, og kreft. PLoS ONE 6 (5): e19721. doi: 10,1371 /journal.pone.0019721
Redaktør: Pierre Bobe, Institut Jacques Monod, Frankrike
mottatt: 11. desember 2010. Godkjent: 14 april 2011; Publisert: 12. mai 2011
Copyright: © 2011 Kelly-Spratt et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Paul G. Allen Family Foundation, de NCI mus modeller av kreft hos mennesker Consortium (MMHCC) program og Canary Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den effektive behandling av kreft er avhengig av en korrekt diagnose ved det tidligste stadium av sykdommen og prognosen er betydelig forbedret dersom kreft blir oppdaget tidlig [1]. Blodbaserte tester for tidlig deteksjon av kreft er ideelle, gitt at blodet trekker er billig, minimal invasiv, og rutine i klinisk praksis. Mens begrepet en blod-basert kreft test er enkel, har sin søknad vært utfordrende, til det punktet at svært få nye kreft biomarkører er FDA godkjent de siste årene [2]. Videre er de for tiden i bruk, slik som CA 125 og PSA for ovarian og prostatakreft henholdsvis, er i det vesentlige begrenset av høye falske positive og over-diagnose [3], [4]. En stort hinder for utvikling av nye blodbaserte biomarkører har vært den tekniske utfordringen med avhør plasma proteomet [5]. En annen hindring har vært valg av sak /kontroll sammenligninger i biomarkører [6]. Nivåer av kandidat biomarkører fra kreftpasienter er ofte sammenlignet med friske individer. I disse studiene, er det vanskelig å kontrollere for genetisk eller miljømessige variabler, så vel som ikke-kreft «bakenforliggende» forhold. For eksempel, betennelse og angiogenese er kjennetegnene ved kreft, men også forekomme ved infeksjoner, kroniske betennelser, auto-reaktivt sykdommer og andre forhold som ikke er spesifikke for kreft [7]. Mens noen biomarkør studier har brukt inflammatoriske tilstander som kontroller [8], [9], dette er ikke unngå behovet for å bestemme omfanget av proteiner som forekommer med inflammatoriske tilstander. Det faktum at mange kandidat kreft biomarkører mangler tilstrekkelig spesifisitet å være nyttig argumenterer for en ny tilnærming [1], [6].
Betennelse og angiogenese spiller viktige roller i alle stadier av kreft progresjon, inkludert startfasen , vekst og metastatisk spredning. Faktisk, kroniske inflammatoriske tilstander er sterke risikofaktorer for kreft [10]. Betennelse oppmuntrer og fremmer kreftutvikling ved å forårsake celle og genom skade, stimulere celle omsetning via cytokiner og vekstfaktor utgivelse, og skape en vev mikromiljø som kan forbedre invasjon, migrasjon og angiogenese. Til slutt, immunsystemet styrer også kreft progresjon gjennom immunosurveillance og immunoediting [11]. Betennelse er en kompleks prosess som vedtatt av verten for å kontrollere vevsskade mot sykdomsfremkallende, traumatiske eller toksiske skader og er generelt kategorisert i en akutt, rask respons, en sub-akutt overgangsfase, og en vedvarende men langsomt utvikler kronisk tilstand. Den akutte inflammatoriske respons innebærer en rask levering av blodkomponenter, plasma, neutrofiler, og leukocytter til stedet for infeksjon eller skade, etterfulgt av en strøm av makrofager for å løse og reparere skaden [12]. Akuttfaseproteiner finnes i plasma, er definert som enten positiv eller negativ avhengig av om de øker eller reduseres i løpet av en inflammatorisk lidelse. Ved en akutt inflammatorisk reaksjon ikke løser skaden, er en overgang gjort til et utviklende subakutt trinn, og deretter til en kronisk inflammatorisk tilstand. Kronisk inflammasjon, såsom den som er sett i enkelte autoreaktive forhold, kan være «aktive». Dette er karakterisert ved vev-omforming, makrofager, T- og B-celler, angiogene og andre faktorer. Kronisk betennelse kan i sin tur føre til overdreven vevsskade, immun deregulering, og autoimmunitet [10], [13].
Angiogenese, spirende av nye blodkar fra allerede eksisterende blodkar, er nødvendig for å gi oksygen og andre næringsstoffer for å støtte tumorvekst; og graden av vaskularisering er en prognostisk faktor som korrelerer med tumor aggressivitet [14]. Imidlertid er angiogenese også assosiert med ikke-cancerøse tilstander som sårheling, vevsreparasjon, reumatoid artritt og andre kroniske inflammatoriske sykdommer [15]. Således, inflammasjon og angiogenese er intimt involvert i kreft, så vel som andre vanlige patologier. Disse forholdene utløse komplekse og dynamiske systemiske responser, men omfanget av overlapping mellom den systemiske responsen til kreft og ikke-kreft tilstander er i stor grad ukjent.
For å karakterisere systemisk respons til kreft og betennelser, søkte vi plasma proteomikk til musemodeller av subakutt inflammasjon, kronisk inflammasjon, og angiogenese. Musemodeller vinne noen viktige hindringer for biomarkører, inkludert utvikling av ny teknologi [16]; mer nøyaktig tilpassing av saker og kontroller for å redusere genetisk, alder og miljømessige variabler; avhør de dynamiske endringer i plasma proteomet gjennom sykdomsprogresjon; og integrere resultatene med de omfattende biologiske kunnskapsbaser [17]. Carrageenan injeksjoner ble brukt til å modellere subakutt inflammasjon [18]. Denne modellen representerer en subkutikulær respons på utvikling lokal irritasjon og nekrose i likhet med hva som kan bli sett på følgende tumor nekrose. For kronisk betennelse, vi utnyttet en kollagen-indusert modell av leddgikt [19]. Denne modellen er forbundet med antigen-antistoffkomplekser, i samsvar med en auto-reaktivt lesjon, med infiltrasjon av mononukleære celler, benremodelleringen, fibroplasi og vaskulær vekst som omgir skjøten. FGF-injeksjoner ble brukt for å stimulere angiogenese, noe som resulterer i hurtig i-veksten av blodkar og støtte stromale elementer [20].
Et stort antall plasmaproteiner endret i overflod i hver modell, som gjenspeiler den komplekse biologi av hvert betingelse. Disse plasmaprofilene ble sammenlignet med de som tidligere er identifisert i to godt karakteriserte musemodeller av pankreatisk [21] og brystkreft [22]. I brystkreft modellen, er oncoproteinet polyoma midtre T-antigen (PyMT) drevet av MMTV LTR, og er begrenset til den brystepitel. Disse musene utvikler karsinomer som ligner human brystcancer, og som er assosiert med leukocyttinfiltrering og påfølgende lungemetastase [23]. Utvikling av kreft i bukspyttkjertelen i Pdx1-Cre Kras
G12D Ink4a /Arf
Lox /lox modell innebærer progresjon fra bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi (PanINs) til bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC), trofast rekapitulere den menneskelige sykdommen [24]. Her viser vi at flertallet av plasma endringer protein som er identifisert i disse tumormodeller var unike for hver modell og ikke sett i konfunderingsfaktoren modellene. Videre er mange av disse proteinene har kjent rolle i progresjon av kreft. Identifiseringen og karakteriseringen av proteinprofiler assosiert med kreft i forhold til ikke-kreft patologier kan brukes til å forstå den komplekse biologi av vertsrespons til kreft og for å prioritere kandidat biomarkører som er forbundet med kreft.
Materialer og Metoder
dyre~~POS=TRUNC studier~~POS=HEADCOMP
dyre~~POS=TRUNC studier~~POS=HEADCOMP ble utført under IACUC forskrifter som er godkjent av FHCRC bruk dyret komité (Protocol # 1311). Ti hunn FVB mus ble benyttet for hver tilstand sammenkoblet med ti kull ubehandlede kontroller. For å modellere akutt betennelse som går over til subakutt inflammasjon, anvendte vi en velkjent pro-inflammatorisk irritasjons, karragenan, et karbohydrat avledet fra tang [18]. Dette ble levert via en svamp implantat som opprettholder karragenan utgivelsen og bidrar en klassisk fremmedlegeme respons. 10 x 10 mm kirurgiske svamper ble injisert med 1% karragenan (Sigma C1867-5G) og implantert subkutant i høyre flanke. Plasma ble oppsamlet ved hjertepunksjon 3 uker senere. Plasmaproteinene identifisert fra disse musene bør tilsvare et sent stadium subakutt respons på karrageenan og tilhørende svamp innvirkning, snarere enn til initiering av den akutte betennelsesreaksjon som inntreffer i løpet av 72 timer. For å evaluere den proteinprofil som er assosiert med kronisk inflammasjon, vi brukte en kollagen-induserte artritt musemodellen [19]. Bovint kollagen type II (CII) (BD Biosciences, San Jose, CA) ble emulgert med Freunds fullstendige adjuvans (Pierce, Rockford, IL) ved en sluttkonsentrasjon på 4 mg /ml og en total på 0,1 ml ble injisert intradermalt nær bunnen av halen. Dette resulterer i utvikling av kronisk leddgikt i bakpotene innen 14-21 dager. Musene ble overvåket hver 2-3 dager for utvikling og progresjon av artritt og plasma samlet inn ved utvikling av svellede bakpoter etter 4 uker. For å modellere angiogenese, Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) pluss FGF (500 ng /ml) (Invitrogen, Carlsbad, CA) ble injisert subkutant i høyre flanke som resulterer i hurtig i-veksten av blodkar og bære stromale elementer, men med lite assosiert betennelse [20]. Plasma ble samlet 3 uker senere. For disse modellene, ble blod fra eksperimentelle og kontroll mus innsamlet av hjertestans punktering, ved hjelp av en 1 cm
3 sprøyte og en 23 g nål, og plassert i en K3-EDTA rør (Webster Veterinary Supply, Sterling, MA) [17 ]. Plasma ble isolert ved sentrifugering ved 2000 x g i 5 minutter og alikvoter overføres til cryovials og frosset ved -80 ° C.
Prøvetaking for bukspyttkjertelen [21] og bryst [22] kreft musemodeller har vært tidligere rives. Kort fortalt ble mus for kreft i bukspyttkjertelen proteomikk analyse oppnådd ved avl Pdx1-Cre
Ink4a /Arf
Lox /lox og
Kras
G12D
Ink4a /Arf
lox /lox mus. Eksperimentell Pdx1-Cre
Kras
G12D
Ink4a /Arf
Lox /lox mus og kontroll
Kras
G12D
Ink4a /Arf
Lox /lox og Pdx1-Cre
Ink4a /Arf
Lox /lox mus ble ofret på 5,5 og 7 ukers alder. For både case og kontroll mus, ble dødelige Comas indusert ved å injisere mus i.p. med en 0,6 til 0,8 ml 5% Avertin (2,2,2-Tribromoethanol, Sigma). Denne forskjellen i eutanasi metode introduserer et potensial, men sannsynligvis mindre, forbeholdet når man sammenligner bukspyttkjertelen modeller til de andre modellene. En 1-ml sprøyte med en 22 g nål ble anvendt for hjertepunktering for å få blod. Blod ble plassert i K3-EDTA-rør (Fisher) og sentrifugert ved 4 ° C i 5 min ved 3000 rpm. Plasma ble fjernet og lagret ved -80 ° C.
For brystkreft mus modell, transgene FVB /N-Tg (MMTV-PyVT) 634Mul /J (PyMT) mus ble oppnådd fra National Cancer Institute og oppdrettet i-huset for å få plasmaprøver fra tumorbærende mus og kontrollkullsøsken på to tidspunkter av brystkreft utvikling. PyMT heterozygote menn ble krysset til FVB villtype kvinner å generere kohort av PyMT heterozygote og vill-type kvinner for studien. For å unngå skjevhet ble PyMT transgene og kontroll mus koblet sammen på avvenning og ble matchet med hensyn til alder, kull, og bur. Alle mus ble matet standard chow (Harland Tekland, 8664) og forsurede vann
ad libitum Hotell og holdt på en 12 timers lys-mørke-syklusen. Begynnelsen på 5 ukers alder, ble musene palpated annenhver dag for å oppdage brystkreft tumorvekst. Brysttumorer ble tillatt å utvikle seg til enten 0,5 eller 1 cm i diameter, hvoretter hver tumor-bærende mus, og en kontroll ble avlivet back-to-back på samme dag med CO
2 innånding. Blod ble oppnådd ved hjertepunktering, og plasma ble isolert og lagret som beskrevet for inflammasjon og angiogenese-musemodeller.
Immunodepletion av rikelige proteiner og isotopisk merking
50 pl av plasma fra 5 mus ble oppsamlet for hvert sett av saks og kontrollprøver. Pools ble immunodepleted av de tre mest tallrike proteiner (albumin, IgG og transferrin) med en MS-3-kolonne (4,6 x 10 mm, Agilent). Den immunodepletion Kolonnen ble ekvilibrert med buffer A ved (0,5 ml /min) i 13 min, og alikvoter av oppsamlet sera ble injisert etter filtrering gjennom et 0,22 um sprøytefilter. Gjennomstrømnings fraksjoner ble samlet i 10 minutter ved en strømningshastighet på buffer A på 0,5 ml /min, kombinert og lagret ved -80 ° C. Kolonnen bundet materiale ble gjenvunnet ved eluering i 8 minutter med buffer B ved 1 ml /min. Deretter ble immunodepleted prøvene konsentrert ved bruk av Centricon YM-3-enheter (Millipore Corp, Bedford, MA), og re-fortynnet i 8 M urea, 100 mM Tris pH 8,5, 0,5% OG (oktyl-beta-D-glukopyranosid, Roche). Etter tømming og buffer utveksling, ble proteinkonsentrasjonen bestemt ved Bradford analyser: angiogenese 2,5 mg (case) og 3,8 mg (kontroll), kronisk betennelse 4,3 mg (case) og 3,8 mg (kontroll) og akutt betennelse 2,8 mg (case) og 3,1 mg (kontroll), og hele mengden av protein for hver prøve ble anvendt for etterfølgende akrylamid merking. Prøvene ble redusert med DTT (0,66 mg DTT /mg protein), og isotopisk merking av cysteinrester i intakte proteiner ble utført. Kontrollprøver ble merket med lys 12C akrylamid isotop (7,1 mg /mg protein) (mer enn 99,5% renhet, Fluka), og eksperimentelle prøver ble merket med den tunge 13C-akrylamid isotop (Cambridge Isotope Laboratories, 7,4 mg /mg protein) for 1 time ved romtemperatur. Bassenger av kontroll og eksperimentelle prøver ble deretter kombinert for intakt protein separasjon.
Intakt protein separasjon
De kombin isotopically merkede prøver ble atskilt med en automatisert online 2D-HPLC system styrt av Workstation Klasse-VP 7,4 (Shimadzu Corporation). De kombinerte, merkede plasmaprøvene ble separert i den første dimensjon på en anionbytterkolonne (Poros HQ /10, 10 mmID x 100 ml, Applied Biosystems) under anvendelse av en 8-trinns-eluering (fra 0 mM NaCl til 1000 mM NaCl) ved 0,8 mL /min. Fraksjoner fra hver av de 8 anion-utvekslings separering eluering trinn ble automatisk overført til en reversfasekolonne (PorosR2 /10, 4,6 mm ID x 100 ml, Applied Biosystems) for en andre dimensjon av separasjon. En 25 min gradienteluering (fra 5% til 95% mobil fase B) ble anvendt ved 2,4 ml /min. 3 fraksjoner ble samlet pr minutt, med hver fraksjon inneholdt 800 uL. 576 reversert fasefraksjonene ble oppsamlet i totalt (8 anionbyttermedier fraksjoner hver delt opp i 72 reversfasefraksjonene). Mobilfase A for anionbytterkromatografi besto av 20 mM Tris (Sigma), 6% isopropanol (Fisher), 4 M urea, pH 8,5 og mobilfase B var den samme sammensetning og pH-verdi som A med 1 M NaCl (Fisher) tilsettes . Mobilfase A for reversert-fase-kromatografi bestod av 95% vann, 5% acetonitril, 0,1% TFA (Supelco), og mobil fase B bestod av 90% acetonitril, 10% vann, 0,1% TFA.
Masse spectrometry analyse
i-løsning fordøyelsen ble utført med lyofiliserte alikvoter fra reversert-fase (andre dimensjon) fraksjoneringstrinn. Proteiner i de enkelte fraksjoner ble resuspendert i 0,25 M urinstoff (Fisher) inneholdende 50 mM ammoniumbikarbonat og 4% acetonitril og deretter digerert natten over med 200 ng av modifisert trypsin (Promega) ved 37 ° C. De resulterende peptidblandinger ble surgjort med 5 ul av 1% maursyre. Aliquoter ble underkastet massespektrometri hagle-analyse etter sammenslåing av flere på hverandre følgende fraksjoner (proteinkonsentrasjon estimert ved UV-sporet). 12 bassenger av individuelle reversfasefraksjonene for hver av de åtte anionbyttermedier trinnene ble opprettet ved å kombinere følgende sekvensielle fraksjoner: 1-22, 23-24, 25-26, 27-28, 29-30, 31-32, 33 -34, 35-36, 37-38, 39-40, 41-42, og 43-72. 96 Fraksjonene ble analysert for hvert eksperiment ved en LTQ-Orbitrap (Thermo) massespektrometer koblet med en NanoLC-1D (Eksigent). Den væskekromatografi separasjon ble utført i en 25 cm kolonne (Picofrit 75 um id, nye mål, pakket i huset med MagicC18 harpiks) ved anvendelse av en 90 min lineær gradient fra 5 til 40% av acetonitril i 0,1% maursyre i 300 nl /min for hagle analyse. Omtrent 10 ug protein ble injisert per fraksjon. Spectra ble kjøpt i en dataavhengig modus i
m Twitter /
z
rekke 400-1800, inkludert valg av de 5 mest tallrike enn 2 eller +3 ioner av hvert MS spekteret for MS /MS-analyse. Massespektrometer parametere var kapillær spenning på 2,0 kV, kapillær temperatur på 200 ° C, oppløsning på 60 000, og målet verdi på 1.000.000.
Databehandling
Kjøpte data ble automatisk behandlet av Computational Proteomikk Analysis System (CPAS) [25] rørledning med X! Tandem søkealgoritme [26] konfigurert med kometen poengsum modul plug-in. PeptideProphet [27] og ProteinProphet [28] ble brukt til validering av søkeresultater og protein slutning. Kvantifisering ble utført ved hjelp av Q3 kvantifisering verktøy [29]. Tandem massespektra ble søkt mot versjon 3.48 av musen IPI databasen [30]. Alle identifikasjoner med PeptideProphet sannsynlighet større enn 0,2 ble sendt til ProteinProphet, og de påfølgende protein identifikasjoner ble filtrert på et minimum 5% feilrate. For kvantifisering, ble forholdene for proteiner beregnet ved hjelp av bare de peptider oppnå PeptideProphet sannsynligheten for minst 0,75. Protein grupper tildelt av ProteinProphet ble kombinert med felles gen symbol og heretter referert til som «protein». Case /kontrollforhold for hvert protein ble beregnet ved å ta gjennomsnittet log2 forholdstall på tvers av alle peptider som er tilordnet til proteinet. Over 1.000.000 MS /MS-spektra ble oppsamlet og proteiner med 2289 unike genet navn ble identifisert på tvers av 3 eksperimentelle modeller.
Statistisk signifikans av protein kvantifisering ved massespektrometri ble bestemt ved to metoder. For proteiner med multippel sammenkoblet MS arrangementer av tung- og lett-akrylamid, ble en en-prøve t-test benyttet for å beregne en p-verdi for det midlere forhold av hele proteinet i alle fraksjoner. For det andre, ble sannsynligheten for at forholdet for hver enkelt hendelse MS beregnet ut fra fordelingen av forholdene i en kontroll-kontrollforsøk hvori den samme prøven ble delt og merket med tung og lett akrylamid. Dersom p-verdien for hver enkelt hendelse var 0,05, ble proteinforholdet vurdert statistisk signifikant
Nettverk analyse
De økte og reduserte proteiner identifisert fra IPAS analyse ble brukt for biofunction. og sti analyse ved hjelp av oppfinnsomhet pathway Analysis (IPA) Programvare (Oppfinnsomhet Systems, Mountain View, California). IPA database består av proprietær ontologi som representerer 300.000 biologiske gener, proteiner og molekylære og cellulære prosesser.
Enzyme linked immunosorbent (ELISA) analyser
Plasmanivåer av PF4, IGF1, Igfbp5, og Lcn2 ble målt ved hjelp av kommersielt tilgjengelige muse DuoSet kits hentet fra R 0,05), og av disse, to til tre ganger så mange ble redusert i motsetning til økte i alle tre modellene (tabell 1, fig S1). Når vi betrakter bare proteiner kvantifiseres i alle tre musemodeller, sammenligning av plasmaprofiler mellom modellene viste en 35% overlapping i endrede proteiner mellom subakutt og kronisk inflammasjon modeller, sammenlignet med bare en 15% overlapping mellom inflammasjonsmodeller og angiogenese modellen ( tabell 1). På grunn av begrenset sampling av massespektrometeret, ble et antall proteiner ikke kvantifisert i alle tre musemodeller. Når vi ikke krever proteiner som skal kvantifiseres i alle tre musemodeller, overlappingen av opp- og ned-regulert proteiner er vist i figur 1A og 1B henholdsvis. Sammenligninger av endringer i proteinnivåer for hver modell viste en sterk korrelasjon mellom subakutt og kronisk inflammasjon, med en Pearson test poengsum på 0,67 (figur 1C), mens sammenligninger av hver betennelse modellen til angiogenese-modellen viste mindre enn 50% korrelasjoner (Pearson test scorene til 0,49 og 0,31, henholdsvis). Dermed plasma profiler var mer lik mellom betennelse modeller enn mellom angiogenese og enten betennelse modell, noe som reflekterer den underliggende biologi av disse forholdene. Videre er de fleste av endrede proteiner var unike for hver confounder modell, som viser biologisk spesifisitet. De relative Forekomsten av de individuelle proteiner identifisert i hver av de tre modellene er oppført i tabell S1.
Venn-diagrammer sammenligne (A) økt, og (B) redusert proteiner i plasma fra subakutt og kronisk betennelse og angiogenese modeller sammenlignet med kontrollmus. Diagrammene viser antall proteiner, enten forhøyet eller redusert i hver modell, og som er unike eller deles mellom hver av de 3 modeller. Flertallet av enten økes eller reduseres proteiner var unike for hver modell. (C) Korrelasjon tomter for kvantifiserte proteiner. Case /kontroll (log2) forholdstall for hvert kvantifisert protein er plottet på X- og Y-aksene. Tomtene reflektere overflod forskjeller i spesifikke proteiner mellom to modeller. Proteomikk sammenligninger mellom kronisk versus subakutt inflammasjon sammenligning er mer lik (R = 0,67) enn er sammenligninger mellom enten betennelse modellen og angiogenese modellen (R = 0,49 og 0,31, henholdsvis).
Vi sammenlignet proteomikk profiler av disse konfunderende modeller til tidligere oppnådde profiler fra tidlig og sent stadium brystkreft [22], og til profiler fra tidlig stadium (PanINs) og sent stadium (PDAC) bukspyttkjertelkreft [21]. I motsetning til de confounder modellene, ble et omtrent likt antall proteiner økes og reduseres i tumorbærende mus sammenlignet med ikke-tumorbærende mus (Tabell 2). Av disse endrede proteiner, det store flertallet ( 75%) ble ikke endret i confounders (tabell 2). Tre mønstre av plasmaproteinfordeling ble observert: økt i både confounders og kreft modeller (Figur 2A), økte i confounders men uendret eller redusert i kreft (figur 2B), og redusert i confounders og økt i kreft (figur 2C). Bare 27% av proteiner med endrede nivåer i studien ble øket i både confounders og kreft, mens den største kategori, og utgjør 55% av totalen, besto av proteiner som ble redusert i confounders men økte i tumorbærende mus. Relative nivåer av representative proteiner som viser disse mønstrene er vist i figur 3. Note, lysyl- oksidase som en (Loxl1) og proteoglykan 4 (Prg4) er redusert i plasma fra confounders og økt både bryst og pankreatiske tumorbærende mus, mens fettsyre syntase (FASN) og lipocalin2 (Lcn2) er økt i både confounders og kreft modeller (tabell S1)
(A) Proteiner økt i både confounders og kreft modeller sammenlignet med kontroller ( . 1,25 ganger, p 0,05), (B) proteiner økt i confounders og redusert i kreftmodeller, og (C) proteiner redusert i confounders og økt kreft modeller (rød = opp, grønn = ned, svart = ingen endring, grå = ikke kvantifisert).
Tomter vise massespektrometri basert log2 sak /kontroll forholdstall for spesifikke proteiner i hvert confounder og kreft modell som viser differensial overflod mønstre. Loxl1 representerer proteiner som er redusert i confounders og forhøyede i kreft modeller. FASN viser høyde i alle modeller, men mer så i Panin. Prg4 er forhøyet primært i bukspyttkjertelkreft modell. Lcn2 er forhøyet i betennelser og i større grad i kreft modeller, men ikke angiogenese modell.
For å verifisere differensial overflod observert av massespektrometri, ELISA-analyser ble utført på valgt proteiner basert på kommersiell tilgjengelighet (PF4, IGF1, Igfbp5, og Lcn2) (figur 4). Legg merke til, insulinlignende vekstfaktor 1 (IGF1) og insulinlignende vekstfaktorbindende protein 5 (Igfbp5) ble redusert, eller uforandret i confounders men økte i brysttumorbærende mus. Lipokalin 2 (Lcn2) ble øket i alle modeller, men til et høyere nivå i tumorbærende mus, mens blodplatefaktor 4 (PF4) ble redusert i subakutt betennelse men økte i kronisk betennelse og kreft. Andre plasmaproteiner som spesifikt var økt i tumorbærende mus inkludert acetyl-CoA acetyltransferase 1 og 3, fettsyrebindende proteiner 1 og 4, fibulin, peroxiredoxins 1, 5 og 6, SPARC, og thrombospondins 1 og 4.
ELISA analyse av PF4, IGF1, Igfbp5, og Lcn2 som viser økt plasmakonsentrasjon i PyMT brysttumorbærende mus i forhold til enten subakutt eller kronisk betennelse mus. Plasma fra ubehandlet mus ble brukt som kontroll.
Plasma proteinforandringer observert med betennelse
Vi neste analysert de endrede plasmaproteiner fra hver confounder tilstand. I subakutt modell betennelse, større enn 50% av den økte proteinene spiller en rolle i inflammasjon kjent, blant annet positivt akuttfaseproteiner [31], så vel som de kjemokiner Ccl8 og PF4 (også kjent som Cxcl4) (tabell S1). Blant de reduserte proteiner var fem komplement-proteiner, så vel som utskilte signale proteiner som Rbp4, IGF1, Igf2, TGFp, og Pdgfb. Komplementkaskaden er viktig i den akutte fase respons, mens IGF1 og RB4 er negativt akuttfaseproteiner. Nettverk analyse bundet mange av proteinene med endrede nivåer på intracellulær (NF-kB) og utskilt (Il-1 og TGFp) immunsystem regulatorer (figur 5A, B) [10]. TGFp selv ble redusert, som var flere proteiner involvert i TGFp-signalering. Kollektivt, proteomikk analyse av plasma identifiserte kjente akuttfaseproteiner, proteiner knyttet til betennelses regulatorer som TGFB, og ekstra proteiner (f.eks cytoskeletal proteiner actins, cofilins, vasp, profilin, og destrin) som ikke tidligere er knyttet til betennelse (tabell S1).
Topp nettverk tildelt av Oppfinnsomhet Pathway Analysis for både økte og reduserte proteiner fra subakutt inflammasjon (A, B), kronisk betennelse (C, D) og angiogenese modeller (E, F). Nettverk for subakutt modell viser rikelig fibrinogen og ECM proteiner, gir kronisk modellen fremtredende vekstfaktor og kollagen nettverk, mens angiogenese nettverk viser chemokin og koaguleringsproteiner. [Red = økt, grønn = redusert, hvit = ingen endring i overflod i tilfeller vs kontroll mus, 1,25 ganger p. 0,05]
Som i subakutt inflammasjon modell, et betydelig antall. av proteiner økt i henhold til kronisk betennelse hadde kjent linker til betennelse. Spesielt, men færre akutt faserespons proteiner ble identifisert enn med subakutt modell (tabell S1). En annen stor kategori av proteiner endret med kronisk betennelse er involvert i ekstracellulære matrise ombygging (figur 5C). Mange av disse ble redusert og er mål for den MMP2 protease, som selv ble øket. Som i subakutt modell, TGFp og proteiner knyttet til regulering eller signale ble redusert, inkludert Ltbp1, Ltbp4, og Vasn (figur 5D).
Plasmaprotein signatur for angiogenese
Et betydelig antall av de endrede proteiner som er identifisert i den angiogene modellen har kjent mekanistiske linker til angiogenese og /eller uttrykkes i endotelceller, slik som thrombospondin 1 og 4, renin 1 og 2, blodplatefaktor 4, trekløverfaktor 1, og kollagenbindende protein 2, så vel som andre proteiner som ikke tidligere var knyttet til angiogenese. I tillegg, endringer i komplement-proteiner og koagulasjonsfaktorer, som har koblinger til angiogenese, ble observert (figur 5E) [32] [33].
