Abstract
Det tredje medlemmet av trans surt coiled-spole protein (TACC) familie, TACC3, har vist seg å være en viktig aktør i reguleringen av sentrosomen /mikrotubulidynamikk under mitose og funnet å være deregulert i en rekke humane maligniteter. Våre tidligere undersøkelser har antydet at TACC3 kan være involvert i livmorhalskreft progresjon og chemoresistance, og dets overekspresjon kan indusere epitelial-mesenkymale overgang (EMT) ved aktivering av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /akt og ekstracellulære signalregulerte protein kinaser (ERK ) signaltransduksjonsveier. Men oppstrøms mekanismer for TACC3-mediert EMT og funksjonell /klinisk betydning i menneskets livmorhalskreft forblir unnvikende. Epidermal vekstfaktor (EGF) er blitt vist å være en potent induser av EMT i livmorhalskreft og forbundet med tumorinvasjon og metastase. I denne studien fant vi at TACC3 er overuttrykt i livmorhalskreft og kan induseres ved EGF stimulering. Induksjon av TACC3 av EGF er avhengig av tyrosinkinase-aktivitet av EGF-reseptor (EGFR). Forbløffende uttømming av TACC3 opphever EGF-mediert EMT, noe som tyder på at TACC3 er nødvendig for EGF /EGFR-drevet EMT prosess. Videre Snail, en sentral aktør i EGF-mediert EMT, er funnet å være korrelert med uttrykk for TACC3 i livmorhalskreft. Kollektivt, fremhever vår studie en roman funksjon for TACC3 i EGF-mediert EMT prosess og antyder at målretting av TACC3 kan være en attraktiv strategi for å behandle livmorhalskreft drevet av EGF /EGFR signalveier
Citation. Ha GH, Kim JL, Breuer E-KY (2013) TACC3 er avgjørende for EGF-mediert EMT i livmorhalskreft. PLoS ONE åtte (8): e70353. doi: 10,1371 /journal.pone.0070353
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 18 mars 2013; Godkjent: 17 juni 2013; Publisert: 01.08.2013
Copyright: © 2013 Ha et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Epitelial-mensenchymal overgang (EMT) er en høyt. konservert biologisk prosess som resulterer i en konvertering av polariserte epitelceller til mesenchymale celletyper preget av tapet av E-cadherin-mediert celle-celle kontakter samt oppkjøpet av økte trekkende og invasive potensialer [1] – [9]. Transcriptional faktorer Snail, Slug, Twist og Zeb1 har blitt identifisert som negative regulatorer av E-cadherin og anses å være potente onkogene indusere av EMT [10] – [14]
Til tross for den store suksessen til tidlig screening. programmer, er livmorhalskreft fremdeles den ledende årsaken til gynekologisk dødsfall blant kvinner over hele verden [15], [16]. Menneskelige papillomavirus (HPV) er antatt å være den viktigste årsaken til livmorhalskreft; Undersøkelser har imidlertid vist at viruset alene er ikke nok til å utvikle kreft [15], [17], [18]. Epidermal vekstfaktor (EGF) er blitt vist å være en av de mest potente induktorer av EMT i livmorhalskreft og forbundet med cervical stromal invasjon og metastase nodal [15], [19]. Kronisk EGF behandling induserer EMT via oppregulering av EMT-induserende transkripsjonsfaktor snegle i cervikale kreftceller, og EGF-mediert EMT er korrelert med EGF-reseptor (EGFR) overekspresjon og klinisk progresjon av kreft i livmorhalsen [15], [20]. Ekspresjonen av EGFR har blitt funnet å være overuttrykt i livmorhalskreft [21].
formerer sure kveil-spole protein (TACC) familien er kjennetegnet ved et konservert C-terminal «TACC domene», essensielle for interaksjon med tubulin og mikrotubuli [22] – [24] og har vært kjent for å spille en sentral rolle i reguleringen av sentrosomen og mikrotubulidynamikk [22], [25] – [29]. Det er tre TACC proteiner identifisert i human: TACC1, TACC2 og TACC3 [24], [30] – [32]. TACC3 er involvert i sammenstillingen og organisering av mikrotubuler og kromosom innretting under mitose, opprettholdelse av kjerne konvolutt struktur og regulering av cellevekst /differensiering og gentranskripsjon [24], [26], [27], [29], [ ,,,0],33] – [38]. Nedbryting av
TACC3
forårsaker veksthemming og embryonale dødelighet hos mus som følge av økt apoptose [39].
Selv om rollen som TACC3 i menneskelig kreft er ikke klart, montering bevis tyder på at deregulering av TACC3 kan være direkte eller indirekte knyttet til visse typer kreft hos mennesker [24]. Genetiske varianter på kromosom 4p16.3, regionen som koder for
TACC3
, finnes i forskjellige humane cancere [9], [24], [40] – [48]. Fibroblast growth factor receptor 3-genet (
FGFR3
) og
TACC3
er nært lokalisert på kromosom 4p16.3 [9], [32]. Nylig ble en TACC3-FGFR3 fusjonsprotein rapportert i en undergruppe av glioblastoma multiforme (GBM) [49] og blære tumorvev og cellelinjer [50]. Dette fusjonsprotein induserer mitotisk defekter og Aneuploidy og aktiverer mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) signalveien [49], [50]. Så langt, en somatisk mutasjon (E680K) og to konstitusjonelle mutasjoner (S93L og G514E) av
TACC3
har blitt identifisert i GBM og eggstokkreft, henholdsvis [40], [51], [52]. Studier har vist at oppregulering av TACC3 er funnet i glioblastom, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og multippel myelom [40], [53], [54], og kan bidra til å lymphomagenesis [55], [56]. Genuttrykk profilering analyse har avdekket at
TACC3
er oppregulert ved overgangen fra ductal carcinoma
in situ
til invasivt karsinom i brystet og i eggstokkreft [57] – [59]. Vi har tidligere foreslått at TACC3 kan være direkte eller indirekte forbundet med tumorprogresjon og medikamentresistens av livmorhalskreft, basert på data innhentet fra mikromatriseanalyse for å identifisere gener som reguleres av TACC3 [24], [60]. Dessuten har vår nylig studie vist at ektopisk ekspresjon av TACC3 øker proliferasjon, vandrende /invasive egenskaper og transformasjon kapasitet av HeLa cervical kreft celler og viser et mer mesenchymale fenotype, ledsaget av nedregulering av epitelial markør E-cadherin og oppregulering av mesenchymale markører N-cadherin og vimentin samt EMT indusere sneglen og Slug [9]. På den annen side, er uttømming av TACC3 stand til å reversere /undertrykke EMT [9]. Selv om våre funn indikerer at TACC3 kan spille en viktig rolle i EMT, oppstrøms signal hendelsene som er ansvarlige for TACC3-mediert EMT fortsatt ikke bestemt.
Heri, viser vi at TACC3 er overuttrykt i livmorhalskreft. TACC3 kan induseres ved EGF, og EGF-mediert TACC3 induksjon er avhengig av EGFR aktivering. Viktigere, i fravær av TACC3, er EGF ikke er i stand til å indusere EMT, noe som tyder på at TACC3 er nødvendige for EGF-mediert EMT i livmorhalskreft. Videre finner vi en sammenheng mellom TACC3 og EGF indus Snail i livmorhalskreft. Våre funn, derfor identifisere en ny mekanisme som formidler EGF /EGFR-indusert EMT og en potensiell terapeutisk mål for livmorhalskreft.
Materialer og metoder
microarray og Immunohistochemistry
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP microarray (CR805, CR1003 og CR1501) ble kjøpt fra USA Biomaks (Rockville, MD). Tissue microarray pasientinformasjon er vist i Tabell 1. Tissue microarray lysbilder ble deparaffinized, rehydrert og varmebehandlet for antigen gjenfinning før antistoff farging [61]. Glassene ble inkubert med et anti-TACC3-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i 1 time ved romtemperatur, etterfulgt av inkubasjon med sekundært biotinylert antistoff og avidin biotin kompleks (ABC) i samsvar med Vectastain ABC kit-protokollen (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Etter å ha utviklet farge med diaminobenzidin (DAB), ble platene uavhengig vurdering av forfatterne. Intensiteten av farging ble registrert som følger: 0 for negative uttrykk; 1+ for svakt positivt uttrykk; 2+ for middels positiv uttrykk; og 3+ for svært positivt uttrykk. Mikroskopbilde (forstørrelse x 100) ble tatt av DP12 mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) er utstyrt med DP71 digitale bildesystem (Olympus).
Cell Culture, Antistoffer og reagenser
menneskelig livmorhalskreft (HeLa, CaSki, Siha og C33A) og HPV-udødelig ectocervical epitel (Ect1 /E6E7) cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginia). HeLa-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) (HyClone, Logan, UT) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gemini Bio-Products, Woodland, CA) og 1% penicillin /streptomycin-løsning (Thermo Fisher Scientific , Waltham, MA). CaSki-celler ble holdt i RPMI-1640 medium (HyClone) inneholdende 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin-løsning. Siha og C33A-celler ble dyrket i MEM (HyClone) supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin-løsning. Ect1 /E6E7 celler ble dyrket i keratinocytt-serumfritt medium (Ker-SFM; GIBCO /BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) med 0,1 ng /ml human rekombinant EGF, 0,05 mg /ml bovint hypofyseekstrakt, og ytterligere kalsiumklorid 44,1 mg /L (sluttkonsentrasjon 0,4 mM). Celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2. Anti-TACC3 antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. Antistoffer mot E-cadherin, N-cadherin, vimentin, sneglen, Slug og EGFR ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-β-aktin-antistoff og EGF ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). EGFR kinase inhibitor AG1478 ble kjøpt fra Selleckchem (Houston, Texas).
shRNA og Transfeksjon
Celler ble transfektert med en TACC3 spesifikk eller en kontroll shRNA (Santa Cruz Biotechnology) ved hjelp Fugene 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) i henhold til produsentens instruksjoner.
Western blot analyse
Menneskelige normale livmorhalsen vev lysatene ble kjøpt fra IMGENEX (San Diego, California). Celleekstrakter ble fremstilt i en lyseringsbuffer bestående av 50 mM Tris-Cl (pH 7,4), 1% nonyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), 0,25% natrium-deoksycholat, 150 mM natriumklorid (NaCl), 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) , 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM natriumfluorid (NaF) og Komplett proteasehemmer cocktailer (Roche Molecular Biochemicals). Cellelysater ble fjernet ved sentrifugering ved 13 000 rpm i 10 minutter, og supernatantene ble underkastet Western blot-analyse. Like mengder protein ble separert ved natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) og overført til nitrocellulosemembran. Etter blokkering med Tris-bufret saltvann (TBS) /0.1% Tween 20 (TBS-T) supplert med 5% fettfri tørrmelk i 1 time, ble membranene inkubert med primære antistoffer fortynnet i blokkeringsbuffer i to timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer (Bio-Rad, Hercules, CA) i 1 time ved romtemperatur. Til slutt, ble antigen-antistoffkompleksene påvist ved den forbedrede kjemiluminescens (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Bånd ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare (https://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, MD) og normalisert til p-aktin.
Kvantitativ Real Time-polymerase kjedereaksjon (QRT -PCR)
Total RNA fra celler ble hentet med RNeasy® mini kit (Qiagen Sciences, Germantown, MD) og deretter utsatt for cDNA syntese bruker RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas biovitenskap Europa, Bremen, Tyskland). Uttrykket av gener ble analysert ved hjelp av en iQ ™ SYBR
R Grønn SuperMix (Bio-Rad) og en iCycler iQ5 real-time PCR deteksjon system (Bio-Rad). De følgende sykkelbetingelser ble benyttet: 95 ° C i 5 minutter og 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser med 15 sek ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C. Data ble analysert med en normalisert genuttrykk metode (ΔΔ Ct) [62] med iQ5 Optical System Software (Bio-Rad), og
β-aktin
ble brukt som en referanse for normalisering. Sekvensen av primer-parene var som følger:
TACC3
5′-gaactggggaagatcatgga-3 «og 5′-ctcttcgttcttgcggtagc-3» [63];
β-aktin
5actinINK \\ l \\ o «Ulisse, 2007 # 484» gtagc-3 «CGG-3i [64]. Alle målingene ble utført i tre eksemplarer.
Transwell migrasjon analysen
Ubestrøket cellekultur inserts (8-mikrometer porer, 24-brønn) (Greiner Bio-One, Monroe, NC) ble sådd med 1 x 10
5-celler i 200 ul serumfritt medium. De nederste kamre ble fylt med 750 mL av komplette media som inneholder 10% FBS. Etter 16 timer inkubering ble cellene på den øvre overflaten av filteret tørkes av, og cellene som hadde migrert til den lavere overflaten av filteret ble fiksert med 4% paraformaldehyd eller iskald metanol i 5 minutter, farget med 0,05% krystallfiolett i 20 min og kvantifisert spektrofotometrisk ved 490 nm.
Invasion analysen
Invasion analysene ble utført ved hjelp av QCM ECMatrix celle invasjon analysesett (Millipore, Temecula, CA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistical Analysis
statistiske analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, California). Signifikans ble bestemt ved
t
-test og enveis variansanalyse (ANOVA), etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest. Pearsons korrelasjonskoeffisient ble anvendt for å måle korrelasjon mellom to variabler. En
p-verdi
på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikans.
Resultater
TACC3 er overuttrykt i Livmorhalskreft
For å undersøke den kliniske betydningen av TACC3 i menneskelig livmorhalskreft, må vi først undersøkte uttrykk for TACC3 mRNA i livmorhalskreft ved bruk av offentlig tilgjengelig Oncomine database (www.oncomine.org, Compendia Bioscience, Inc., Ann Arbor, Michigan) [65] og fastslått at TACC3 er sterkt uttrykt i livmorhalskreft [66], [67]. Overekspresjon av TACC3 i livmorhalskreft ble ytterligere bekreftet i flere livmorhalscellelinjer, inkludert Ect1 /E6E7 (HPV-16 E6 /E7 forvandlet ectocervical epitel), CaSki (HPV-16), C33A (HPV-negative), HeLa (HPV-18 ) og Siha (HPV-16) sammenlignet med tre normale humane cervix vev. Som vist i figur 1A, ekspresjonen av TACC3 i disse cellelinjene var høyere enn det normale vev cervix. Interessant nok var det ingen signifikant forskjell i uttrykket av TACC3 mellom HPV-negative C33A og andre celler som bærer HPV onkogener (Ect1 /E6E7, CaSki, HeLa og Siha), noe som tyder på at HPV infeksjon kan ikke være ansvarlig for overekspresjon av TACC3. Vi har også immunohistochemically analysert uttrykk for TACC3 hjelp livmorhalskreft microarray. TACC3 var nesten umulig å oppdage i normal cervix, mens dens sterke uttrykk ble observert i livmorhalskreft vev (Figur 1b). Det var imidlertid ingen signifikant sammenheng med TACC3 uttrykk med klinisk stadium eller grad av sykdommen (figur 1C, 1D og S1). Basert på våre funn at uttrykket av TACC3 er forhøyet i livmorhalskreft i forhold til normal cervix, men ikke signifikant assosiert med sykdomsprogresjon, foreslår vi at økt uttrykk av TACC3 kan oppstå i de tidlige stadier av svulst utvikling, samt være avgjørende for å opprettholde livmor tumorgenese.
(A) Et uttrykk for TACC3 i Ect1 /E6E7 (HPV-udødelig ectocervical epitelial), CaSki (HPV-16), C33A (HPV-negative), Siha (HPV-16) og HeLa ( HPV-18) cellelinjer ble bestemt ved western blot-analyse. Uttrykket nivåer ble sammenlignet med tre normale cervix vev. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Intensiteten av båndene ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ programvare og normalisert til p-aktin. Dataene som vises, er middelverdier ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter. (B) Representant immunhistokjemisk farging på livmorhalskreft vev microarray. Kvantitativ analyse av livmorhalskreft microarray viste at uttrykket av TACC3 er høyere i livmorhalskreft enn i normal livmorhalsen, men dens uttrykk ikke korrelerer med tumorstadium (C) eller klasse (D). Dataene som vises, er middelverdier ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter. *,
p
0,05; **,
p
. 0,001
EGF Stimulering induserer Endogen TACC3 Expression i EGFR-uttrykke celler
Vår tidligere studie viste at overekspresjon av TACC3 induserer EMT , ledsaget av nedregulering av E-cadherin og oppregulering av sneglen og Slug, mens uttømming av TACC3 reverserer EMT [9]. I tillegg, er aktiveringen av Akt og ERK signalveier avgjørende for TACC3-mediert EMT [9]. Her søkte vi å finne ut hvordan TACC3 deltar i EMT. Forskjellige vekstfaktorer, slik som EGF, transformerende vekstfaktor β (TGF-β) og insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF-1) har vist seg å indusere EMT og er signifikant assosiert med den invasivitet, metastaser og tilbakefall av kreft i livmorhalsen [ ,,,0],15], [68] – [70]. EGF er blitt vist å indusere EMT via oppregulering av snegle i livmorhalskreft-celler [15] og aktivere Akt og ERK signalveier [71], [72]. Basert på disse studiene, hypotese vi at TACC3 kan være involvert i EGF-mediert EMT. For å teste vår hypotese, behandlet vi HeLa, CaSki og Siha celler med 50 ng /ml EGF i 24 timer og deretter undersøkt de morfologiske endringer i celler og uttrykket av EMT markører. Som vist i figur 2A, celler behandlet med EGF vist morfologiske og fenotypiske trekk ved EMT. Intriguingly, både protein (figur 2B) og mRNA (figur 2C) nivåer av TACC3 ble signifikant øket ved EGF-stimulering, ledsaget av nedregulering av epitelial markør E-cadherin og oppregulering av mesenchymale markør vimentin samt EMT induse sneglen og Slug i HeLa, CaSki og Siha celler (figur 2B). Tidsforløpet forsøk ble også utført for å verifisere induksjon av TACC3 på EGF stimulering. EGF indusert en vedvarende uttrykk for TACC3 i CaSki og Siha celler opp til 48 timer, mens en midlertidig økning i TACC3 uttrykk ble funnet i HeLa celler (Figur S2). Vi fant også at EGF fremmet trekkende og invasive egenskapene til HeLa og Siha celler (figur 2D og 2E), i samsvar med andre studier [15], [73]. Vi fikk ikke se noen vesentlige endringer i cellen morfologi (figur 3A), uttrykk for TACC3 og andre EMT markører (Figur 3B), eller motilitet (figur 3C) i EGF-behandlede C33A celler. Dette er mest sannsynlig fordi C33A uttrykker svært lave eller ikke målbare nivåer av EGFR (figur 3D). Disse resultatene tyder på at EGFR er nødvendig for EGF-mediert induksjon av TACC3 og påfølgende EMT.
(A) livmorhalskreft celler behandlet med EGF viste en morfologisk endring i forbindelse med EMT. (B og C) Både protein (B) og mRNA (C) nivåer av TACC3 ble oppregulert på EGF-stimulering, i tillegg til nedregulering av E-cadherin og oppregulering av vimentin, snegl og Slug. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. Intensiteten av båndene ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ programvare og normalisert til p-aktin. MRNA nivået av TACC3 var representert i forhold til p-aktin transkripsjoner. Dataene som vises, er middelverdier ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter. (D og E) HeLa og Siha celler behandlet med eller uten EGF ble underkastet transwell migrasjon (D) og matrigel invasjons assays (E) (se Materialer og Metoder). Celler ble inkubert med eller uten 50 ng /ml EGF i 24 timer. Dataene som vises, er middelverdier ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter. *,
p
0,05; **,
p
0,01; ***,
p
0,005; ****,
p
. 0,001
C33A celler behandlet med EGF viste ikke signifikante endringer i cellen morfologi (A), uttrykk for TACC3 og EMT markører (B ), eller motilitet (C). Celler ble inkubert med eller uten 50 ng /ml EGF i 24 timer og deretter underkastet Western blot og transwell migrasjon analyser. Intensiteten av båndene ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ programvare og normalisert til p-aktin. Dataene som vises, er middelverdier ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter. (D) Uttrykket av EGFR i Ect1 /E6E7, CaSki, C33A, Siha og HeLa cellelinjer ble bestemt ved western blot analyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Intensiteten av båndene ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ programvare og normalisert til p-aktin. Data som vises er midler ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter.
Aktivering av EGFR er nødvendig for EGF-mediert induksjon av TACC3
Som vår data indikerer at EGF behandling kan øke ekspresjon av TACC3 i EGFR-uttrykkende celler, spurte vi om EGF-mediert induksjon av TACC3 er avhengig av tyrosinkinase-aktiviteten til EGFR. AG1478 er en tyrosinkinase inhibitor av EGFR, som blokkerer EGFR-mediert signaliseringshendelser [74], [75]. Behandling med 5 uM av AG1478 opphevet EGF-induserte morfologiske endringer (figur 4A) og TACC3 induksjon (figur 4B), og som en konsekvens, ble EGF-mediert EMT inhibert (figur 4B). Disse dataene tyder på at aktivering av EGFR er nødvendig for EGF-mediert induksjon TACC3.
hemning av tyrosin-kinase-aktivitet av EGFR avskaffet en morfologisk endring i forbindelse med EMT (A) og EGF-mediert TACC3 induksjon (B). Celler ble behandlet med EGF eller EGF + AG1478 i 24 timer og deretter utsatt for Western blot-analyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Intensiteten av båndene ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ programvare og normalisert til p-aktin. Dataene som vises, er middelverdier ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter. *,
p
. 0,001
TACC3 er nødvendig for EGF-mediert EMT Process
Siden både TACC3 og EGF kan fremme EMT gjennom aktivering av PI3K /Akt og ERK signalveier [9], [71], [72], og TACC3 kan være oppregulert ved EGF-stimulering (figur 2B, 2C og S2), spurte vi hvorvidt TACC3 spiller en viktig rolle i EGF-mediert EMT . For å løse dette spørsmålet, utarmet vi TACC3 bruker en lentiviral vektor levere shRNA spesifikt for TACC3 i HeLa og Siha celler og behandles med eller uten EGF. Som vi tidligere har rapportert [9], uttømming av TACC3 førte til oppregulering av E-cadherin og nedregulering av vimentin, Snail og Slug i HeLa og Siha celler sammenlignet med kontrollceller (figur 5A). Forbløffende nok EGF behandling på TACC3-utarmet celler var ikke i stand til å hente den uttrykk for EMT markører (figur 5A), celle morfologi (figur 5B), celle migrasjon (figur 5C) eller invasjon kapasitet (figur 5D). Disse funnene tyder på at TACC3 kan spille en nøkkelrolle i EGF-mediert EMT.
I fravær av TACC3, EGF var ikke i stand til å regulere EMT markører (A), endre celle morfologi (B), eller forbedre celle migrasjon og invasjon evner (C og D). Cellene ble transient transfektert med shRNAs mot kontroll (eggerøre,
shCon
) eller TACC3 (
shTACC3
) og behandlet med eller uten EGF i 24 timer. Cellene ble deretter underkastet Western blot, transwell migrering og invasjon Matrigel analyser. Intensiteten av båndene ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ programvare og normalisert til p-aktin. Dataene som vises, er middelverdier ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter.
*
,
p
0,01;
**, p
. 0,001
En positiv korrelasjon mellom TACC3 og Snail Expression i Livmorhalskreft
snegle har vært kjent for å bli indusert av EGF , og dermed utløser EGF-mediert EMT [15], [76]. Vi fant at TACC3 ble også indusert ved EGF-stimulering (figur 2B og 2C) og positivt regulerer ekspresjonen av sneglen [9]. Derfor spurte vi om det er noen sammenheng mellom TACC3 og Snail uttrykk i livmorhalskreft. Viktigere, fant vi at uttrykket av sneglen ble forhøyet i livmorhalskreft (Figur 6A og 6B) og korrelert med TACC3 uttrykk (figur 6C). Imidlertid gjorde TACC3 uttrykk ikke korrelerer med uttrykk for Slug, et annet medlem av Snail familien (data ikke vist).
(A) Representant immunhistokjemisk farging av TACC3 og Snail på livmorhalskreft vev microarray. Kvantitativ analyse av livmorhalskreft microarray viste at (B) uttrykk for sneglen er høyere i livmorhalskreft enn i normal cervix. Dataene som vises, er middelverdier ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter. *,
p
0,001 (C) Snail uttrykk korrelerer med TACC3 uttrykk (r = 0,80383,
p 0,0001
).
Diskusjoner
Man har mistanke om at deregulering (både opp- og nedregulering) av TACC3 kan være forbundet med utvikling av forskjellige typer av kreft hos mennesker [24], [77], [78]. Så langt, enten TACC3 fungerer som en tumor suppressor eller et onkogen ikke er klart definert på grunn av avvik mellom studiene [24], [79]. Alternativt kan TACC3 har forskjellige funksjoner avhengig av den type celle eller organ. I denne studien ønsket vi å undersøke den funksjonelle betydningen av TACC3 i livmorhalskreft. Vår livmorhalskreft vevet microarray analyse viste at uttrykket av TACC3 protein er oppregulert i livmorhals plateepitelkarsinom, den vanligste typen av livmorhalskreft (ca. 80-90%) [80]. Dette stemmer overens med data oppnådd fra Oncomine [67] og antyder dens potensielle rolle som et onkogen i livmorhalskreft. Vår studie antyder også at uttrykket av TACC3 ikke kan reguleres ved HPV E6 /E7 onkogener, men i øyeblikket, kan vi ikke utelukke muligheten for at TACC3 uttrykk er regulert av HPV-onkogener eller korrelert med de typer HPV.
EGF utløser en kaskade av signalanlegg hendelser gjennom samspill med sin reseptor, EGFR [81], og har vist seg å være en potent induser av EMT i livmorhalskreft [15]. EGF /EGFR signal hendelser er forbundet med akselerert tumorprogresjon av livmorhalskreft [15], [19], [82]. I denne studien fant vi at TACC3 ble oppregulert på EGF stimulering, og uttømming av TACC3 avskaffet EGF-mediert EMT prosess i livmorhalskreftceller. Videre induksjon av TACC3 av EGF ble vellykket hemmet av EGFR-inhibitor AG1478, noe som indikerer at EGF-mediert induksjon TACC3 og påfølgende EMT er avhengig av EGFR aktivering. Interessant, fant vi at i C33A celler, TACC3 uttrykk var mye høyere enn i CaSki eller Siha celler, til tross for fraværet av EGFR uttrykk. Selv om vår studie antyder at EGFR-aktivering kan være en av de mekanismene som er ansvarlige for regulering av ekspresjonen av TACC3, oppstrøms signalisering som regulerer ekspresjonen av TACC3 har ennå ikke blitt godt definert. Det har så langt vært bare en publisert studie som viser redusert TACC3 protein stabilitet i en Cdh1 avhengig måte [83]. TACC3 samhandler med en aktivator av E3 ubiquitin ligase anaphase fremmende kompleks /cyclosome (APC /C), Cdh1, og dets interaksjon reduserer TACC3 protein stabilitet gjennom Cdh1-mediert ubiquitinering og degradering under cellesyklusprogresjon. En mulighet vi vurdere er at C33A celler kan uttrykke lavere nivåer av Cdh1 enn andre cellelinjer, og dermed opprettholde høye nivåer av TACC3. Interessant, i motsetning Siha, CaSki og HeLa cellelinjer, C33A cellene ikke båtplass HPV genomer men inneholder mutert p53 [84] og pRb [85]. I tillegg er forskjellige vekstfaktor-reseptorer uttrykt i C33A er noe forskjellig fra Siha, CaSki og HeLa-celler [86], [87]. Derfor er det mulig at TACC3 uttrykk kan være regulert av ulike signalveier avhengig av celletype.
Det er en økende mengde bevis som viser foreningen av TACC3 med EGFR signalveier. TACC3 har blitt identifisert som et samspill partner av signalet transduseren og aktivator av transkripsjon 5 (STAT5) [39], og dets ekspresjon er vist å være korrelert med Aurora A-ekspresjon i visse typer kreft [40], [63]. Forbløffende nok EGFR også tilknyttede selskaper og samarbeider med STAT5 å målrette og øke uttrykket av Aurora A, og dens uttrykk er funnet å være korrelert med Aurora Et uttrykk i bryst og kolorektal kreft [81]. Derfor er det rimelig å tro at TACC3 kan danne et kompleks med EGFR direkte eller indirekte gjennom dets interaksjon med STAT5, og på den måten være involvert i EGFR-signaliseringsreaksjonsveier. TACC3 ble også oppdaget som en aryl hydrokarbon reseptor (AhR) atom Translocator (ARNT) -interacting protein [88]. ARNT tilhører den grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) -Per-ARNT-Sim (PAS) familie som dimerizes med AhR og hypoksi-induserbar faktor α (HIF α) ved miljømessige stress [89], [90]. Som et transkripsjon kofaktor, er TACC3 stand til å regulere transkripsjonen aktivering av HIF ved direkte interaksjon med ARNT [91]. En fersk studie har vist at ARNT spiller en viktig rolle i epidermal differensiering gjennom regulering av EGFR-ERK signalveier [92]. Det er således fristende å spekulere en mulig involvering av TACC3 i nettverket av ARNT-EGFR-ERK å regulere keratinocytt-differensieringen.
EGFR er uttrykt ved moderate til høye nivåer i livmorhalskreft, og dets ekspresjon er assosiert med klinisk stadium og dårlig prognose [93], [94]. Mutasjoner i
EGFR
har vist seg å være sjelden i høyverdig invasiv livmorhalskreft [95]. Så langt har bare noen få småskala kliniske studier blitt testet for å evaluere effekten av EGFR-hemmere for behandling av livmorhalskreft. Dessverre, EGFR-hemmer monoterapi var ikke effektiv hos pasienter med tilbakevendende locoregionally avansert eller metastaserende livmorhalskreft [94], [96]. Kombinasjoner av EGFR-hemmere med kjemoterapi eller kjemoradioterapi er for tiden under etterforskning.
Siden TACC3 er overuttrykt i livmorhalsen og andre kreftformer og ser ut til å være en sentral aktør i EGF /EGFR-drevet EMT prosess, er det mulig at utarming av TACC3 kan være en god tilnærming for å behandle kreft som er drevet av EGF /EGFR signalveier eller resistente mot anti-EGFR-terapi. Selv om mutasjoner i
EGFR
i høyverdig invasiv livmorhalskreft er sjeldne, ville det være viktig å studere en sammenheng mellom TACC3 uttrykk og
EGFR
mutasjoner. Samlet sett våre funn tyder på at TACC3 spiller en viktig rolle i EGF-mediert EMT og kan tjene som et attraktivt terapeutisk mål for kreft hos mennesker drevet av EGF /EGFR-signalveier.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
ekspresjon av TACC3 i livmorhalskreft med hensyn til graden av sykdommen og histologisk gradering. Uttrykket av TACC3 med ulike sykdomsstadier og tumor karakteren ble presentert. *,
p
0,05; **,
p
0,01; ***,
p
0,001
doi: 10,1371 /journal.pone.0070353.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
EGF stimulering induserer endogen TACC3 uttrykk. TACC3 ble indusert ved EGF behandling. Celler ble inkubert med eller uten 50 ng /ml og deretter oppsamlet ved de angitte tidspunkter for western blot-analyse.
