Abstract
Kjemoterapi er en primær behandling for kreft, men dens effekt er ofte begrenset av de negative effektene av cytostatika. Målrettet medikamentavlevering kan redusere den ikke-spesifikke toksisitet av kjemoterapi ved selektivt å styre anticancer legemidler til tumorceller. MUC1-proteinet er et attraktivt mål for tumorspesifikk levering av legemidler eie til dets overekspresjon i de fleste adenokarsinomer. I denne studien er en roman MUC1 aptamer utnyttet som målsiktingsliganden for gjennomføring doxorubicin (Dox) til kreftceller. Vi har utviklet en 86-base-DNA aptamer (MA3) som er bundet til et peptid epitop av MUC1 med en
K
d av 38,3 nM og minimal kryssreaktivitet til albumin. Ved å bruke A549 lungekreft og MCF-7 brystkreftceller som MUC1-uttrykkende modeller, ble MA3 funnet å fortrinnsvis binde seg til MUC1-positiv, men ikke MUC1-negative celler. En aptamer-doxorubicin kompleks (Apt-Dox) ble formulert ved interkalering doxorubicin i DNA strukturen av MA3. Apt-Dox ble funnet stand til å frakte doxorubicin inn MUC1-positive tumorceller, mens betydelig reduserer inntak av MUC1-negative celler. Dessuten, Apt-Dox beholdt effekten av doxorubicin mot MUC1-positive tumorceller, men senket toksisitet overfor MUC1-negative celler (P 0,01). Resultatene tyder på at MUC1 aptamer kan ha potensielle nytten som en måls ligand for selektiv levering av cytotoksiske middel til MUC1-uttrykke svulster
Citation. Hu Y, Duan J, Zhan Q, Wang F, Lu X, Yang XD (2012) Novel MUC1 Aptamer selektivt Leverer cytotoksiske middel til kreft celler in vitro. PLoS ONE 7 (2): e31970. doi: 10,1371 /journal.pone.0031970
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 15 september 2011; Akseptert: 19. januar 2012; Publisert: 22 februar 2012
Copyright: © 2012 Hu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra det kinesiske departementet for vitenskap og teknologi (2011CB933504, 2011CB911004, 2011CB911003) og Foundation Natural Science of China (81071870)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kjemoterapi er en viktig behandling for kreft, spesielt for sent stadium metastatisk sykdom. Imidlertid er effektiviteten av kjemoterapi ofte begrenset av de ugunstige virkninger av cytotoksiske midler som anvendes i de fleste terapeutiske regimer. Et stort problem i forbindelse med cytotoksiske legemidler er at de forårsaker skader på både kreftceller og normale vev, generering av alvorlige bivirkninger som ofte begrenser intensiteten og varigheten av kjemoterapi. Følgelig er det ofte vanskelig for cytotoksiske medikamenter for å eliminere alle kreftcellene i kroppen, noe som resulterer i behandlingssvikt og dårlig prognose. En slik svikt understreker behovet for å utvikle stadig mer potent behandling med redusert toksisitet. En måte å oppnå målet er målrettet cancerterapi, hvori anticancer legemidler blir selektivt leveres til kreftceller, slik at cytotoksisitet mot tumor forsterkes mens de negative effektene reduseres. Målrettet kreftbehandling holder løftet i å forbedre kreft effekt. Det har blitt rapportert at aptamer-styrt bærere inneholdende paclitaxel i betydelig grad kan forbedre effektiviteten mot prostatakreft i dyremodeller [1]. Monoklonale antistoffer er også blitt kovalent bundet til legemidler for målrettet cancerterapi [2]. En studie av trastuzumab emtansine (T-DM1), et konjugat av humanisert anti-HER2-antistoff og et kjemisk stoff, er for tiden i fase III klinisk studie [3].
En typisk målrettet levering av legemidler system består vanligvis av en anticancer stoffet, og en måls ligand, som kan spesifikt bindes til tumormarkører som rikelig uttrykker i kreftceller [4]. En ideell tumormarkør for målrettet behandling bør være et membranprotein som blir overuttrykt på overflaten av kreftceller, med forholdsvis lav ekspresjon i normalt vev. MUC1 er en godt karakterisert store trans glykoprotein som potensielt kan tjene som mål for kreftbehandling. Dens uttrykk er økt med minst 10 ganger i de fleste maligne adenokarsinomer, inkludert brystkreft, lungekreft og tykktarmskreft, noe som gjør det til et attraktivt svulst markør for målrettet terapi [5]. I tillegg til den tumormarkøren, er tumor-targeting ligand også et viktig element for målrettet cancerterapi. En ideell målrettende ligand bør ha høy bindingsaffinitet for tumormarkøren, med god spesifisitet og lav immunogenisitet [6]. I det siste roman målretting midler, inkludert aptamerer [7], korte peptider [8] og andre små molekyler [9], har blitt den nye generasjonen rettet mot molekyler. Aptamerer er single-strand oligonukleotider som kan binde til målet molekyler med høy affinitet og spesifisitet. Sammenlignet med monoklonale antistoffer, aptamerer besitter særegne fordeler som målgruppe ligand: høy affinitet for binding til de fleste molekyler, begrenset syntese kostnads, lav immunogenisitets-, og liten størrelse som gjør at den kan trenge gjennom solide svulster [10]. På grunn av disse fordelene, har aptamerer vært ansatt som nye målgruppe ligander i stoffet leveringssystemer mot prostatakreft [11], [12], [13] og leukemi [14]. For tumoren markør for MUC1, har Ferreira et al utviklet flere aptamerer som kan bindes til de MUC1-positive tumorceller [15]. Det har også vist seg at MUC1 aptamerer kan benyttes for selektivt å levere fototerapi middel til kreftceller
in vitro product: [16].
cytotoksiske medikamenter er de viktigste komponentene i de fleste kjemoterapiregimer for cancer behandling. Det er derfor viktig å finne ut om MUC1 aptamer kan anvendes direkte for selektivt å levere cytotoksisk middel til kreftceller. Så langt har imidlertid ingen slik studie har blitt rapportert i litteraturen. Her i denne studien, har vi utviklet en ny MUC1 aptamer, og evaluert sin kapasitet for å levere doxorubicin til kreftceller
in vitro
. Nærmere bestemt har vi valgt en 86-base-DNA aptamer (betegnet MA3) mot et peptid epitop av MUC1, og evaluert dets bindingsaffinitet til MUC1-positive og -negative cellene. For å utforske bindende spesifisiteten av aptamer, evaluerte vi også dets binding til albumin, som er det mest tallrike protein i plasma, og kan ikke-spesifikt bindes til aptamerer og forstyrre deres målretting funksjon. Doxorubicin er et av de mest brukte legemidler mot kreft, og kan hemme proliferasjonen av kreftceller ved interkalering inn i DNA-strukturen i cellekjerner. En aptamer-doxorubicin kompleks (Apt-Dox) ble formulert ved å innlemme doxorubicin inn i aptamer strukturen MA3. Vi melder nå at Apt-Dox kan selektivt levere doxorubicin til MUC1-positive celler
in vitro
.
Materialer og metoder
Reagenser
oligonukleotidprimere syntetisert ved Invitrogen (Shanghai Kina). Peptider med minst 95% renhet ble syntetisert ved SBS Genetech (Beijing Kina). Bovine serum albumin (BSA) ble kjøpt fra Tbdscience (Tianjin Kina). Monodispergerte magnetiske urea-formaldehyd sfærer ble kjøpt fra baseline ChromTech (Tianjin Kina). Trypsin ble kjøpt fra Amresco (US). Streptavidin-belagte magnetiske kuler ble innkjøpt fra Promega (USA). 1-etyl-3- (3-dimethyllaminopropyl) karbodiimidhydroklorid (EDC) ble innkjøpt fra Sigma (USA).
Cellelinjer
human brystkreft (MCF-7), human leverkreft (HepG2), human lungekreft (A549), og humane normale leverceller (L02) ble hentet fra Cell Center of Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina). Celler ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og en blanding av penicillin /streptomycin. Celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. Alle forsøkene ble utført på celler i den eksponentielle vekstfasen.
Immobilisering av målet på magnetiske kuler
Målet for aptamer utvalget er en 9-AA peptider (peptide1) med sekvensen av APDTRPAPG. Konjugeringen av målet til magnetiske kuler ble oppnådd via tverrbinding av -COOH og -NH2. To ug peptide1 ble blandet med 5 x 10∧5 karboksylerte magnetiske kuler, og inkubert med 200 ul EDC (40 mM) ved romtemperatur under forsiktig omrøring i 2 timer. De magnetiske perler ble deretter vasket tre ganger med Hanks buffer og lagret ved 4 ° C. Lignende metode ble benyttet for å bøye perlene med andre stoffer, herunder BSA og en 29-AA lange peptider med sekvensen av GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP (peptide2).
SELEX bibliotek og primere
En start DNA-bibliotek bestående av 86-mer oligonukleotider med sentrale 40-base lang randomiserte sekvenser ble syntetisert. Sekvensen av biblioteket er 5’AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-N40-CACAGACACACTACACACGCACA3 «, hvor N representerer et nukleotid randomisert til enten A, G, C eller T. En FITC-merket 5′-primeren (5′-FITC-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3») og en biotin-merket 3 «primer (5′-B-TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3») ble anvendt i PCR for syntese av dobbeltmerket, dobbelttrådete DNA-molekyler, som deretter ble blandet med streptavidin-belagte magnetiske kuler i 10 minutter ved romtemperatur. Etter denaturering i alkalisk tilstand (0,1 M NaOH), ble FITC-konjugert forstand enkeltkjedet DNA (ssDNA) atskilt fra den biotin-merkede antisense-ssDNA tråd med streptavidin-belagte magnetiske kuler og anvendt for aptamer valg.
In vitro utvalg av målbindende aptamerer
prosedyrene av utvalget var som følger. SsDNA basseng (200 pmol) ble først oppvarmet ved 95 ° C i 5 minutter og deretter avkjølt umiddelbart til 0 ° C i bindingsbuffer (Hanks-buffer) i 15 minutter før binding til målet. For å redusere bakgrunnsinterferens, 0,1 mg /ml laksesperm-DNA og 1 mg /ml BSA ble tilsatt til bindingsbufferen. I den innledende valg runde, ble peptide1-belagte kuler suspendert i 200 ul bindingsbuffer inneholdende 200 pmol av tilfeldig ssDNA. Etter inkubering av blandingen ved 37 ° C i 30 minutter med forsiktig risting, ble de ikke-bundne oligonukleotider fjernet ved vasking fire ganger med 500 ul bindingsbuffer. Deretter ble kule-bundet oligonukleotider blandinger amplifisert ved PCR med FITC- eller biotin-merkede primere (25 sykluser av 40 sekunder ved 94 ° C, 30 sek ved 65 ° C, 40 sek ved 72 ° C, etterfulgt av 10 minutter ved 72 ° C, den Taq-polymerase og dNTP-er ble erholdt fra Takara). Den påfølgende dsDNA fra PCR ble separert i ssDNA via fremgangsmåten beskrevet ovenfor. Den valgte forstand ssDNA adskilt fra det biotinylerte antisense DNA-tråden med streptavidin-belagte magnetiske kuler ble anvendt for den neste runde med SELEX. Etter flere runder med valg, den valgte ssDNA bassenget var PCR-forsterket ved hjelp av umodifiserte primere og klonet inn Escherichia Coli med TA kloning kit for DNA-sekvensering.
Flowcytometri analyse
For å overvåke berikelse av aptamer kandidater etter seleksjon, ble FITC-merket ssDNA basseng inkubert med peptide1-belagte magnetiske kuler i 200 pl utvalg buffer inneholdende 10% FBS ved 37 ° C i 30 minutter. Kulene ble vasket to ganger med 0,5 ml bindingsbuffer og deretter suspendert i 0,2 ml bindingsbuffer. Den FITC fluorescens ble bestemt med en FACSCalibur cytometer (Accuri C6, USA). Det FITC-merket ssDNA randomisert bibliotek ble anvendt for å generere styresignalet.
Bindingsaffiniteten til aptamerer ble bestemt ved å inkubere peptide1-belagte magnetiske kuler med varierende konsentrasjoner av FITC-merket aptamer i 200 ul bindingsbuffer ved 37 ° C i 30 minutter. Kulene ble vasket to ganger med 0,5 ml bindingsbuffer, suspendert i 0,2 ml bindingsbuffer og underkastet flyte-cytometrisk analyse. Det FITC-merket ssDNA uselektert bibliotek ble anvendt som en negativ kontroll for å bestemme ikke-spesifikk binding. Alle eksperimenter for bindings-forsøket ble gjentatt tre ganger. Den midlere fluorescensintensitet av target-merket ved aptamerer ble anvendt for å beregne for spesifikk binding ved å subtrahere den midlere fluorescensintensitet av ikke-spesifikk binding fra umerket bibliotek DNA [17]. Likevekts-dissosiasjons-konstanter (
K
d) i aptamer-peptide1 interaksjon ble oppnådd ved å montere avhengighet av fluorescensintensiteten av spesifikk binding av konsentrasjonen av aptamerer med ligningen Y = B max X /(Kd + X).
for å evaluere den spesifikke bindingen av aptamerer å målrette ble FITC-merket aptamer separat inkubert med peptide1-, peptied2-, eller BSA-belagte magnetiske kuler. Kulene ble vasket to ganger med 0,5 ml bindingsbuffer, ble suspendert i 0,2 ml bindingsbuffer og analysert ved strømningscytometri. For å vurdere aptamer binding til celler, ble cellene skrapet av kulturen flaske og vasket med Hanks buffer. FITC-merkede aptamer ble inkubert med 10∧5 av enten MCF-7, A549, HepG2 eller L02 celler i bindingsbuffer ved 37 ° C i 30 minutter. Cellene ble deretter vasket tre ganger med Hanks buffer og analysert med strømnings cytometrey.
celler og siRNA transfeksjon
A549-celler ble sådd ut i 6-brønns plater ved 1-3 x 10
5cells /vel, dyrket i antibiotika-free media over natten, og transfektert med MUC1 siRNA eller kontrollere siRNA [18] med Lipofectamine 2000 i Opti-MEM jeg redusert serum medium i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen Livet Technology, Inc.). Etter 72 timer ble cellene høstet og farget med FITC-merket aptamer for strømningscytometri-analyse, og cellelysater ble fremstilt for immunoblotanalyse.
Western blot-analyse
Lysater ble fremstilt fra subsammenflytende celler. Like mengder protein ble separert ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. De immunoblot ble probet med anti-MUC1-antistoff. De immunokomplekser ble påvist med pepperrot peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer og forsterket kjemiluminescens (ECL).
Lasting av aptamer med doksorubicin
aptamerer ble først oppvarmet ved 95 ° C i 5 minutter og deretter avkjølt umiddelbart til 0 ° C i vann i 15 min. De aptamerer ble inkubert i en vandig oppløsning av doksorubicin (3 nM) i 1 time i en sort 96-brønners plate ved forskjellige aptamer /DOX-molforhold. Fluorescens spekteret av doksorubicin ble deretter undersøkt av en Synergy4 analysator (λEx = 488 nm, λEm = 500-700 nm). FITC-merket Apt-Dox eller Apt-Dox ble inkubert med A549-celler i bindingsbuffer ved 37 ° C i 30 minutter. Cellene ble deretter vasket tre ganger med Hanks buffer og analysert med strømnings cytometrey.
cellulært opptak av doksorubicin
Den spesifikke cellulære opptak av Apt-Dox ved MUC1-positiv celle A549 ble studert ved konfokal fluorescens scanning mikroskopi (Perkin Elmer Ultra, US) og flowcytometri. HepG2-celle ble anvendt som en MUC1-negativ kontroll. Cellene fikk følge et glass dekkglass i 24 timer. Cellene ble deretter inkubert med 1,5 uM av Dox eller Aptamer-Dox i 2 timer ved 37 ° C. Etter å ha blitt vasket to ganger med Hanks buffer, ble cellene fiksert med 4% formaldehyd i 10 minutter og analysert ved konfokal fluorescens-skanning mikroskopi.
For strømningscytometri-analyse, ble cellene skrapet av fra dyrkningsflasken og vasket to ganger med Hanks buffer. Cellene ble inkubert med 1,5 uM Dox eller Aptamer-Dox i 4 timer ved 37 ° C, og vasket to ganger med Hanks buffer. Cellene ble deretter fiksert med 4% formaldehyd i 10 min og analysert med flyt cytometriy.
MTS celleviabilitet analysen
For å vurdere cytotoksisitet av Apt-Dox eller Dox mot A549 og HepG2 celler, begge cellelinjer ble først dyrket i 96-brønners plater, og deretter ko-inkubert ved 37 ° C med Apt-Dox, Dox, eller aptamer ved en konsentrasjon på 3 uM i 4 timer. Cellene ble vasket med Hanks buffer for to ganger og dyrket i ytterligere 48 timer. Etterpå ble MTS assay (Promega, USA) som brukes for å bestemme cellenes levedyktighet per standard protokoll som er beskrevet av produsenten.
statistikker og
Statistisk analyse ble utført ved anvendelse Statistical Analysis System (SAS, versjon 9.2 ). Enveis ANOVA med Fisher minst signifikant forskjell (LSD) post hoc sammenligninger på 99% konfidensintervall ble brukt for statistiske sammenligninger. Alle data er presentert som en middelverdi med sin standardavvik angitt (gjennomsnitt ± SD).
Resultater
Aptamer utvalg og karakterisering
Den ekstracellulære protein kjernen av MUC1 er gjort opp av variabelt antall et sterkt konservert tandemrepetisjonssekvensen består av 20 aminosyrer (TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS) [19]. Blant de tandem gjentagelse, hadde sekvensen APDTRPAPG blitt identifisert som den mest immunodominant peptid-epitop [20], og ble brukt som mål for MUC1 aptamer seleksjon i tidligere forskning [15]. Her i denne studien, har vi også brukt dette peptider som mål i vår SELEX prosessen. Målet Peptidene ble kovalent konjugert til magnetiske kuler ved bruk av EDC som katalysator. Under hver runde med seleksjon, ble kulene inkubert med FITC-merket ssDNA basseng, og anriking av aptamerer ble målt ved flow-cytometri. Sammenlignet med den tilfeldige DNA fra biblioteket basseng, en økende mengde ssDNA bundet for å målrette-belagte magnetiske kuler etter hver runde med seleksjon (fig. 1). De aptamerer ble deretter klonet, og 50 kloner ble analysert for ytterligere karakterisering. Blant disse kloner, en apatmer betegnet MA3 viste relativt høy binding til målet MUC1 peptider. DNA-sekvensen til aptamer MA3 er 5′AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGGACTGCAACCTATGCTATCGTTGATGTCTGTCCAAGCAACACAGACACACTACACACGCACA3′.
Compared med utgangs tilfeldig DNA pool (skyggelagte histogram), strømningscytometri viste en økning i fluorescensintensiteten til aptamerer bundet til MUC1 peptid (APDTRPAPG) etter den tredje (grå kurve) frem og tilbake (svart kurve) runder med utvelgelse.
Binding spesifisitet er viktig for evaluering av aptamer ytelse. Siden albumin er den mest tallrike protein i blod, vi undersøkte bindingen av aptamer MA3 til albumin. Albumin eller MUC1 peptider belagte kuler ble inkubert med FITC-merket MA3, og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Ikke valgt tilfeldig DNA fra biblioteket bassenget ble brukt som kontroll. Som presentert i figur 2, MA3 aptamer genereres en signifikant binding til MUC1 peptider (Fig. 2A), men en forholdsvis svak binding til BSA lik den som er generert av tilfeldig DNA (fig. 2B). Resultatene antydet at det mellom de MUC1 peptider og albumin, er aptamer MA3 oppviste et målsøkende spesifisitet mot den førstnevnte. Til sammenligning ble lignende eksperimenter utført for en annen MUC1 aptamer, S2.2, som hadde den laveste
K
d blant alle de publiserte MUC1 aptamerer [15], [16]. Resultatene viste at mens S2.2 kunne binde seg til MUC1 peptider (Fig. 2C), er det også bundet til albumin til en viss grad (fig. 2D). Dataene viste at sammenlignet med S2.2, MA3 hadde en lavere kryssreaktivitet til albumin.
(A) MUC1-peptid perler behandlet med MA3. (B) BSA perler behandlet med MA3. (C) MUC1-peptid perler ble behandlet med S2.2. (D) BSA-kuler som ble behandlet med S2.2. De fylte histogrammene representerer styre fluorescerende signaler som genereres av FITC-merket tilfeldig DNA fra biblioteket bassenget.
For å kvantitativt vurdere bindingsaffiniteten til aptamer til MUC1, kuler belagt med MUC1 peptider ble inkubert med FITC -merket MA3 av forskjellige konsentrasjoner (fig. 3A). Ved hjelp av ikke-lineær regresjonsanalyse ble det aptamer funnet å ha en
K
d på 38,3 nM. For ytterligere å vurdere om aptamer MA3 ville binde seg til MUC1 struktur, vi også undersøkt sin binding til en 29-AA peptider (GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP) som inneholder hele tandem repeat sekvens (TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS) som gjorde opp ekstracellulære MUC1 protein kjerne. De 29-AA-peptider ble kovalent konjugert til magnetiske kuler, som ble inkubert med FITC-merket MA3 og analysert ved strømningscytometri. FITC-merket tilfeldig DNA fra biblioteket bassenget ble brukt som kontroll. Som vist på fig. 3B, MA3 genereres et signal fluorescens som var signifikant mer potent enn tilfeldige DNA, noe som indikerer at aptamer kan også binde seg til en struktur som inneholder hele MUC1 tandemrepetisjonssekvensen. Siden det ekstracellulære domene av MUC1 protein kjerne består i hovedsak av tandem-gjentagelser, er det mulig at den aptamer MA3 gjenkjenner MUC1 struktur eksponert på overflaten av MUC1-uttrykkende tumorceller.
(A) Kvantitativ analyse av affinitet mellom FITC-merket MA3 og MUC1 epitop (APDTRPAPG). (B) Flowcytometri analyse av binding mellom FITC-merket MA3 26-AA MUC1 peptid (GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP). Den fylte histogram er kontrollen fluorescens bakgrunnen generert av FITC-merket tilfeldig DNA fra biblioteket bassenget.
MA3 aptamer selektivt binder seg til MUC1-uttrykke tumorceller
For å vurdere om aptamer MA3 ville binde seg til MUC1-uttrykkende kreftceller, ble FITC-merket MA3 inkubert med enten MUC1-positive (A549 eller MCF7) [21], [22] eller MUC1-negative (HepG2 eller L02) cellelinjer [21], [23]. Cellene ble senere analysert ved flow-cytometri, ved hjelp av celler inkubert med FITC-merket tilfeldig DNA som kontroll. De strømningscytometriske profilene er presentert i figur 4. For MUC1-positive cellelinjer A549 og MCF7, MA3 behandling genererte fluorescens-signaler som var signifikant mer potent enn den tilfeldige DNA-behandling (fig. 4A og B). Men for MUC1-negative cellelinjer HepG2 og L02, MA3 behandlingen resulterte i fluorescens-signaler som var lik den i tilfeldig DNA-behandling (fig. 4C og D). Resultatene indikerte at den aptamer MA3 kan fortrinnsvis bindes til MUC1-positive cancerceller, og at den aptamer kan gjenkjenne den MUC1 struktur på disse cellene.
Histogrammene ble samlet etter inkubering av FITC-merket MA3 med A549 (A ), MCF7 (B), HepG2 (C), og L02 (D) -celler, respektivt. De fylte histogrammer representerer styre fluorescens signaler generert av FITC-merket tilfeldig DNA fra biblioteket bassenget.
MUC1 uttrykk påvirker bindingen av aptamer til kreftceller
For å undersøke videre binding av aptamer til MUC1-positive tumorceller, ble ekspresjon av MUC1 protein i A549 og HepG2-celler bedømt ved western blot med anti-MUC1-antistoff. Som presentert i figur 5A, mens A549 cellene uttrykte MUC1 protein i rikelig mengde, HepG2 celler ikke, noe som tyder på at A549 var faktisk en MUC1-positive cellelinje og at HepG2 var en MUC1-negative cellelinje. Resultatene er i samsvar med flere publiserte studier, som i stor utstrekning analysert ekspresjonen av MUC1 i forskjellige cellelinjer og klart identifisert som A549 MUC1-positive og HepG2 som MUC1-negativ cellelinje [18], [24].
(A) Western-blot av proteinekstrakter fra A549-celler, HepG2-celler, A549-celler behandlet med kontroll siRNA, og A549-celler behandlet med MUC1 siRNA, respektivt. Aktin ble også blottet for å tjene som kontroll. (B og C) Strømningscytometri evaluering av apatamer sin binding til A549-celler behandlet med MUC1 siRNA (B) eller kontroll siRNA (C). De fylte histogrammer representerer styre fluorescens signaler generert av FITC-merket tilfeldig DNA fra biblioteket bassenget.
For å vurdere påvirkning av MUC1 uttrykk på aptamer sin binding til MUC1-positive celler, benyttet vi MUC1 siRNA som hadde vært tidligere vist i stand til å slå ned på MUC1 uttrykk [18]. SiRNA ble transfektert inn i de MUC1-positive A549-celler, og ble bekreftet med western blot at det kunne nedregulere den MUC1 ekspresjon (Fig. 5A). A549-celler ble behandlet med enten MUC1 siRNA eller en kontroll siRNA, inkubert med FITC-merket aptamer, og evaluert ved flow cytometri. Som vist i figur 5B og C ble aptamer-binding til cellene betydelig redusert etter nedregulering av ekspresjon MUC1 (fig. 5B), mens bindingen til celler behandlet med kontroll siRNA ikke ble påvirket (fig. 5C). Resultatene antydet at MUC1 uttrykk på målceller påvirket aptamer affinitet til disse cellene, og at tapet av MUC1 protein kan redusere aptamer bindende significantl
y
.
Legge i aptamer med Dox
for å kunne levere Dox til MUC1-positive tumorceller, en aptamer-doxorubicin kompleks (Apt-Dox) ble dannet ved interkalering doxorubicin inn i DNA-strukturen til MA3 aptamer. For å vurdere om Dox ble faktisk innlemmet i MA3, har vi gjort bruk av fenomenet at fluorescens fra Dox ville bli slukket etter interkalere i DNA [25]. Spesielt gjennomførte vi bindende studier mellom MA3 og Dox, og ansatt fluorescens spektroskopi for å vurdere fluorescerende signal generert av doxorubicin. Som vist i figur 6A, ble sekvens reduksjoner i det native fluorescens-spekteret av Dox observert når en fast konsentrasjon av Dox ble inkubert med økende molforhold av MA3 aptamer. Når aptamer /DOX molforhold nådde 0,1, fluorescens-spektrum Dox var på det laveste nivå og endret seg ikke lenger, noe som indikerer at de fleste dox hadde inkorporert i DNA-strukturen til MA3 ved denne aptamer /DOX-forhold.
(A) Fluorescens-spektrene av doksorubicin løsning blandet med økende molforhold mellom den MA3 aptamer (fra topp til bunn: 0, 0.001, 0.003, 0.005, 0.01, 0.03, 0.1, og 1). (B) A549-celler behandlet med FITC-merket MA3 aptamer. (C) A549-celler behandlet med FITC-merket Apt-Dox. De fylte histogrammer representerer styre fluorescens signaler generert av FITC-merket tilfeldig DNA fra biblioteket bassenget.
For å undersøke om intercalation av doxorubicin inn aptamer ville forstyrre aptamer affinitet til MUC1-positive tumorceller bindingen av Apt-Dox-komplekset til A549-celler ble evaluert med flowcytometri, og sammenlignet med den til MUC1 aptamer alene. Som vist i figur 6B og C, Apt-Dox-komplekset (Fig. 6C) hadde en affinitet til A549-celler som var lik MUC1 aptamer alene (Fig. 6B). Resultatene antydet at innskyting av doksorubicin i MUC1 aptamer ikke i betydelig grad interfererer med bindingen av aptamer til MUC1-positive tumorceller.
aptamerer som bærere for selektiv levering av doksorubicin til MUC1 positive cancerceller
Den selektive opptak av gratis Dox av både kreft og normale celler er en primær årsak for sine skadevirkninger mot normalt vev. Når Dox er interkalert i DNA strukturen i MUC1 aptamer (Apt-Dox), kan komplekset binder preferensielt til MUC1-positive cancerceller. For å teste dette postulatet ble fluorescens egenskapene doxorubicin benyttes til å vurdere stoffet opptaket enten MUC1-positive (A549) eller MUC1-negative (HepG2) celler. Cellene ble inkubert separat med fri Dox eller Apt-Dox og analysert ved konfokal mikroskopi. Resultatene viste at den røde fluorescens fra stoffet var like sterk i de to cellelinjene som ble behandlet med fri Dox (Fig. 7A og B), noe som indikerer at opptaket av fritt DOX av disse cellene var ikke-selektive. I motsetning til dette, når cellene ble behandlet med Apt-Dox, fluorescens i MUC1-positive A549-celler var signifikant høyere enn den i MUC1-negative HepG2-celler (Fig. 7C og D), og at opptaket av medikamentet ved HepG2-cellene var markert redusert. Resultatene antydet at Apt-Dox viste celle-spesifisitet og kan bli selektivt tatt opp av MUC1-positive celler. Interessant, den intracellulære fordeling av stoffet i A549 cellene var i hovedsak begrenset til kjerner med gratis Dox, men utvidet til cytoplasma i innstillingen av Apt-Dox, noe som tyder på at mekanismene for opptak av gratis Dox og Apt-Dox kan være forskjellig.
(A-D) Confocal laser scanning mikroskopi bilder av A549 og HepG2 celler etter inkubasjon med gratis doxorubicin (A og B) eller Apt-Dox (C og D) i 2 timer. (E og F) Strømningscytometri histogram profiler av A549 (E) og HepG2-celler (F) etter inkubasjon med enten fri doksorubicin (sorte kurver) eller Apt-Dox (grå kurver). De fylte histogrammer er styresignalene som genereres av ubehandlede celler.
For ytterligere å undersøke om Apt-Dox kan selektivt tas opp av MUC1 positive celler, flowcytometri ble også benyttet til å overvåke fluorescens som genereres av doxorubicin etter inkubasjon de to cellelinjer med gratis Dox eller Apt-Dox. For MUC1-positive A549-celler, de fluorescente signalene som genereres av fri Dox eller Apt-Dox var lik (figur 7E.); mens for MUC1-negative HepG2-celler, det fluorescente signalet som genereres av Apt-Dox var bemerkelsesverdig lavere enn det som genereres ved fri Dox (fig. 7F). Resultatene igjen antydet at Apt-Dox kan bli selektivt tatt opp av MUC1 positive cancerceller. Tatt sammen, vår mikroskopi og flowcytometri data tyder på at den aptamer MA3 kan tjene som en bærer for målrettet levering av Dox til MUC1-positive cancerceller.
Apt-Dox selektivt redusert cytotoksisitet til MUC1-negative kreftceller
Etter opptaket av doksorubicin ble redusert i MUC1-negative celler behandlet med Apt-Dox, er det mulig at cytotoksisiteten til disse celler, vil også bli redusert. For å teste postulat,
in vitro
cytotoksisitet forårsaket av Apt-Dox eller gratis Dox ble sammenlignet i HepG2 og A549 cellelinjer. Som presentert i figur 8A, for MUC1-negative HepG2-celler, ble cytotoksisiteten generert av Apt-Dox faktisk redusert sammenlignet med det som genereres av fri Dox (P 0,01). Men for MUC1-positive A549-celler, ble det ikke registrert forskjeller mellom den cytotoksisitet som genereres av Apt-Dox eller fri Dox (Fig. 8B). Resultatene tyder på at Apt-Dox har en tendens til å redusere skade på MUC1-negative celler og samtidig beholde effekten av doxorubicin mot MUC1-positive celler. Det bør bemerkes at aptamer alene var ikke toksisk mot begge cellelinjer, noe som indikerer at aptamer selv var relativt trygt til cellene, og at cytotoksisiteten er hovedsakelig forårsaket av doxorubicin.
HepG2 (A) og A549 (B ) celler ble vurdert med en standard MTS-analyse etter 48 timer med ytterligere inkubasjon (gjennomsnitt ± SD, n = 6).
diskusjon
effekten av kjemoterapi er ofte begrenset av ugunstige virkninger av cytotoksiske midler som kan skade både kreft og normale celler. En strategi for å redusere de negative virkningene av kjemoterapi er målrettet levering av legemidler til kreftceller. MUC1 er ansett som en verdifull mål for ligand-guidet kjemoterapi mot kreft på grunn av sin over-uttrykk i de fleste adenokarsinomer. Her i denne studien, ved hjelp av SELEX teknikk og en peptidepitopen av MUC1 som mål, har vi utviklet en ny MUC1 aptamer (MA3) med en
K
d på 38,3 nM. Vi fant at MA3 kunne spesifikt binde seg til MUC1-positive cancerceller, med minimal kryssreaktivitet til albumin (fig. 1,2,3,4). Dessuten ble en aptamer-medikamentkomplekset (Apt-Dox) som er dannet ved interkalering doxorubicin inn i DNA-strukturen til MA3 aptamer (fig. 6). Viktigere, Apt-Dox resulterte i et selektivt opptak av doksorubicin i MUC1-positive celler, mens betydelig redusert inntak av MUC1-negative celler (Fig. 7).
