Abstract
Solide svulster finnes i en hypoksisk mikromiljøet, og har høy glykolytiske metabolitter. For å unngå acidose, må tumorceller oppvise en dynamisk cytosolisk pH-reguleringsmekanisme (r). Spenningen-gated proton kanal HV1 formidler NADPH oksidase funksjon ved å kompensere mobil tap av elektroner med protoner. Her viste vi for første gang, at HV1 ekspresjon økes i kolorektal tumorvev og cellelinjer, assosiert med dårlig prognose. Immunhistokjemi viste at HV1 er sterkt uttrykt i adenokarsinomer, men ikke eller ydmyk uttrykt i normal kolorektal eller hyperplastiske polypper. HV1 ekspresjon i kolorektal cancer er signifikant assosiert med tumorstørrelsen, tumor klassifisering, lymfeknute status, klinisk stadium og p53 status. Høy HV1 uttrykk er knyttet betydelig med kortere samlet og tilbakefall overlevelse. Videre real-time RT-PCR og immunocytochemistry viste at HV1 er sterkt uttrykt i kolorektal kreft cellelinjer, SW620, HT29, LS174T og Colo205, men ikke i SW480. Hemninger av HV1 uttrykk og aktivitet i de svært metastatiske SW620 celler ved små interfererende RNA (siRNA) og Zn
2 + henholdsvis markant redusere celle invasjon og migrasjon, tilbakeholdenhet proton ekstrudering og den intracellulære pH utvinning. Våre resultater tyder på at HV1 kan anvendes som en potensiell biomarkør for diagnose og prognose av kolorektal karsinom, og et potensielt mål for anticancermedikamenter i kolorektal kreftterapi
relasjon:. Wang Y, Wu X, Li Q, Zhang S, Li SJ (2013) Menneskelig spenningsstyrte Proton Channel HV1: en ny potensiell biomarkør for diagnose og prognose av tykktarmskreft. PLoS ONE åtte (8): e70550. doi: 10,1371 /journal.pone.0070550
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 27 januar 2013; Godkjent: 19 juni 2013; Publisert: 05.08.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31271464). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
spennings~~POS=TRUNC-gated protonkanal HV1 ble identifisert ved hjelp av bioinformatikk søk basert på kjente sjonskanaler, som hovedsakelig er uttrykt i immunceller som makrofager, nøytrofile og eosinofile [1], [2]. HV1 i pattedyr fagocytter ble foreslått for å være ansvarlig for proton-transporterende bane, som regulerer intracellulære pH-verdien i løpet av oksygenforbruk i forbindelse med fagocytose, kalt «luft burst» [3], [4]. HV1 blir aktivert av depolarisering og intracellulær forsuring, hvis aktivitet opprett intracellulær pH nøytral å holde reaktive oksygenarter (ROS) generasjon [5], [6]. HV1 ikke bare regulerer pH-verdien i cytoplasma, men kan også tilveiebringe protoner i phagosome, en lukket membran rom for å drepe og fordøyelse av et patogen [3]. HV1 er ekstremt selektiv for H
+, uten påvisbare permeabilitet for andre kationer [7], [8]. Spenningen aktivering forhold HV1 avhenger sterkt av både den intracellulære pH (pH
i) og ekstracellulære pH (pH
o). Øker pH
o eller senke pH-verdien
i fremmer H
+ kanalåpningen ved å forskyve aktiverings terskelen til mer negative potensialer [3]. Videre er HV1 nåværende hemmet av submillimolar konsentrasjoner av Zn
2 + og Cd
2 + og andre toverdige kationer [9]
HV1 inneholder tre spådd domener. N-terminal syre og proline- rike domenet, transmembranspenningssensor domene (VSD), og C-terminale domenet. Spenningsstyrte K
+ -kanaler består av fire underenheter, som hver har en pore-domene og et VSD. De fire pore domener kommer sammen for å danne en enkelt sentral pore, og fire eksterne VSD kontrollere porten til pore [10]. I motsetning til de spenningsstyrte K
+ -kanaler, inneholder HV1 et VSD men mangler den pore-domenet. Nyere studier har vist at HV1 fungerer som en dimer i hvilken det intracellulære C-terminale domenet er ansvarlig for den dimere arkitekturen av proteinet, og for hver underenhet inneholder sin egen proton-transporterende bane [11] – [14]. Den intracellulære C-terminale domene av HV1 danner en dimer via en parallell
α
-helical coiled-coil og er essensiell for protein lokalisering [14].
Tumorceller ofte eksisterer i et hypoksisk mikromiljøet, og besitter høy glycolytic aktivitet og produserer sure metabolitter [15], [16]. For å unngå acidose som følge av reduksjon i cytosol pH, må tumorcellene ekstrudere excessing cytosoliske protoner for å opprettholde cytosolisk pH, noe som resulterer i surt mikromiljø tumor. Den hypoksisk og syrlig svulsten mikromiljøet spiller en nøkkelrolle i utviklingen av kreft, progresjon, og metastase [15]. Vår tidligere arbeid viste at HV1 er spesielt uttrykt i svært metastatisk humane brystsvulstvevet og cellelinjer, og fremmer brystkreft celle progresjon og metastase, gjennom regulering av brystkreft celle intracelular pH [17], [18]. I denne studien undersøkte vi uttrykket av HV1 med kolorektal kreft vev og cellelinjer og dens potensial tilknytning clinicopathological funksjoner og post-resectional overlevelse. Hemninger av HV1 uttrykk og aktivitet i de svært metastatisk kolorektal kreft celler markert redusere celle invasjon og migrasjon, beherskelse proton ekstrudering. Våre resultater tyder på at HV1 overuttrykk kan brukes som en selvstendig biomarkør for prognose og diagnostisering av pasienter med tykk- og endetarmskreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
All av prosedyrene ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen og relevante retningslinjer i Kina. Vi innhentet skriftlig informert samtykke fra alle deltakerne i vår undersøkelse. Studien innhentet etikk godkjenning for vår studie fra etisk komité for Tonghua Center Hospital.
Pasienter og prøver
kolorektal kreft vevsprøver ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk rutine kurativ kirurgi ved Kirurgisk avdeling , Tonghua Center Hospital mellom 2001 og 2007. pasientene ble ikke forbehandlet med strålebehandling eller kjemoterapi før operasjonen. 139 kolorektal kreft vev og sammenkoblede tilstøtende ikke-tumor kolorektal vev ble fiksert i 10% formalin og innstøpt i parafin for immunhistokjemisk analyse. De clinicopathological funksjoner av disse pasientene ble vist i tabell 1. I tillegg til å kontrollere uttrykk for HV1 i premaligne dysplastiske lesjoner, ble 10 normal kolorektal, 18 hyperplastisk polypp og 20 adenom vev også undersøkt ved hjelp av immunhistokjemi. Hver pasientens kliniske status ble klassifisert i henhold til den patologiske svulst klasse, tumorstørrelse, lymfeknutestatus. Tumor differensiering ble gradert av Edmondson karakterskala. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Tonghua Center Hospital, og informert samtykke ble innhentet fra hver pasient.
Generering av en anti-HV1 polyklonale antistoff
En anti-HV1 polyklonale antistoff ble dannet mot den karboksyl-terminale domenet av HV1 (restene 221-273 av HV1, KTRSERQLLRLKQMNVQLAAKIQHLEFSCSEKEQEIERLNKLLRQHGLLGEVN). Proteinet ble renset til homogenitet etter ekspresjon i
Escherichia coli product: [19]. Det rensede proteinet ble injisert i mus og anti-HV1 polyklonalt antistoff ble renset ved rProtein A Sepharose (GE, Healthcare) kolonne. HRP-konjugert geite-anti-muse IgG ble ervervet fra Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA).
Ekspresjonsvektor og transfeksjon
HV1 cDNA ble klonet inn i pEGFP-N1 (Clontech ) for å skape HV1 ekspresjonsplasmid pHv1-EGFP, smeltet sammen med den forbedrede grønt fluorescerende protein (EGFP) gruppe bundet til den C-terminale ende av HV1 [14]. 293 T-celler ble dyrket i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium; GIBCO) med 10% føtalt bovint serum pluss antibiotika (100 enheter /ml penicillin og 100 g /ml streptomycin, GIBCO) i en 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C. Celler dyrket på dekkglass på 50-70% samløpet i en seks-brønns plate ble transient transfektert med pHv1-EGFP plasmid ved hjelp lipofektamin 2000 (Invitrogen) etter produsentens protokoll. Celler ble anvendt for forsøkene 36-48 timer etter transfeksjon.
Western blotting
Western blotting ble utført med et anti-HV1 polyklonalt antistoff (1 mg /ml) som beskrevet ovenfor med en sluttfortynning av en 1000. denaturerte proteinene ble separert ved 12,5% SDS-PAGE og deretter overført til en PVDF-membran (GE, Healthcare) ved å fukte elektroblotting-enheter. Ikke-spesifikk protein absorpsjon ble forhindret ved anvendelse av 5% (vekt /volum) skummet melk i fosfat-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween 20 (PBS-T) i 1 time. Primære antistoff inkubering i PBS-T ble utført i 1 time ved romtemperatur. HRP-koblet anti-muse-sekundært antistoff ble benyttet ved en endelig fortynning på 1 15 000 i PBS-T, og HRP ble avdekket med en kjemiluminescerende deteksjonssystem (Millipore).
Immunhistokjemi
Histologisk diagnoser av tumorøse og ikke-tumorøse formalinfiksert og parafininnstøpte vev ble bekreftet i haematoxylin og eosin-farget seksjoner. Immunhistokjemi ble utført med et anti-HV1 polyklonalt antistoff. Den anti-HV1-antistoff (1,0 mg /ml) ble fortynnet 100 ganger med PBST (fosfat-buffret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20) inneholdende 1% (vekt /volum) BSA. De parafininnstøpte seksjoner fylt med 10 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) buffer (pH 8,0) ble oppvarmet i en mikrobølgeovn i 12 min. Etter avkjøling ble de seksjonene behandlet med 0,5% Triton X-100 i PBS i 10 min, utsatt for 3% (v /v) hydrogenperoksyd (H
2o
2) i 10 minutter for å inhibere endogen peroksidaseaktivitet . Deretter ble seksjonene inkubert i PBST inneholdende 5% føtalt bovint serum og 2% BSA i 30 min for å redusere ikke-spesifikk binding. Inkubering med primært antistoff ble utført over natten ved 4 ° C i et fuktet kammer. HRP-koblet anti-muse-sekundært antistoff ble benyttet ved en endelig fortynning på 1 400 i 1 time. Til slutt, ble visualiseringen signal utviklet med diaminobenzidin (DAB) og objektglassene ble motfarget i hematoksylin. Negativ kontroll ble utført for å behandle med ikke-immune museserum som det primære antistoff i stedet for anti-HV1 antistoff.
Farget snittene ble evaluert i en blindet måte uten forutgående kunnskap om klinisk informasjon ved hjelp av den tyske immunoreactive score, Immuno-Reactive-Score (IRS). Kort, tildeler skattemyndighetene sub-poeng for immunoreactive distribusjon (0-4) og intensitet (0-3), og deretter multipliserer dem til å gi skattemyndighetene poengsum. Den prosentvise positivitet ble merket som «0» (mindre enn 5%), «1» (5-25%), «2» (25-50%), «3» (50-75%), «4» ( 75%). Fargeintensitet var stillingen i henhold til området av HV1-positiv farging celler som «0, -» (negativ, mindre enn 5%), «1, +» (svakt positiv, 5-25%), «2, ++ «(positiv, 25-50%), og» 3, +++ «(sterkt positiv, 50%). Den endelige HV1 Uttrykket resultatet ble beregnet fra verdiene for prosent positivitet stillingen og fargingsintensitet, som ble varierte fra 0 til 12. Vi beregnet IRS ved å ta gjennomsnittet av verdiene i åtte felt ved x 500 forstørrelse for hver prøve. HV1 ekspresjonsnivåer ble definert som følger: lav uttrykket (poengsum ≤3) og høy ekspresjon (poengsum 3). Immunhistokjemisk analyse og scoring ble utført av to uavhengige erfarne patologer.
Cell kultur
Den menneskelige kolorektal kreft cellelinjer SW620, HT29, LS174T, Colo205 og SW480 ble dyrket ved 37 ° C i en atmosfære av 95% luft og 5% CO
2 med DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 20 mM L-glutamin.
immunocytokjemi
SW620, HT29, LS174T, Colo205 og SW480-celler dyrket på dekkglass ved konfluens i seks-brønns vevskulturplater ble fiksert med 4% (w /v) paraformaldehyd i PBS ved romtemperatur i 30 minutter, vasket i PBS, behandlet med 0,5% Triton X-100 i PBS i 20 minutter ble utsatt for 3% (v /v) hydrogenperoksyd (H
2o
2) i 15 min, og blokkert med 5% føtalt bovint serum og 2% BSA i PBST i 20 minutter ved romtemperatur. De blokkerte Objektglassene ble inkubert med anti-HV1-antistoff (1,0 mg /ml) i en fortynning på 1 200 med PBST inneholdende 1% (vekt /volum) BSA ved 37 ° C i 1 time. Etter vasking i PBS tre ganger, ble objektglassene ytterligere inkubert med HRP-koblet anti-muse-sekundært antistoff ved en endelig fortynning på 1 400 i 1 time. Signaler ble visualisert ved HRP /DAB-systemet. Cellekjerner ble farget med hematoksylin.
kvantitativ real-time PCR
mRNA uttrykk nivåer av HV1 i SW620, HT29, LS174T, Colo205 og SW480 celler, ble evaluert av kvantitativ real-time PCR bruker ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California). Totalt RNA ble ekstrahert ved RNAiso Reagens (Takara), og omvendt-transkribert av MMLV super transkriptase (Takara). Real-time kvantitativ revers transkripsjon PCR ble utført med SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit (Takara) i henhold til produsentens instruksjoner. Primerne var som følger: HV1, 5′-CAGGTCATCATCATCTGCTTG-3 «(fremover) og 5′-CCGTTCTGAACGTGTCTTAAC-3′ (revers); GAPDH, 5»-CCAAGGTCATCCATGACAAC-3 «(fremover) og 5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCT-3» (bakover). PCR termiske tilstand som ble benyttet var: 94 ° C i 30 s; annealing, 52 ° C i 30 s; forlengelse, 72 ° C i 30 sek. Relative mRNA-ekspresjonsnivåene av proteiner ble beregnet i henhold til ligningen: 2
-ΔΔCT, hvori ΔΔCT = (CT
HV1 – CT
GAPDH) – (CT
HV1 – CT
GAPDH )
SW620. Alle forsøk ble utført in triplo.
Immunofluorescence
SW620 og SW480-celler dyrket på dekkglass ble fiksert med 4% (v /v) paraformaldehyd i fosfat-bufret saltvann (PBS) ved romtemperatur i 30 minutter, vasket i PBS, behandlet med 0,5% Triton X-100 i PBS i 20 minutter, og blokkert med 5% føtalt bovint serum og 2% BSA i PBST i 1 time. De blokkerte Objektglassene ble inkubert med anti-HV1-antistoff (1,0 mg /ml) i en fortynning på 1 200 i 2% BSA ved 4 ° C over natten. Etter vasking med PBS i 5 minutter til fire ganger, ble objektglassene ytterligere inkubert i 1 time ved romtemperatur med et FITC-konjugert geite-anti-muse-IgG ved en fortynning på 1 400 i 2% BSA, etterfulgt av en vasking som beskrevet ovenfor . Konfokale bilder av FITC fluorescens av SW620 og SW480-celler ble registrert på et Leica TCS SP5 konfokal mikroskopi (Leica, Tyskland) med FITC-filtersett for HV1 og DAPI filter som er angitt for atom DAPI fargestoff. Bildene ble senere bearbeidet av Adobe Photoshop-programvare.
Demper HV1 mRNA uttrykk
Sekvensen av siRNA rettet mot HV1 genet var 5′-CTACAAGAAATGGGAGAAT-3 «, og den tilfeldige forstand sekvensen var 5»-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 «, som begge ble oppnådd fra Ribobio (Guangzhou, Kina) [17]. SW620-celler dyrket ved konfluens ble vedtatt i 6-brønners plater ved 30% konfluens og inkubert over natten, og deretter transfektert med siRNA og den negative kontroll, respektivt, ved å bruke lipofektamin 2000 (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Sluttkonsentrasjonen av siRNA var 100 nM. Lyddemping ble undersøkt 48 timer etter transfeksjon. Effektiviteten av siRNA i å undertrykke HV1 ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR, immunocytochemistry og western blotting ved hjelp av anti-HV1 antistoff som beskrevet ovenfor.
Migrasjon kinetikk
For å undersøke effekten av HV1 på trekk evnen til kolorektal kreft celler, vandringer SW620, SW480, og SW620 celler nedregulert HV1 uttrykk og hemmet HV1 aktivitet av siRNA og Zn
2 + henholdsvis ble vurdert i såret mono modell. For å ned-regulere HV1 ekspresjon, ble SW620-celler dyrket til konfluens og transfektert med siRNA og negativ kontroll i 24 timer, henholdsvis. Å inhibere HV1-aktivitet, ble 1 M ZnCl oppløsning tilsatt til DMEM-medium til en sluttkonsentrasjon på 100 uM [1], [2]. De SW620 og SW480-celler ble sådd i en 24-brønns plate (1,5 x 10
5 per brønn) og dyrket i 24vh til konfluens og deretter såret med en spiss. Celle bevegelse ble observert under fase kontrast mikroskopi, og ble tatt med et digitalt kamera hver 12 timer.
Invasion og migrasjonsanalyser
In vitro
invasjon og migrasjonsanalyser var utført for å vurdere virkningene av HV1 på invasive og trekkende evner SW620 og SW480 celler. SW620 og SW480 celler ble dyrket i seks-brønns plate i DMEM medium med 10% FBS ved konfluens, transfektert med siRNA og negative kontrollhenholdsvis i 24 timer, og deretter trypsinert, vasket og tellet. For celle invasjon, transwells med 8 um porestørrelse filter (Millipore) ble dekket med matrigel (Becton Dickinson) og settes inn i 24-brønners plater. Og for cellemigrering, ble transwells ikke er belagt med matrigel. DMEM-medium (500 pl) inneholdende 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer, og 200 pl av en cellesuspensjon (5 x 10
4 celler) ble anbragt i det øvre kammer. Platene ble inkubert ved 37 ° C i fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 i 24 timer. Å inhibere HV1-aktivitet, ble 1 M ZnCl oppløsning tilsatt til DMEM-medium til en sluttkonsentrasjon på 100 uM [1], [2]. De gjennomtrenges Cellene ble fiksert med paraformaldehyd, farget med krystallfiolett-oppløsning, og fotografert. Hvert eksperiment ble utført fire ganger. Migrasjon og invasjon ble regnet som [migrasjon celle Antall test /migrasjon celle Antall kontroll
SW620] x 100% og [invasjon celle Antall test /invasjon celle Antall kontroll
SW620] × 100%, henholdsvis.
aktivitet av HV1 kanal
aktiviteten av HV1 i kolorektal kreft celler ble vurdert som en endring i intracellulær pH (pH
i) i respons til membran depolarisering ved BCECF fluorescens [11]. Cellene ble inkubert med 3,0 mM av BCECF-AM (Molecular Probe) i serumfritt DMEM-medium i 30 min, henholdsvis, og vasket med PSS-oppløsning (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM glukose, 1 mM CaCl
2, 1 mM MgCl
2, 20 mM Tris, pH 7,5) i 3 ganger. Celler ble inkubert med NH
4Cl /NMDG (N-metyl-D-glukamin) oppløsning (100 mM NMDG, 40 mM NH
4Cl, 5 mM KCl, 5 mM glukose, 1 mM CaCl
2, 1 mM MgCl
2, 20 mM Tris, pH 7,3) i 20 minutter og vasket med ammonium-fri oppløsning (140 mM NMDG, 5 mM KCl, 5 mM glukose, 1 mM CaCl
2, 1 mM MgCl
2, 20 mM Tris, pH 7,4), hurtig å indusere intracellulær surgjøring [5]. Membran depolarisasjon ble oppnådd ved å legge høy K
+-oppløsning (145 mM KCl, 5 mM glukose, 1 mM CaCl
2, 1 mM MgCl
2, 20 mM Tris, pH 7,5). Intracellulær pH forandrer syrebelastede celler ble påvist ved fluorescerende probe BCECF ved eksitasjonsbølgelengdene av 490 nm og 440 nm og en emisjonsbølgelengde på 525 nm i henhold til membranen depolariserende tilstand ved hjelp av RF-5301PC Spectrofluorophotometer (Shimadzu, Japan).
målinger av intracellulær pH
intracellulær pH-verdien ble målt ved hjelp av pH-følsomme fluorescerende probe BCECF-AM. -Celler dyrket i monolagene ble inkubert med 3,0 mM av BCECF-AM (Molecular Probe) i bikarbonat-fri DMEM-medium ved 37 ° C i 30 minutter. Etter påsetting, ble cellene vasket tre ganger med HEPES-buffer for å fjerne det ekstracellulære fargestoff, og laget for å forbli i den samme buffer. Den HEPES-buffer inneholdt 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO
4, 1 mM CaCl
2, 1 mM NaH
2PO
4, 5,5 mM glukose og 20 mM HEPES, pH 7,4. Fluorescens ved eksitasjonsbølgelengdene av 490 nm og 440 nm ble registrert ved en emisjon bølgelengde på 525 nm ved hjelp av RF-5301PC Spectrofluorophotometer (Shimadzu, Japan). Kalibrering av fluorescens vs pH ble utført etter ekvilibrering av ekstern og intern pH med nigericin (10 pM) i en høy K
+ buffer med en pH-5,5 til 8,0. Den høye K
+ Bufferen inneholdt 145 mM KCl, 5 mM glukose, 1 mM CaCl
2, 1 mM MgCl
2, og 20 mM HEPES (eller MES). Den relative fluorescens ratio verdiene ble plottet mot tilsvarende pH
-verdier, som tillot bestemmelse av ukjent pH
i.
Statistisk analyse
All statistikk ble utført ved hjelp av SPSS16.0 programvare. Måledata ble representert som gjennomsnitt ± SD. Sammenligning av den midlere mellom grupper ble utført ved
t
test.
P
verdier 0,05 ble betraktet som signifikant. Overlevelsesanalyse ble vurdert ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og overlevelsesraten ble sammenlignet med log-rank test.
Resultater
Clinicopathologic funn
Clinicopathologic profiler fra de 139 tilfellene valgt for denne studien ble anmeldt i Tabell 1. gjennomsnitts~~POS=TRUNC alderen~~POS=HEADCOMP for pasientene var 62,4 år (fra 36-76), inkludert 68 hanner og 71 hunner. Lokaliseringen av sine kreft var 29 gjorde ensidige og 43 høyresidig kolon, og 47 endetarm tilfeller, henholdsvis. Blant de 139 resekterte tilfeller, er den primære svulststørrelsen variert som følger:, 5 cm i 72 tilfeller, og ≥5 cm i 67 tilfeller. Tjue av 139 svulster viste dårlig cytologisk differensiering. Svulsten grad var begrenset (T1 eller T2) i 45 tilfeller og avansert (T3 eller T4) i 94 tilfeller. Tumormetastaser til lymfeknuter ble observert i 59 av 139 tilfeller.
Økt uttrykk for HV1 i tykktarmskreft
HV1 uttrykt i immunceller er assosiert med «luft burst» [3], [ ,,,0],4], men dens funksjon i tumorigenesis har ikke blitt identifisert. For å undersøke HV1 for anvendelse som en potensiell biomarkør og terapeutisk mål for kolorektal kreft, HV1-ekspresjon i 139 kolorektal kreft vev og sammenkoblede normale vev, 10 normal tykktarms, 20 kolorektal adenom og 18 hyperplastiske polypp vev, ble påvist ved anvendelse av immunohistokjemi med et anti-HV1 polyklonale antistoff som ble generert i huset. For å undersøke spesifisiteten av antistoffet, ble 293-T-celler transfektert med pHv1-EGFP ekspresjonsplasmid. Og ekspresjon av HV1-EGFP ble påvist ved immunocytokjemi og western-blotting med antistoffet, og EGFP fluorescens. Resultatene viste at antistoffet spesifikt gjenkjenner HV1 og EGFP er en markør for HV1 ekspresjon (Fig. 1A og B).
A, 293 T-celler ble transfektert med pHv1-EGFP-plasmidet og observert av en Leica TCS SP5 focal mikroskopi. en, observasjon av EGFP fluorescens. HV1-EGFP fluorescens er representert i grønt. b, anti-HV1 immunfluorescens (TRITC bølgelengder) (rød). c, til DAPI flekken visual kjerner (blå). d, bilde fusjonert er sammensatt av EGFP fluorescens, anti-HV1 immunfluorescens, og DAPI flekken. B, 293 T-celler ble transfektert med vektor pcDNA3.1 og pcDNA-HV1 plasmid, respektivt. Og HV1 ble påvist ved western blotting. C, HV1 er uttrykt i kolorektal kreft vev. en (100 x) og b (x 500), c (100 x) og d (500 x), normal tykk- vev; e (100 ×) og f (500 ×), adenom vev; g (100 ×) og h (500 ×), i (100 ×) og j (500 ×), k (100 ×) og l (500 ×), tykktarmskreft vev. I normale kolorektal vev, hyperplastiske polypper og kolorektal adenom vev, fargingen var negative eller svakt positiv. I tumorvev, ble observert intens immunoreaktivitets til HV1. HV1 er hovedsakelig observert i plasmamembranen (h, j og l) (som angitt ved pilspisser). Den HV1 er farget i brunt, mens bakgrunns kjerner er i blått.
Som vist i fig. 1C og tabell 2, HV1-farging var hovedsakelig moderat eller sterkt positiv i kolorektal kreft vev, men ikke i normal tykk- og hyperplastiske polypp vev. HV1 ble hovedsakelig observert i plasmamembranen av tumorceller i kolorektale vev, slik som vist i fig. 1C (h, j og l) (som angitt ved pilspisser). I kolorektal adenom vev, fargingen var negative eller svakt positiv (figur 1C, e og f,. Tabell 2). HV1 i kolorektal kreft vev var signifikant uttrykt sammenlignet med den i normal kolorektal, hyperplastiske polypper og adenom vev, noe som antyder at HV1 kan være involvert i kolorektal tumorigenesis. Samlet, 106 av de 139 (76,3%) tilfeller viste høy uttrykk HV1 i tumorvev (IRS enn 3), mens 33 (23,7%) av tilfellene viste lav uttrykk (IRS 0-3). Vanligvis HV1 tetthet var signifikant høyere i kreftvev enn i adenom vev (7,20 ± 3,25 kontra 2,20 ± 2,12) (Tabell 2).
Høy HV1 uttrykket er assosiert med dårlig prognose
korrelasjonene mellom HV1 uttrykk og clinicopathologic egenskaper er oppsummert i tabell 3. det var signifikante assosiasjoner med dybden av tumorklassifisering (
P
= 0,007), alder (
P
= 0,021) , tumorstørrelse (
P
= 0.000), lymfeknutestatus (
P
= 0.000), klinisk stadium (
P
= 0.000) og p53 status (
P
= 0,014) hos pasienter som hadde høy HV1 uttrykk sammenlignet med pasienter som hadde lav HV1 uttrykk. Det var ingen signifikant sammenheng mellom HV1 uttrykk og de andre kliniske funksjoner, for eksempel kjønn, differensiering og Ki-67 uttrykk. I tillegg sammenhenger mellom uttrykket nivåer av p53, Ki-67, TopoII, GST-π og P-gp og clinicopathologic egenskaper ble vist i Tabell 4. p53 status relatert til tumor klassifisering (
P
= 0,011 ), Ki-67 til differensiering (
P
= 0,010), TopoII til differensiering (
P
= 0,010), og GST-π til tumorstørrelse (
P
= 0,007) og differensiering (
P
= 0,000). Men visste P-gp ikke vise statistisk signifikans med clinicopathologic parametere.
Kaplan-Meier overlevelseskurver viste at pasienter som hadde høy HV1 uttrykket var mer sannsynlig å ha en kortere total overlevelse (
P
= 0,008, fig. 2A) og tilbakefall overlevelse (
P
= 0,008, fig. 2B) sammenlignet med pasienter som hadde lav HV1 uttrykk, noe som tyder på at HV1 over-uttrykk kan være assosiert med en dårlig prognose klinisk. Pasienter som hadde høy HV1 uttrykk hadde en dårlig gjentakelse overlevelse (
P
= 0,008) sammenlignet med pasienter som hadde lav HV1 uttrykk (univariat analyse) (tabell 5). Total overlevelse undersøkt av Cox univariat analyse viste også at høyt uttrykk for HV1 var signifikant assosiert med kortere overlevelse (
P
= 0,008). Univariate Cox regresjonsanalyser viste at HV1 uttrykk nivået var signifikant assosiert med tilbakefall og total overlevelse, mens andre kliniske kjennetegn mistet sin prediktiv betydning. Videre analyser multivariat Cox regresjon viste at høyt uttrykk for HV1 var uavhengig risikofaktor for total overlevelse (relativ risiko [RR] = 0,443,
P
= 0,015) og tilbakefall overlevelse (RR = 0,427,
P
= 0,026) (Tabell 6). Pasienter som hadde høy uttrykk for HV1 var tilbøyelige til å ha en tidlig tilbakefall sammenlignet med pasienter som hadde lav uttrykk for HV1 (37,4 ± 3,0 vs 47,2 ± 10,7,
P
0,008). (Tabell 5)
de pasienter med lav uttrykk har lengre total og sykdomsfri overlevelse enn pasienter med høyt uttrykk.
Distribusjon av HV1 i humane kolorektale cellelinjer
for å undersøke om HV1 er også uttrykt i menneske kolorektal kreft cellelinjer, var uttrykk for HV1 i menneskelige kolorektal kreft cellelinjer, SW620, HT29, LS174T, Colo205 og SW480, oppdaget av immunocytochemistry og real time RT-PCR. Som vist på fig. 3, uttrykket nivåer av HV1 hos disse kolorektale cancercellelinjer har betydelig forskjell. HV1 uttrykkes på et høyt nivå i SW620, HT29, LS174T, og Colo205-celler, men ikke i SW480 celler. Lokalisering av HV1 i SW620-celler ble bestemt ved en konfokal mikroskopi. Som vist på fig. 3C, er HV1 sterkt uttrykt i SW620-celler, som er lokalisert i både intracellulære områder og plasmamembran (som angitt ved pilspisser), mens HV1 er neppe uttrykt i SW480-celler. Det resultat at HV1 uttrykk er høyere i SW620 celler enn det i SW480 celler er identisk med resultatene fra immunocytokjemi (Fig. 3A) og sanntids RT-PCR (fig. 3B).
A, HT29 (a 200 ×), LS174T (b, 200 ×), Colo205 (c, 200 ×), SW480 (d, 200 ×), SW620 (e, 200 ×) og SW620 (f, 500 ×) oppdaget av immunocytochemistry. B, mRNA uttrykk nivåer av HV1 i SW620, HT29, LS174T, Colo205 og SW480 celler anslått av kvantitativ real-time PCR. Verdier er gjennomsnitt ± SD (
n
= 3). *
P
0,05, sammenlignet med SW620 celler. C, SW620 (a, b og c) og SW480 (d, e og f) celler dyrket på dekkglass ved konfluens i en seks-brønns vevskulturplate ble farget med anti-HV1-antistoff og observert av en Leica TCS SP5 konfokal mikros . a og d, anti-HV1 immunfluorescens (FITC, grønn). b og e, DAPI flekken for å visualisere kjernene (blå). c og f, bilder sammenslåtte er sammensatt av anti-HV1 immunfluorescens og DAPI flekken. HV1 er observert i plasma membran og intracellulære områder i de svært metastatiske SW620 celler (som indikert av pilspisser), men ikke i dårlig metastatiske SW480 celler. D, ekspresjon av HV1 i HT29, SW620 og SW480-celler ble påvist ved western blotting. Nedregulering av HV1 uttrykk ble utført av siRNA målretting HV1 (HT29-si, SW620-si og SW480-si).
Hemming av HV1 aktiviteten avtar invasjon og migrasjon i svært metastatisk kolorektal kreftceller
Invasion og migrasjon er to fremtredende kjennetegnene ved tumor malignitet. For å vurdere bidraget av HV1 til invasiv og vandrende potensial i kolorektal kreft celler, utførte vi invasjon og migrasjon analyser. Først undersøkte vi kinetikken av trekkfugl evne SW620, SW480 og HT29 celler. Fig. 4A, B og C viste migreringskinetikken av SW620 (fig. 4A), SW480 (fig. 4B) og HT29 (fig. 4C) celler. En skadet monolag av SW620-celler tillatt for sårheling etter 48 h (fig. 4A, a, b, c, d og e). SW620 og HT29 (Fig. 4C, a, b, c, d og e) lukkede celler på såret betydelig raskere enn SW480-celler (fig. 4B, a, b, c, d og e). For å nedregulering av ekspresjon HV1 og inhibering av HV1 aktivitet, siRNA målretting HV1 og en sluttkonsentrasjon på 100 mM ZnCl
2 [1], ble [2] anvendes, respektivt. Effektiviteten av HV1 knock-down med siRNA i SW620, SW480 og HT29-celler ble vurdert ved Western blotting, noe som viste at reduksjonen i HV1 proteinnivåer ved siRNA knockdown i SW620 og HT29-celler (Fig. 3D). Undertrykkelse av HV1 uttrykk etter siRNA (f, g, h, i og j i fig. 4A, B og C) og HV1-aktivitet ved 100 uM ZnCl
2 (k, l, m, n og o i Fig. 4A Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig.
