Abstract
kimlinje-mutasjoner i
FH
, genet som koder for den trikarboksylsyre TCA (TCA) syklus enzym fumarat hydratase, er forbundet med en arvelig form for kreft referert til som Arvelig Leiomyomatosis og nyrecellekreft (HLRCC). Personer med HLRCC er disponert for å utvikle svært ondartet og dødelig nyrecellekarsinom (RCC). Mekanismene for tumorigenesis forslag har i stor grad fokusert på de biokjemiske følgene av tap av FH enzymatisk aktivitet. Mens tap av tumorsuppressorgenet
von Hippel Lindau product: (
VHL
) er antatt å være en innledende hendelsen for de fleste av RCC, en rolle for
FH
i sporadisk nyrekreft har ikke blitt utforsket. Her rapporterer vi at FH mRNA og protein uttrykk er redusert i klarcellet nyrekreft, den vanligste histologiske variant av nyrekreft. Videre viser vi at redusert
FH
fører til opphopning av hypoksi induserbar faktor-2α (HIF-2α), en transkripsjonsfaktor er kjent for å fremme nyrekreftutvikling. Til slutt viser vi at overekspresjon av FH i nyrekreftceller hemmer cellemigrasjon og invasjon. Disse dataene gir ny innsikt i tumor suppressor funksjonene til FH i sporadisk nyrekreft
Citation. Sudarshan S, Shanmugasundaram K, Naylor SL, Lin S, Livi CB, O’Neill CF, et al. (2011) Redusert uttrykk for Fumarate Hydratase i Clear Cell Nedsatt Cancer formidler HIF-2α Oppsamling og fremmer migrasjon og invasjon. PLoS ONE seks (6): e21037. doi: 10,1371 /journal.pone.0021037
Redaktør: Marcelo G. Bonini, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 18 januar 2011; Godkjent: 17 mai 2011; Publisert: 14 juni 2011
Copyright: © 2011 Sudarshan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Kreft Therapy og Research Center (CTRC) ved University of Texas Health Science Center (National Institutes of Health P30 CA054174-17). SS støttes av NIH K08 CA138774, Voelcker Fund Young Investigator Award, AUA Foundation /Astellas Rising Star Award, og en spesiell gave fra Mr. Charles Butt og de ansatte i HEB. SLN støttes av CTRC og NIH U01 CA86402. LZS støttes av NIH R01 CA079683. KB er støttet av Veterans Administration Career Development Award (CDA-2) og NIH R01 NCI CA131272. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i 2010 vil mer enn 57 000 menn og kvinner bli diagnostisert med nyrecellekreft (RCC) og 13.000 personer vil dø av denne sykdommen [1]. Selv om overlevelse for pasienter med lokalisert sykdom er høy, pasienter med avansert sykdom overfor en dårlig prognose til tross for nylig innført målrettede midler. Selv om tap av
von Hippel Lindau product: (
VHL
) tumor suppressor genet er tenkt å være en innledende hendelsen for de fleste av RCC [2], er lite kjent om etterfølgende genetiske hendelser og deres respektive innvirkning på tumorigenesis. Opplysning av disse banene vil identifisere nye terapeutiske mål, samt legge til rette for utvikling av biomarkører som kan ha både diagnostisk og prognostisk betydning.
kimcellelinje mutasjoner av
FH
er forbundet med en arvelig form for nyrekreft henvist som Arvelig Leiomyomatosis og nyrecellekreft (HLRCC) [3], [4].
FH
koder for trikarboksylsyre syklusen enzym fumarat hydratase (også referert til som fumarase) som katalyserer hydratisering av fumaratet å danne malat. Personer med HLRCC er disponert for utvikling av leiomyomer i huden og livmoren, i tillegg til meget ondartet og dødelig RCC. Mekanismene for tumorigenesis forslag har i stor grad fokusert på de biokjemiske følgene av tap av FH enzymatisk aktivitet. Det er foreslått at tap av FH fører til fumarate opphopning og fremmer en pseudohypoxic tilstand der hypoksi svarveier er avvikende aktivert tross normoksisk forhold [5]. Fumarat har vist seg å hemme prolin hydroksylering av hypoksi induserbare faktorene HIF-1α og HIF-2α som er katalysert av en familie av enzymer referert til som HIF prolyl hydroksylasene (PHDS) [5]. I deres unhydroxylated form, HIFαs unngå gjenkjennelse av E3 ubiquitin ligase VHL (som er rettet mot disse proteiner for proteosomal degradering) og er således stabilisert [6], [7], [8], [9]. Under disse betingelser enten HIF-1α eller HIF-2α er i stand til å heterodimerize med konstitutivt uttrykte protein HIF-1β, også referert til som ARNT (nylig gjennom [10]). Denne hetero er i stand til å transcriptionally aktivere flere gener inkludert
VEGF Hotell og andre vekstfaktorer som kan være pro-tumorigen når dysregulerte. Pseudohypoxia har også vært innblandet i den mest vanlige varianten av RCC, klarcellet karsinom (ccRCC), hvor tap av
VHL
er et felles genetisk aktivitet [11]. Som forventet, er forhøyede nivåer av HIF-1α og /eller HIF-2α fremgår klart celle nyre-kreft [12], [13]. Interessant flere linjer av bevis indikerer at HIF-2α i motsetning til HIF-1α, er kritisk for RCC-dannelse og /eller progresjon [14], [15], [16].
VHL
tap er åpenbart kritisk for HIF-2α stabilisering, alternative mekanismer, foruten å hindre degradering, kan spille en rolle i opprettholdelsen av HIF-2α av nyrekreft. Tidligere arbeid med Block
et al.
Etablert en rolle for reaktive oksygenforbindelser (ROS) som genereres av NADPH oksidase i å opprettholde HIF-2α protein uttrykk gjennom en AKT avhengig mRNA translasjonsforskning mekanisme i VHL-mangel celler [17] . I tillegg har mTOR aliserte kompleks 2 (mTORC2), en kjent aktivator av AKT signalering, er blitt vist å fremme HIF-2α akkumulering i
VHL
null renale karsinomceller [18]. Mer nylig, behandling av RCC-celler med en dobbel PI3K /mTOR-inhibitor undertrykket ekspresjon av HIF-2α [19]. Disse dataene støtter forestillingen om at pågående HIF-2α syntese er kritisk til vedlikehold av denne onkogen transkripsjonsfaktor i nyrekreftceller.
FH
mutasjoner har først og fremst vært knyttet til papillær type II nyrekreft en histologisk variant som utgjør mindre enn 10% av alle nyre-kreft [20].
FH
mutasjoner har ikke blitt identifisert i sporadisk klart celle nyrekreft. Men en fersk rapport knyttet
FH
til utvikling av klarcellet nyrekreft hos en pasient med en germline mutasjon av
FH product: [21]. Til dags dato, uttrykk og funksjon av
FH
i ccRCC har ikke undersøkt. Derfor undersøkte vi hvilken rolle FH i sporadisk klart celle nyrekreft.
Resultater
Redusert uttrykk for FH i klarcellet nyrekreft
FH uttrykk i ccRCC har ennå bli utforsket. Derfor må vi først undersøkte protein uttrykk for FH i et panel av humane klart cellenyresvulster og pasient-matchet normal nyreparenchymet. Immunoblot-analyse av vev lysater viste en markant reduksjon av FH proteinnivåer i tumorer sammenlignet med normalt tilstøtende vev (figur 1A). For å bekrefte våre funn, utførte vi immunhistokjemisk farging for FH på pasient matchet tumor /normal par. Disse resultatene korrelerte med våre immunoblottingforsøk resulterer i at farging for FH var mindre i tumorer i forhold til kontroll nyrevev (figur 1B). Vi undersøkte neste FH proteinnivåer i et panel av etablerte ccRCC cellelinjer (786-O, A498, RCC4, og ACHN). Alle dyrkede cellelinjer viste reduserte FH protein nivå i forhold til normal nyre (figur 1C). Vi deretter undersøkt mRNA uttrykk nivåer av
FH
i svulstvev i forhold til pasient matchet normalt nyrevev i prøvene fra Cooperative menneskelig vev Network (NCI). Kvantitativ real time RT-PCR vist redusert
FH
mRNA nivåer i svulstvev sammenlignet med normalt vev (figur 2). Analyse av mRNA-nivåer viser at over 70% av tumorprøvene vist redusert
FH
mRNA-nivåer i forhold til normale matchet nyreparenchymet. Videre 15/32 pasientprøver (47%) viste større enn dobbelt reduksjon i
FH
mRNA-nivåer i tumorprøver i forhold til normal kontroll. Totalt var gjennomsnittlig reduksjon i
FH
mRNA nivåer var 2,9 ganger. Denne forskjellen var fast bestemt på å være statistisk signifikant. Disse resultatene viser redusert uttrykk for
FH
på mRNA og protein nivå i ccRCC.
A) Protein ble isolert fra klare celle (CC) tumorprøver (T) i tillegg til tilpasset normal nyrefunksjon parenchyma (N). Proteiner ble immunblottet for FH protein nivåer. GAPDH immunoblot inngår som en lasting kontroll. B) Immunhistokjemisk farging for FH ble utført på pasient matchet tumor /normal par. Bilder ble oppnådd med en 40 x objektiv. C) FH protein nivåer i RCC linjer i forhold til normal nyre. Actin inngår som en lasting kontroll.
mRNA nivåer av
FH
ble bestemt i et eget sett med tumorprøver i forhold til pasient matchet normal nyreparenchymet med real time RT-PCR ( p = 0,004). Expression nivåer ble normalisert til 18 s rRNA nivåer før komparativ analyse.
FH modulerer HIF-2α nivåer
Høye nivåer av fumarat i FH-mangel RCC spille en rolle i å stabilisere HIF -2α protein uttrykk gjennom hemming av prolin- aktivitet dermed hindre VHL anerkjennelse. Basert på disse dataene, hypotese vi at tap av FH bør ikke ha noen innvirkning på HIF proteinnivået i
VHL
null cellelinjer. Men vi fant ut at siRNA-mediert knockdown av FH resulterte i en ytterligere økning av HIF-2α protein nivåer i to ccRCC linjer som er
VHL
null (786-O og A498) (figur 3A). Til støtte for disse funnene, forbigående overekspresjon av FLAG-merket FH (FH-FLAG) redusert HIF-2α nivået i 786-O celler (Figur 3B). Sammen tyder dette på at FH modulerer HIF-2α protein uttrykk i fravær av VHL.
A)
VHL
null 786-O og A498 celler ble transected med siRNA til FH og krafse kontroll ( sinc). Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble proteinlysatene analysert ved immunblotting for de angitte proteiner. B) 786-O-celler ble transient transfektert med kontroll vektor (CV) og vektor som inneholder FLAG merket FH. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble proteinlysatene analysert ved immunblotting for de angitte proteiner. FLAG immunoblot indikerer vellykket ekspresjon av transgenet. C) (til venstre) 786-O celler ble stabilt transfektert med CV og FH-FLAG. Etter valget i puromycin ble enkeltcellekloner høstet og skjermet for FLAG uttrykk. HIF-2a nivåene ble målt i FH-FLAG uttrykke kloner i forhold til CV transfekterte celler. Densitometry av bandene er kvantitativt vises på høyre side. Mean relative verdier +/- standardavvik ble oppnådd med ImageJ programvare fra uavhengige forsøk.
For ytterligere å belyse den mekanismen som FH regulere HIF-2α protein uttrykk, vi skapt stabile cellelinjer overekspresjon FH-FLAG i VHL-mangel 786-O-celler. Vi identifiserte 3 kloner som stabilt uttrykte FH-FLAG konstruere. Alle 3 kloner vist redusert HIF-2α nivåer sammenlignet med kontroll vektor transfekterte celler (Figur 3C). Vi først vurderes om virkningene på HIF-2α ble transcriptionally mediert, men vi ikke oppdager reduksjoner i HIF-2α mRNA nivåer med FH overekspresjon (data ikke vist).
FH tap aktiverer AKT signale
Nye rapporter har impliserte PI3K /AKT signalering for å opprettholde HIF-2α protein uttrykk i
VHL
null-celler gjennom en translasjonell mekanisme [17], [18], [19], [22] _ENREF_17. Basert på disse rapportene, undersøkte vi AKT signale med FH modulering. Vi fant ut at siRNA-mediert knockdown av
FH
i både 786-O og A498 celler fører til økt AKT fosforylering på serin 473 av AKT (figur 4A). Tilsvarende overekspresjon av FH senket fosfo-AKT nivåer i 786-O celler (figur 4B) indikerer at FH nivåer inverst korrelert med AKT signalering. Vi neste undersøkte effekten av PI3K hemning på FH-avhengig HIF-2α proteinekspresjon. Konsistente med våre tidligere funn, FH knockdown aktivert AKT signalisering og økt HIF-2α nivåer i forhold til å rykke ut transfekterte celler (sinc) (Figur 4C). Imidlertid cotreatment av transfekterte celler med PI3K-inhibitoren LY-294002 blokkerte økningen i HIF-2α forbundet med FH knockdown (figur 4C). Sammen tyder dette på at FH opprett HIF-2α protein uttrykk gjennom mekanismer avhengig PI3K og AKT signalering.
A)
VHL
null 786-O og A498 celler ble transfektert med siRNA til FH og scramble kontroll (sinc). Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble proteinlysatene analysert ved immunoblotting for total AKT og ser473 fosfor-AKT. B) 786-O-celler ble transient transfektert med kontroll vektor (CV) og vektor som inneholder FLAG merket FH. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble proteinlysatene analysert ved immunblotting for de angitte proteiner. C) 786-O-celler ble transfektert med de indikerte siRNA. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble mediet fra cellene erstattet med media inneholdende PI3K inhibitor LY-294002 (6,25 uM). Cellene ble deretter høstet 24 timer senere og proteinlysatene ble utsatt for immunoblot analyse for de angitte proteiner.
FH uttrykk formidler celle migrasjon og invasjon
De biologiske konsekvensene av FH overekspresjon i RCC cellene ble deretter undersøkt.
FH
null svulster er svært invasiv og ofte metastatiske svulster [20], og HIF-2α har tidligere vært innblandet i denne cellulære prosessen [23]. Derfor, undersøkte vi rolle FH i cellulær migrering og invasjon i ccRCC. Vi finner at knockdown av HIF-2α med siRNA i 786-O RCC celler redusert cellular motilitet som bestemmes av sårheling analyse i forhold til å rykke ut transfekterte celler (figur 5A og 5B). Kvantifisering av disse resultatene er gitt i figur 5C. Mens nesten 80% av såret gapet ble lukket i kontroll transfekterte celler ved 12 timer, 50% av det viklet gapet forble i HIF-2α knockdown-celler. Gitt disse dataene, undersøkte vi sårtilheling i FH overekspresjon 786-O subkloner sammenlignet med kontroll vektor transfekterte celler. Begge FH overekspresjon kloner hadde signifikant redusert til lukking av sår, sammenlignet med kontroll vektor transfekterte celler, noe som tyder på at tap av FH bidrar til migrasjon i RCC (figur 6A). I kontroll vektor-transfiserte celler, ble spalten såret bredde nesten helt lukket av 10 timer. I kontrast, FH overekspresjon celler lukket sår gapet ved bare halvparten av 10 timer indikerer redusert cellemigrasjon ble et resultat av FH overekspresjon. Resultatene vises grafisk (figur 6B). For ytterligere å underbygge disse dataene, undersøkte vi cellulær migrasjon anvendelse av en kammer-analyse med 10% føtalt bovint serum som chemotractant. 786-O-vektorkontrollceller var signifikant mer vandrende enn FH overekspresjon kloner (figur 6C). Til slutt, overekspresjon av FH i RCC-celler redusert invasive egenskaper som bestemt ved matrigel invasjon analysen (figur 6D). Samlet utgjør disse data viser at tap av FH uttrykk forbedrer trekkfugl og invasiv evne RCC celler.
786-O RCC celler ble transfektert med krafse kontroll siRNA (sinc) eller siRNA til HIF-2α. Western blotting resultater av hele celleekstrakter er vist i panel A. B) Sårtilheling Assayet ble utført i transfekterte celler. Bilder ble serielt tatt på angitte tidspunkt etter «såret» induksjon. Resultatene er grafisk vist i panel C. stjerner (*) indikerer statistisk signifikans med p 0,05 i forhold til å rykke ut kontroll transfekterte celler
A) sårtilheling analyse bilder på angitte tidspunkter.. B) Sår bredde avstand på angitte tidspunkter. C) Chamber cellemigrering analysen av de angitte kloner. Celler ble sådd ut i serumfritt medium med 10% FBS anvendt som chemotractant. Migrert legemer på kloner på 48 timer fra første seeding. Stjerne (*) indikerer statistisk signifikans med p 0,05 i forhold til å kontrollere vektor transfekterte celler. D) Matrigel invasjonen analysen med 10% FBS media som chemotractant. Stjerne (*) indikerer statistisk signifikans med p. 0,05 i forhold til å kontrollere vektor transfekterte celler
Diskusjoner
I denne rapporten viser vi for første gang redusert FH uttrykk på mRNA og proteinnivåer i klarcellet nyrekreft, den vanligste histologiske varianten som står for mesteparten av nyrekreft. Disse funnene er viktige som tidligere studier ikke identifisere
FH
mutasjoner i RCC linjer samt primære RCC prøver [24]. Mekanismer som mRNA nivåer av
FH
er redusert er under pågående etterforskningen. Hypermethylation kan være en mekanisme som
FH
uttrykk undertrykkes. Dulaimi
et al.
Ikke identifisere hypermethylation i en CpG island av
FH
promoter i et panel av papillær RCC [25]. Imidlertid har ingen studier hittil undersøkt
FH
metylering status i ccRCC. Mens hypermethylation er et middel for tumor suppressor genet Slå, kan alternative mekanismer også ta hensyn til redusert uttrykk for
FH
vi har identifisert. Økende interesse har fokusert på rollen av mikroRNA (miRNA) i genregulering hvor rapporter antyder at gener involvert i oksidativ fosforylering kan være gjenstand for regulering av mirnas [26]. Åpenbart disse mulighetene garanterer videre etterforskning gitt den biologiske betydningen av våre funn.
Vi har tidligere vist at gjeninnføring av vill type
FH
inn en
FH
mangelfull svulst cellelinje resulterer i en markert reduksjon i atom HIF-1α nivåer [27]. Videre har siRNA mediert knockdown av FH er vist å øke HIF-1α nivåer i A549 lungekarsinom celler som uttrykker VHL [5]. Resultatene fra disse studiene, så vel som andre biokjemiske studier tyder på at prinsippet mekanismen ved hvilken dette skjer er gjennom HIF proteinstabilisering via hemmingen av prolylhydroksylase aktivitet som et resultat av FH tap. Disse funnene vil derfor anta at effekten av FH på HIF ville bare være tydelig i nærvær av VHL. Men våre funn er ganske romanen i at de indikerer at FH kan modulere HIF-2α uavhengig av VHL. VHL-uavhengig trasé som medierer HIF degradering er rapportert. Spesielt har HSP90 og RACK1 tidligere er blitt vist å modulere HIF-1α degradering [28]. Derfor er det mulig at en lignende mekanisme medierer HIF-2α degradering i tillegg. Til tross for stabilisering via hemming av protein nedbrytning, er det økende bevis for at alternative veier spille en rolle i å opprettholde HIF-2α proteinnivåer i fravær av VHL. Block
et al.
Vist at forhøyede cellulære reaktive oksygenforbindelser, mediert av p22-phox basert Nox oksidase, opprettholde HIF-2α proteinnivåer i RCC celler gjennom en AKT /4E-BP1 mRNA translasjonsforskning avhengig mekanisme [17] [22]. Tilsvarende er fosforylering av AKT og 4E-BP1 forbedret i humane RCC vev i forhold til det normale parenchymalvevet [22]. Flere nylig, Toschi
et al.
Fant at AKT aktivering via signaliserer gjennom mTOR signale komplekset 2 (mTORC2), var nødvendig for å opprettholde HIF-2α i VHL null-celler [18]. AKT-aktivering er en vanlig signalnode i kreft og alternative mekanismer kan føre til AKT aktivering i RCC inkludert tap av FH.
mekanismen som AKT signale aktiveres ved FH tapet er under liggende undersøkelsen. Vi har tidligere vist at tap av FH i renale epiteliale celler resulterer i forhøyet cellulær oksidativt stress [27]. Derfor kan ROS være en bidragsyter til de forhøyede HIF-2a nivåer ved FH knockdown. Alternativt kan effekten av FH tap være urelatert til dens rolle i den TCA-syklus. Det er godt etablert at FH finnes også i en extramitochondrial, cytosolic form. På denne tiden, er svært lite kjent om funksjonen til denne formen for FH. Men siste bevis levert av O’Flaherty
et al.
Indikerer at tap av extramitochondrial FH kan bidra til HIF stabilisering [29]. I tillegg er cytosoliske FH blitt implisert i den DNA-skade reaksjon [30]. Ved DNA-skade, og cytosoliske FH vist seg å translocate inn i kjernen. Mekanismen ved hvilken FH deltar i den DNA-skade responsen er fortsatt uklar. Men det er absolutt den mulighet at FH og metabolittene som det samvirker med, kan regulere funksjonen til andre proteiner, eventuelt i kjernen. Interessant, AKT har også vist seg å fungere i kjernen [31]. Gitt våre data, samt disse nylige rapporter, rettet AKT-medierte signalveier, enten på nivået av AKT eller oppstrøms, kan vise seg å være av terapeutisk nytte for renal kreft. Dette er i samsvar med nyere data viser
in vitro Hotell og
in vivo
effekten av en dual PI3K /mTOR-hemmer i RCC [19].
Interessant er det presedens for endringer av TCA syklus enzym i kreft. Flere andre gener som koder for enzymer i tricarboxylic (TCA) syklus regnes tumorsuppressorgener inkludert
SDHB
,
SDHC
, og
SDHD plakater (succinatdehydrogenase underenheter B, C, D) [32], [33], [34].
SDH
subenheten mutasjoner har vært knyttet til feokromocytom og paragangliom og mer nylig til gastrointestinal stromal tumor (GIST) [35]. I tillegg til mutasjoner, har endringer i ekspresjon av disse genene er koblet til malignitet. Dahia
et al.
Demonstrert redusert uttrykk for succinatdehydrogenase subenhet B (SDHB) i en undergruppe av feokromocytomer [36]. Flere nylig, ble redusert uttrykk for SDHB identifisert i store deler av GIST uten mutasjoner i
SDHB
eller andre gener ofte mutert i GIST inkludert
KIT Hotell og
PDGFRA product: [35] . Basert på disse dataene, kan en potensiell samlende tema være at feil i oksidativ fosforylering, enten gjennom mutasjon eller uttrykk endringer, har en rolle i onkogenese. Nylig, Chen
mfl.
Slås at oksygenforbruk via mitokondrie stoffskifte kan regulere tumorvekst ved å begrense tilgjengeligheten av oksygen for ikke-mitokondrie aktiviteter som er medvirkende til tumorvekst [37].
av betydelig interesse er våre funn at FH overekspresjon resulterer i redusert migrasjon og invasjon av RCC celler. Våre data er i samsvar med en fersk rapport fra Costa
et al.
Som viste at
fh
knockdown i immortalisert mus embryonale fibroblaster (iMEFS) resulterte i økt bevegelighet sammenlignet med untransduced iMEFS [38 ]. Videre er økningen i motilitet var HIF-1α avhengig. Rollen som HIF-2α i sine studier kunne ikke fastslås som de ikke var i stand til å oppdage HIF-2α uttrykk i fh mangel iMEFS. Våre studier fokusert på HIF-2a gitt tidligere studier som implisere sin rolle i nyrekreftutvikling. Gitt at HIF-2α knockdown i RCC-celler inhiberer migrasjonen, våre data tyder på at effektene av FH overekspresjon på migrering og invasjon er til dels medieres av effekter på HIF-2α. HIF-2α har tidligere vært implisert i invasiv oppførselen til RCC-celler. Videre invasiv fremme egenskapene til HIF-2α er blitt studert i 786-O-celler, de samme cellene som anvendes i denne studien. Hughes
et al.
Vist at HIF-2α knockdown i 786-O celler redusert uttrykk av flere inte som kan megle cellemotilitet og invasjonen [39]. Petrella
et al.
Undersøkt hvilken rolle VHL tap i cellen invasjonen [40]. De fant at gjeninnføring av vill type
VHL
i VHL-mangel 786-O-celler reduserte HIF-2α nivåer og celle invasjon. Omvendt, re-uttrykk for HIF-2α i
VHL
rekonstituert 786-O-celler restaurert invasiv potensial. Disse data indikerer en rolle for HIF-2α i RCC migrering og invasjon. I tillegg ble HIF-2α overekspresjon funnet å forbedre veksten av RCC-transplantater, mens overekspresjon av HIF-1α ble funnet å hemme veksten xenograft [41]. Tilsvarende separate studier indikerer at HIF-2α, men ikke HIF-1α, bidrar til vekst av
VHL
null tumorxenografter [16], [42]. Derfor våre data legge til den voksende mengde bevis som viser tumorfremmende effekter av HIF-2α uttrykk i RCC.
Til tross for den nylige godkjenning av flere agenter for avansert nyrekreft, de fleste pasienter med avansert nyrekreft vil til slutt bukke under for sin sykdom. Derfor vil identifisering av nye signalveier være kritisk for utvikling av effektive terapeutiske midler. Det er nå stadig flere bevis på at nyrekreft er blant de svulster som er representative for den nye paradigmet i kreft biologi av metabolske linker til malignitet. Våre funn med FH foreslå en metabolsk omprogrammering i klarcellet nyrekreft som fremmer uttrykk for tumorigene faktorer, inkludert HIF-2α via flere mekanismer. Unraveling mekanismer som svulst metabolisme er endret og nedstrøms cellulære konsekvensene bør gi dyp innsikt i nyrekreft biologi samt nye terapeutiske strategier.
Materialer og metoder
Cells
A498, 786-O, og ACHN-celler ble erholdt fra American Type Culture Collection og opprettholdt i DMEM supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. RCC4 celler ble vennlig levert av P. Ratcliffe (Oxford).
Kjemi
LY294002 ble kjøpt fra Sigma.
konstruerer
FH-FLAG konstruere er tidligere blitt beskrevet [27].
Immunoblotting
Alle Immunoblotanalyse analyser ble utført som tidligere beskrevet [27] i hel-celle-lysater fremstilt med bruk av radioimmunopresipitasjonsanalyse analysebuffer (50 mM Tris- HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksykolat, og 0,1% natriumdodecylsulfat) supplert med protease inhibitor cocktail (Roche). Antistoffer ble oppnådd fra følgende kommersielle kilder: GeneTex (FH-immunblotting), Santa Cruz Biotechnology (FH-immunhistokjemi), Novus (GAPDH, HIF-2α), Sigma (Tubulin, β-aktin), Cell Signaling (total AKT og ser473 fosfor AKT).
vevsprøve kvantitativ real-time PCR
Biospecimens for RNA-analyse ble hentet fra Cooperative menneskelig vev Nettverk av NCI /NIH. Total RNA ble revers transkribert ved hjelp av High-Capacity cDNA Arkiv kit (Applied Biosystems). cDNA ble deretter brukt som mal med Applied Biosystems «analyser-on-demand 20 × analysen blanding av primere og TaqMan prober. Førti amplifiseringscykluser ble gjort på Applied Biosystems Prism 7900 sekvensdetektoren. Brett endre verdier mellom tumor og normale prøver ble beregnet ved hjelp av Δ
C
t-metoden med normalisering til 18S rRNA-nivåer. Som en statistisk test vi brukte Mann-Whitney paret ikke-parametrisk test for å sammenligne FH uttrykk i tumor mot normalt omkringliggende vev (implementert i GeneSpring, Agilent).
Immunoblotting og immunhistokjemi av menneskelige vevsprøver
tumorprøver og normal tilsvarende vev fra pasienter med RCC ble oppnådd fra Institutt for Urologi ved University of Texas Health Science Center i San Antonio. Svulstene for denne studien ble histologisk klassifisert som klarcellet nyrekreft med en urin patolog. Innsamling og håndtering av humane prøver ble utført i henhold til en protokoll godkjent av Institutional Review Board ved University of Texas Health Science Center i San Antonio. Basert på protokollen ble prøver oppnådd i et deidentified måte fra pasienter som gjennomgår kirurgisk reseksjon for renal kreft. Som prøver ble innhentet og analysert i en anonym måte, ble pasienten samtykke ikke er nødvendig.
sårtilheling analysen
Celler fikk vokse til nær samløpet i 60 mm skåler. En jevn ripe ble deretter gjort i midten av platen ved hjelp av en 200 mikroliter mikropipette spissen, fulgt av vasking to ganger med PBS. Det samme markerte feltet i bunnen av såret ble fotografert med et Olympus lysmikroskop (4 × objektiv) på angitte tidspunkter. Bredden av bunnen av såret ble målt ved tre forskjellige områder med Q-registrerings pro programvare. Kvantifiserte data representerer gjennomsnitt +/- S.D. fra minst to uavhengige forsøk.
Migrasjon analysen
786-O subkloner celler (1 x 10
4) ble sådd på en 8 mikrometer porestørrelse Thin-cert i 24 brønners plater (Greiner Bio-One) i serum frie medier. Syv hundre og femti mikroliter 10% FBS-medium ble tilsatt til den nederste kammer som chemotractant. Etter 48 timer ble cellene på toppen av membranen fjernes med en bomullspinne. De migrerte celler på den nedre side ble vasket med PBS, fiksert med 70% etanol og farget ved anvendelse av 0,1% krystallfiolett for å visualisere de migrerte celler. Migrerte celler festet til den nedre side av membranen ble nummerert ved hjelp av et lysmikroskop ved 10 x forstørrelse. Teller representerer gjennomsnittlig celletall på ti mikroskopiske felt.
Invasion analysen
Cell invasjonen ble bestemt ved invasjon analysen (membran belagt med et lag av Matrigel ekstracellulære matrix proteiner) i henhold til produsentens instruksjoner. Celler ble sådd ut i serum-fritt medium inn i det øvre kammer og invaderte mot bunnen kammer inneholdende et 10% FBS medium som chemotractant. Membraner ble behandlet på en lignende måte som migreringsanalyse.
RNA interferens
FH og HIF-2α knockdown, ble celler transfektert med sammenslått siRNA-reagens (Thermo Fisher) med Amaxa Nucleofector systemet henhold til produsentens protokoll. Celler ble høstet ved 48-72 timer etter transfeksjon. En ikke-måls rykke siRNA bassenget ble brukt som en negativ kontroll (Thermo Fisher).
Takk
Vi takker Cynthia Galindo og Dawn Garcia for teknisk assistanse. Vi takker Computational Biology Initiative (UTHSCSA /UTSA) for å gi tilgang og opplæring til analyse programvare som brukes.
