Abstract
Selv om tilbakevendende somatiske mutasjoner i skjøting faktor
U2AF1 plakater (også kjent som
U2AF35
) har blitt identifisert i flere krefttyper, effekter av disse mutasjonene på kreft transkriptomet har ennå ikke helt klarlagt. Her identifiserte vi spleise endringer i forbindelse med
U2AF1
mutasjoner over forskjellige kreft ved hjelp av DNA og RNA sekvensering av data fra Kreft Genome Atlas (TCGA). Ved hjelp av RNA-Seq data fra 182 lunge adenokarsinomer og 167 akutte myeloide leukemier (AML), hvor
U2AF1
er somatisk mutert i 3-4% av tilfellene, identifiserte vi 131 og 369 skjøting endringer, henholdsvis som var signifikant assosiert med
U2AF1
mutasjon. Av disse 30 spleising endringer var statistisk signifikant i både lunge adenokarsinom og AML, inkludert tre gener i Kreft Gene Census,
CTNNB1
,
CHCHD7
, og
PICALM
. Cellelinje eksperimenter uttrykker
U2AF1
S34F i HeLa celler og i 293T celler gir ytterligere støtte for at disse endrede spleising hendelsene er forårsaket av
U2AF1
mutasjon. I samsvar med funksjonen til U2AF1 i 3 «spleisesete anerkjennelse, fant vi at S34F /Y mutasjoner føre preferanser for CAG løpet UAG 3» spleisesete sekvenser. Denne rapporten viser konsistente effekter av
U2AF1
mutasjon på spleising i ulike kreftcelletyper
Citation. Brooks AN, Choi PS, de Waal L, Sharifnia T, Imielinski M, Saksena G, et al. (2014) En Pan-Cancer Analyse av transkriptomet endringer knyttet til somatiske mutasjoner i
U2AF1
avslører Vanligvis Altered Skjøte Events. PLoS ONE 9 (1): e87361. doi: 10,1371 /journal.pone.0087361
Redaktør: Gil Ast, Tel Aviv University, Israel
mottatt: 28 juni 2013; Godkjent: 20 desember 2013; Publisert: 31 januar 2014
Copyright: © 2014 Brooks et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en National Institutes of Health Grant 5U24CA143867-03. ANB er en Merck Fellow av Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2138-12). JC er støttet av en American Cancer Society Astrazeneca postdoktorstipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tidligere hel-exome sekvense studier har identifisert vendende somatiske mutasjoner i skjøting av faktorer i myelodysplastisk syndrom [1], kronisk lymfatisk leukemi [2], akutt myeloid leukemi [3], brystkreft [4], lunge adenokarsinom [ ,,,0],5], og uveal melanom [6]. Mange av disse muterte spleise faktorene er forgreningspunkt eller 3′-spleisesetet gjenkjennelsesfaktorer (f.eks,
SF3B1
og
U2AF1
) og er involvert i regulering av intron fjerning fra pre-mRNA. 3 «spleisesete anerkjennelse Komplekset består av U2AF1 og U2AF2 (også kjent som U2AF65), hvor U2AF1 er viktig for anerkjennelse av AG 3» spleiseseter [7] og U2AF2 gjenkjenner polypyrimidine kanalen oppstrøms av AG [8 ].
U2AF1
har blitt rapportert å ha betydelige hotspot mutasjoner ved aminosyre posisjon 34 i myelodysplastisk syndrom [1], lunge adenokarsinomer [5], og AML [3].
U2AF1
mutasjoner co-skje med mutasjoner i kjente driver onkogener i lunge adenokarsinom [5], og det er ennå uklart om disse mutasjonene er oncogent trans. For ytterligere å belyse kjerne effekter av
U2AF1
mutasjoner på kreft biologi, rettet vi å identifisere felles transkriptom endringer i forbindelse med
U2AF1
mutasjoner i forskjellige krefttyper.
Resultater
Somatiske mutasjoner i
U2AF1
over 12 krefttyper
for å se på transkriptom endringer knyttet til
U2AF1
mutasjoner i ulike krefttyper, vi brukte kreft~~POS=TRUNC Genome Atlas ( TCGA) data som gir både somatiske mutasjoner på DNA-nivå og high-throughput-sekvensering av mRNA (RNA-Seq) i de samme individuelle prøver på tvers av flere cancertyper. Ved hjelp av tilgjengelige data fra 12 TCGA krefttyper [9], identifiserte vi kreft husing somatiske mutasjoner i
U2AF1
. Across 2,979 kreftprøver med både hel-exome sekvensering og RNA-Seq, 26 hadde missense mutasjoner i
U2AF1
-17 i aminosyrestilling 34 (tabell S1 i Dokument S1, figur 1).
U2AF1
S34F mutasjoner ble funnet i åtte lunge adenokarsinomer (4%), fire AML prøver (2%), to endometrial karsinom (1%), og en blærekreft prøve (1%). Det var også to
U2AF1
S34Y AML prøver (1%).
U2AF1
ble rapportert å være betydelig mutert i begge lunge adenokarsinomer [5] og AML [3]; imidlertid, ikke i betydelig grad mutert i endometrial karsinom [10], mest sannsynlig på grunn av den lave frekvens innenfor denne krefttypen. I tillegg til S34F /Y mutasjoner ble åtte andre somatiske mutasjoner observert i
U2AF1
. Å identifisere transkriptom endringer i forbindelse med
U2AF1
mutasjon, fokuserte vi på lunge adenokarsinom og AML som disse krefttypene har en høyere frekvens av mutasjoner og dermed ville ha mer makt til å oppdage statistisk signifikante endringer i forbindelse med mutasjon og kontroll for forskjeller mellom vev av opprinnelse. De S34F og S34Y mutasjoner resulterer i aromatiske aminosyrer; Derfor anser vi S34F og S34Y mutasjoner for å være funksjonelt lik.
(A) Representasjon av somatiske mutasjoner i
U2AF1
observert over 12 TCGA krefttyper [9]. Fem krefttyper hadde ingen somatiske mutasjoner i
U2AF1
. Aminosyreposisjoner er indikert. Zn, sink finger; UHM, U2AF homologi motiv. (B) JuncBASE analyse av RNA-Seq data identifisert 131 og 369 spleise hendelser signifikant forskjellig skjøtes i lunge adenokarsinom og AML eksemplarer peiling
U2AF1
S34F /Y mutasjoner, henholdsvis.
transkriptom endringer i forbindelse med
U2AF1
S34F /Y mutasjoner i lunge adenokarsinom og akutt myelogen leukemi
Vi brukte JuncBASE [11] for å identifisere alternative spleise hendelser som var signifikant forskjellig skjøtes mellom
U2AF1
villtype kreftprøver og
U2AF1
S34F /Y prøver. JuncBASE identifiserer og klassifiserer former for alternativ spleising (f.eks kassett ekson, alternative 5 «spleiseseter, alternative 3» spleiseseter), kvantifiserer overflod av inkludering eller ekskludering av hvert alternativ ekson, beregner deretter en «prosent spleises på» (PSI ) verdi for hver spleising hendelse i hver kreftprøve. En Wilcoxon rank sum test ble utført på PSI-verdier mellom kreft med eller uten
U2AF1
S34F /Y mutasjoner til å identifisere spleise hendelser som var signifikant forskjellig mellom de to gruppene. For å kontrollere for vev av opprinnelse, vi sammenlignet
U2AF1
villtype og S34F /Y prøver innenfor samme krefttype.
U2AF1
S34F lunge adenokarsinomer ble funnet på tvers av de tre uttrykk undergrupper (TCGA,
legges
) og
U2AF1
S34F /Y AML prøver skjedd over fem fransk-Amerika- Britisk (FAB) AML-subtyper [3]; Derfor har vi ikke lenger kontrollere for subtype. Somatiske mutasjoner i
U2AF1
er blitt funnet å være gjensidig utelukkende med andre skjøte faktorer [1], [3], [5], som tyder på at spliceosome pathway mutasjoner kan ha den samme funksjonelle virkning på onkogenese. For å fjerne potensielle confounders fra mutasjoner i andre skjøting faktorer, så vi for forskjellig spleisede hendelser mellom prøver med
U2AF1
S34F /Y mutasjon og prøver skjuler ingen mutasjon i noen spleising faktor gen som tidligere er rapportert å være vesentlig endret i kreft (Tabeller S1-S2 i dokument S1).
Ved hjelp JuncBASE identifiserte vi 131 og 369 alternativ spleising hendelsene som var signifikant forskjellig spleisede i nærvær av en
U2AF1
S34F /Y mutasjon i lunge adenokarsinom og AML (False Discovery Rate (FDR) 5%), henholdsvis. I tillegg disse spleising hendelsene har a 10% forskjell i median PSI av kreft uten skjøting faktor genmutasjon og kreft med
U2AF1
S34F /Y mutasjoner (File S1-S3). Sammenligning
U2AF1
S34F /Y mutasjon med
U2AF1
villtype prøver (noen med mutasjoner i andre spleise faktorer) ga lignende resultater i lunge adenokarsinom (TCGA,
innsendt
) og AML (File S4). JuncBASE kvantifisering av
U2AF1
S34F /Y-assosiert spleise hendelser i AML var forenlig med en analyse av
U2AF1
mutasjoner i 20 AML prøver [12] (r
2 = 0,84, figur S1 i Dokument S1).
Som både en positiv og negativ kontroll for denne analysen, sammenlignet vi 10 lunge adenokarsinom prøver med en
MET
ekson 14 spleisesete mutasjon eller sletting med alle andre lunge adenokarsinom prøver for å se etter signifikant forskjellig spleising mellom de to gruppene.
MET
ekson 14 endringer skje på en tilsvarende frekvens som
U2AF1
mutasjoner i lunge adenokarsinom (TCGA,
legges
). Denne analysen fungerer som en positiv kontroll, fordi de sterkt assosiert differensial spleising hendelse bør være
MET
exon 14. Denne analysen fungerer også som en negativ kontroll som endringene ikke kan forventes å føre til globale endringer i spleising siden mutasjonene oppstår på
cis
-acting spleisesete endringer. Faktisk JuncBASE analysen kun identifisert spleising av
MET
ekson 14 som vesentlig forskjellig skjøtes med en forskjell i PSI . 10%
Som en ekstra kontroll, vi identifisert alternativ spleising hendelser signifikant assosiert med
STAG2
mutasjoner i lunge adenokarsinom og AML, som
STAG2
forventes ikke å være en spleising regulator og det er mutert til en lignende frekvens i begge krefttyper. Bare en spleising hendelse var signifikant assosiert med
STAG2
mutasjon i lunge adenokarsinom og ingen i AML.
I likhet med det som ble observert i en omfattende karakterisering av lunge adenokarsinom (TCGA,
innsendt
), skjøting hendelser assosiert med
U2AF1
S34F mutasjoner i AML viser også berikelse av kassett eksoner og alternative 3 «spleiseseter (Figur 1b). Vi har ikke bred observere effekter på intron etensjon som er tenkt å skje i nærvær av en spliceosome mutasjon. Hvis
U2AF1
mutasjoner føre til at mange introner skal unspliced, kanskje det er ikke på en konsistent måte, og disse forekomstene er ryddet unna med tull-mediert forfall (NMD). For å se om kassetten ekson og 3 «spleisesete bias er et generelt trekk ved alternativ spleising i disse krefttypene eller spesifikk for skjøting endret av
U2AF1
mutasjon, identifiserte vi proporsjonene av hver type alternativ spleising hendelse i de 10% mest variable spleise hendelser i lunge adenokarsinomer uten skjøting faktor mutasjoner (Figur S2 i dokument S1).
U2AF1
S34F /Y kreft fortrinnsvis vise endringer i kassett ekson og 3 «spleiseseter i forhold til det sett av svært varierende spleise hendelser (chi-squared test, P = 6.6e-26).
Selv om det er skjøte endringer som er forbundet med
U2AF1
S34F /Y-mutasjon i disse kreft prøver, er det uklart om skjøte endringer er forårsaket av mutasjon, eller hvis det er ukjente genomiske forandringer som også sammenfaller med spleise forandrer seg. For å evaluere videre forholdet mellom spleise endringer og
U2AF1
S34F mutasjoner, vi analysert tidligere utgitt RNA-Seq data som sammenligner ektopisk uttrykk for
U2AF1
S34F eller
U2AF1
vill skriver uttrykk i HeLa-celler [1]. JuncBASE analyse som sammenligner ikke-induksjons kontroller med
U2AF1
villtype eller
U2AF1
S34F induksjon identifisert 1,221 og 5,399 betydelige spleise endringer, henholdsvis (File S5 og S6). Vi finner en betydelig overlapping av 165 spleise endringer ved induksjon av
U2AF1
S34F i HeLa celler og skjøte endringer i kreft hos mennesker med
U2AF1
S34F /Y mutasjoner (figur 2, Fishers eksakte test, P 2.2E-16). I kontrast, finner vi en mindre andel av spleise endringer på
U2AF1
villtype induksjon til å være lik endringer i menneskelige kreft (15/1221, Fishers eksakte test, P = 0,72). I alt 35% av
U2AF1
S34F /Y-forbundet skjøting endringer sett i lunge adenokarsinom eller AML støttes av spleise endringer forårsaket av
U2AF1
S34F uttrykk i HeLa celler. Vi ville ikke forvente at alle skjøte endringer bli observert i HeLa-celleforsøk som skjøte forandringer er kjent for å være avhengig av konteksten (oversikt i [13]), og
U2AF1
induksjon fører til overekspresjon av genet [1], noe kan påvirke spliceosome kompleks formasjon.
En sammenligning av endringer i spleising forbundet med
U2AF1
somatisk mutasjon i kreft hos mennesker og
U2AF1
S34F induksjon i HeLa celler.
U2AF1
S34F /Y fortrinnsvis skjøter til CAG fremfor UAG 3 «spleisesete sekvenser
U2AF1 er den lille subenheten av U2AF heterodimer som anerkjenner AG konsensus av 3′ spleiseseter. En tidligere studie som identifiserte differensial spleising av 35 eksoner forbundet med
U2AF1
mutasjon identifisert en sekvens signatur på 3 «spleiseseter av de alternative eksoner [12]. Gitt de betydelige endringene i kassett eksoner og alternative 3 «spleisesete hendelser assosiert med
U2AF1
S34F /Y mutasjon, undersøkte vi sekvensene av 3′ spleiseseter som ble fortrinnsvis brukt i
U2AF1
S34F /Y mutert kreft. For enkelhets skyld har vi bare undersøkt spleise endringer mellom to alternative 3 «spleiseseter.
Som spleising faktor bindende kan variere avhengig av spleising aktivering eller undertrykkelse (anmeldt i [14]), så vi på spleisesete sekvenser av exon inklusjons- og eksklusjons hendelser, separat. Fra settet med
U2AF1
S34F /Y-forbundet kassett eksoner og alternative 3 «spleisesete endringer i AML, fant vi en betydelig skjevhet mot å hoppe av en ekson (69% av kassett eksoner) eller bruk av en mer distale 3 «spleisesete (75% av alternative 3» spleiseseter) (binomial test, P 1e-4, figur 3A). Vi fant en lignende skjevhet mot ekson hoppe og distal spleisesete bruk av
U2AF1
S34F-forbundet skjøting hendelser i lunge adenokarsinom (Figur S3 i Dokument S1). Til sammenligning har vi identifisert alternativ spleising hendelser signifikant assosiert med
RBM10
mutasjon i lunge adenokarsinom (File S7). RNA bindende protein
RBM10
ble funnet å være signifikant mutert i lunge adenokarsinomer med tilbakevendende rammeskifte, tull, eller spleisesete mutasjoner [5]. Den observerte exon hoppe er spesifikk for
U2AF1
S34F-forbundet spleise hendelser som det motsatte skjevhet er observert i
RBM10
tap-av-funksjon (LOF) -associated spleisehendelser (figur S4A-B i Dokument S1).
(A) Andel av endret kassett ekson og alternative 3 «spleisesete hendelser som viser exon hoppe versus ekson inkludering. (B) Konsensus sekvensmotiver identifisert ved den proksimale (prox 3’ss) og distale 3 «spleiseseter (dist 3’ss) av ekson hoppe hendelser. (C) Konsensus-sekvens motiver ved de proksimale og distale 3 «spleiseseter av exon inklusjons arrangementer. Spleise endringer av uttrykte og kommenterte 3 «spleisesete valg der spleisesetet valget er TAG vs. CAG eller TAG vs. AAG i (D) HeLa-celler + indusert
U2AF1
S34F eller (E) HeLa-celler + indusert
U2AF1
villtype.
i samsvar med tidligere funn [12], fant vi en trinucleotide konsensus TAG sekvens på proksimale 3 «spleiseseter av hoppet kassett eksoner. Videre finner vi også motivet på proksimale spleiseseter av alternative 3 «spleisesete hendelser i
U2AF1
S34F /Y AML prøver (Figur 3B). I tillegg, er en konsensus CAG spleisesete ved den mer distale 3 «spleisesete observert, noe som ikke har vært rapportert tidligere (figur 3B). En lignende preferanse for CAG spleiseseter (med en mindre AAG sekvens) over Tags spleiseseter er observert i eksoner fortrinnsvis inkludert i
U2AF1
S34F /Y AML prøver (Figur 3C). Disse fortrinnsspleisesete sekvensmotiver avvike fra spleisesete motiver observert nær nære og fjerne 3 «spleise områder av kontroll alternativ spleising hendelser (Figur S4C i Dokument S1, Wilcoxon rank sum test, FDR 95%).
Påfallende, ser vi de samme sekvens preferanser i kassett ekson og alternative 3 «spleise endringer språk i
U2AF1
S34F lunge adenokarsinomer (Figur S3 i dokument S1) og i HeLa celler transduced med
U2AF1
S34F mutant konstruksjoner (figur s5a-B i dokument S1). Dessuten ser vi ikke dette konsensus 3 «spleisesete sekvens i
RBM10
LOF-forbundet skjøting i lunge adenokarsinom (figur S4A-B i Dokument S1) eller i spleise endringer i HeLa celler transduced med vill-type
U2AF1 plakater (Figur S5C-D i dokument S1), som støtter at rekkefølgen preferanse er spesifikk for
U2AF1
S34F /Y mutasjoner.
Disse konsensussekvensmotiver ble samlet inn spleising hendelser som var sterkt assosiert med
U2AF1
mutasjon og ikke løser sekvens preferanser mellom to spleisesete valg fra en individuell spleising hendelse. For ytterligere å undersøke CAG spleisesete preferanser over UAG spleiseseter, undersøkte vi spleisesete sekvens veksler mellom alle par av uttrykk og kommentert CAG versus Tags 3 «spleiseseter. Ved hjelp av en senket terskel for å identifisere skjøting brytere, fant vi at 57% av CAG versus Tags 3 «spleiseseter ble endret i HeLa-celler som uttrykker
U2AF1
S34F mutasjon, mens 36% ble forandret da uttrykker en
U2AF1
villtype-konstruksjon (figur 3D). Av
U2AF1
S34F-forbundet spleisesete brytere, 83% (884/1065) var en kode til et CAG spleisesete, mens bare 53% (347/660) byttet fra en TAG til en CAG når uttrykker U2AF1 villtype (Fishers eksakte test, P 2.2E-16). Det ble observert en lignende skjevhet av brytere fra TAG til AAG 3 «spleiseseter (Fishers eksakte test, P = 2.518e-5, Figur 3D).
Vår analyse viser at
U2AF1
S34F /Y mutasjon fører til endringer i 3 «spleisesete bruk hvor en [C /A] AG 3» spleisesete er å foretrekke fremfor en UAG spleisesetet. Vi observerte ikke endret skjøting av alle UAG 3 «spleiseseter; derimot, er det vanskelig å skille mellom uforandret spleising eller degradering av den avvikende transkripsjon av nonsens-mediert nedbrytning, noe som vises å være uforandret.
transkriptomet forandringer i cellesyklus-gener og andre kreftgener er forbundet med
U2AF1
mutasjon
soma~~POS=TRUNC mutasjon i
U2AF1
kan føre til spleise endringer av viktige kreftgener, noe som resulterer i endret gen-funksjon eller endret trasé. For å identifisere potensielle nedstrøms biologiske konsekvensene av
U2AF1
mutasjon, vi utførte en Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [15], [16] for å identifisere genet sett positivt korrelert med
U2AF1
S34F /Y mutasjon i lunge adenokarsinom og i AML. Ingen gensettene nådde statistisk signifikans gitt en FDR cutoff på 25%. Det ble tidligere rapportert at transduksjon av
U2AF1
S34F mutasjoner i HeLa celler forårsaket oppregulering av komponenter av tull-mediert forfall (NMD) pathway [1]. Vi har ikke observere en betydelig oppregulering i uttrykket av NMD faktorer assosiert med
U2AF1
mutasjon i lunge adenokarsinom eller AML.
Selv om ingen gensettene gått FDR betydning, topp-to beriket GO ontologi genet sett i AML med de høyeste normalisert berikelse score var «mitotitc cellesyklus» og «M fasen av mitotiske cellesyklus» (figur S6 i dokument S1, nominell P 0,05). En undergruppe av disse cellesyklus gener ble oppregulert i AML prøver med
U2AF1
S34F /Y mutasjon. I samsvar med effekten av
U2AF1
mutasjon på cellesyklus, RNAi uttømming av
U2AF1 product: [17] og
U2AF1
S34F uttrykk i HeLa celler [1] resulterer i en øket fraksjon av celler i G2 /M-fasen. Vi ser ikke noen tilknytning til cellesyklus gensettene i
U2AF1
S34F lunge adenokarsinomer. Dette kan forklares med den høye normalt vev forurensning i denne type kreft [18], noe som kan påvirke genuttrykk signaturer.
I tråd med disse observasjonene, er det 31 gener med
U2AF1
S34F /Y-forbundet spleise hendelser representert i «mitotiske cellesyklus» og «M fasen av mitotiske cellesyklus» gensettene, inkludert
CHEK2
,
CDC27
, og flere subenheter av anaphase- fremme kompleks (tabell S3 i dokument S1).
Skjøte endringer i forbindelse med
U2AF1
S34F /Y mutasjon i både lunge adenokarsinom og AML er av spesiell interesse, da disse ofte endrede gener kan gjøre kjernebidrag til selektiv fordel i disse kreftformene. Vi fant en betydelig overlapping av 30 endrede spleise hendelser som var knyttet til
U2AF1
S34F /Y mutasjoner i både lunge adenokarsinom og AML (figur 2 og tabell 1, Fishers eksakte test p 2.2E-16). For alle 30 spleising arrangementer, i regi av spleising var den samme i begge krefttyper, der
U2AF1
mutasjon forårsaket et skifte til ekson hoppe eller ekson inkludering for samme spleising hendelse. De fleste (63%) av de vanligste endrede hendelsene viste mer distal 3 «spleisesete bruk i
U2AF1
muterte prøver. I tillegg ble 17/30 spleising hendelser betydelig påvirket ved induksjon av
U2AF1
S34F i HeLa celler, men hadde ingen endring på induksjon av
U2AF1
villtype (tabell 1). 60% av disse hyppig endrede spleisehendelser viser 3′-spleisesetet sekvens preferanse for en CAG, eller AAG, spleisesetet over et TAG spleisesete (Tabell 1, a eller b), i samsvar med den totale observerte spleisesetet sekvens preferanse for
U2AF1
S34F /Y-assosiert hendelser. I tillegg har vi sett på gener med endrede spleise hendelser som også var i Kreft Gene Census [19] (tabell S4 i Dokument S1). Tre Cancer Gene Census gener var blant de 30 vanligste endrede spleise hendelser og er av spesiell interesse:
CTNNB1 plakater (TCGA,
innsendt
),
CHCHD7
, og
PICALM product: (Tabell 1 og Tabell S4 i dokument S1).
Den endrede spleising hendelse i
CTNNB1
i
U2AF1
muterte kreftformer resulterer i et skifte mot spleising av en mer proksimale spleisesete i 3 «UTR av
CTNNB1 plakater (Figur 4A-B). Betydelig oppregulering av proksimale spleisesete bruk ble også observert i HeLa-celler som uttrykker
U2AF1
S34F (Figur 4C). Den oppregulert isoformen har vist seg å være en mindre stabil mRNA i HeLa-celler [20]; Derfor kan det endrede skjøting hendelsen medføre en reduksjon av CTNNB1 protein nivåer. Selv om
CTNNB1
aktivering er en kanonisk driver mutasjon, en reduksjon i normale nivåer av CTNNB1 kan også være fordelaktig å kreftceller som RNAi uttømming av
CTNNB1
har vist seg å øke cellemigrering [21 ].
«Percent spleises på» (PSI) verdier av den proksimale 3 «spleisesete av
CTNNB1
3′ UTR spleise hendelse i (A) lunge adenokarsinom og (B) AML. (C) RNA-Seq lese dekning av 3 «UTR arrangementet i HeLa-celler med to
U2AF1
ikke-induserte kontroller, induksjon av
U2AF1
vill-type, og induksjon av
U2AF1
S34F.
For ytterligere å teste eksperimentelt om spleise hendelser observert hos
U2AF1
muterte kreftformer er direkte forårsaket av
U2AF1
mutasjon, transfektert vi 293T celler med enten
U2AF1
villtype eller
U2AF1
S34F konstruerer og analysert endringer i fem spleise hendelser ved hjelp av kvantitativ RT-PCR (figur 5, figur S7 i dokument S1). Vi var i stand til å validere endringer i spleising i
CTNNB1
,
CHCHD7
, og
PTBP1
i celler transfektert med
U2AF1
S34F konstruerer og ikke i cellene transfektert med
U2AF1
villtype (figur 5, uparet t-test, P 0,1). Spleise hendelser i
KARS Hotell og
CHEK2
ikke validere og kan være kontekstavhengige, falske-positive i transkriptom analyse, falske negativer i transfeksjon eksperiment, eller indirekte forsinket mål av
U2AF1
aktivitet.
A gangers forskjell mellom total genekspresjon og inkludering isoform av hver skjøting arrangementet ble normalisert ved den ganger forskjell av en ikke-transfeksjon kontrollprøven for å gi en relativ inklusjonsnivå for hver prøve. De genomiske koordinatene testet spleise hendelser i (A)
CTNNB1
, (B)
CHCHD7
, og (C)
PTBP1
er gitt i tabell 1.
Diskusjoner
Vår analyse av spleise og genuttrykk endringer knyttet til
U2AF1
mutasjon på tvers av flere krefttyper har avdekket forandringer i 3 «spleisesete sekvens anerkjennelse og fremhever potensielle biologiske konsekvenser gjennom endrede kreftgener, for eksempel
CTNNB1
,
PICALM
, og
CHCHD7
. I tillegg har vi validert at i det minste noen av disse spleise endringer er direkte konsekvenser av
U2AF1
mutasjon i transfeksjon eksperimenter.
Mange faktorer er involvert i riktig spleisesete anerkjennelse i kompleks med U2AF1, inkludert U2AF2. Det har vært vel kjent at 3′-spleisesetet konsensusmotiv innbefatter en C eller U nukleotid før AG ved slutten av introner, og mutasjoner i
U2AF1
gi den første indikasjon på at en faktor har en spesifikk preferanse for denne -3-posisjon [12]. U2AF1 har vist seg å svakt binde seg til RNA via det UHM domene [22]. Kanskje S34F mutasjon i oppstrøms sink finger domene påvirker 3 «spleisesete sekvens anerkjennelse gjennom direkte interaksjon med pre-mRNA eller via protein-protein interaksjoner med U2AF2, hnRNP A1 [23], eller DEK [24]. Videre biokjemisk karakterisering av U2AF1 S34F protein i kompleks med andre proteiner kan føre til en mer generell forståelse av 3 «spleisesete sekvens anerkjennelse.
I sammendraget, fant vi flere gener, inkludert flere kjente kreftgener med endret skjøting i tilstedeværelsen av
U2AF1
mutasjon både i menneskelig kreft og i
U2AF1
mutante transfekterte celler. Virkningen av disse spleise endringer på gen-funksjon er et viktig tema for fremtidig etterforskning. Vår identifisering av spleise endringer betydelig og konsekvent knyttet til somatiske mutasjoner i
U2AF1
spleising faktor streker behovet for fremtidige studier inn i funksjonen av alternative spleiseformer gener for å fullt ut forstå de genomiske forandringer assosiert med kreft.
Metoder
Somatiske mutasjoner
Somatiske mutasjon samtaler fra de 12 TCGA Pan-kreft krefttyper ble brukt (doi: 10,7303 /syn1710680.4), med unntak av lunge adenokarsinom. Lunge adenokarsinom somatiske mutasjoner samtaler ble tatt fra TCGA lunge adenokarsinom analyse arbeidsgruppe (TCGA,
legges
).
RNA-Seq behandling
RNA-Seq justerings filer for 230 lunge adenokarsinomer og 173 akutte myeloide leukemier (AML) var tilgjengelig gjennom CGHub (https://cghub.ucsc.edu). AML justeringer lastet ned fra CGHub brukt en eldre versjon av det menneskelige genom referansen (hg18); derfor ble de AML BAM filene konverteres til FASTQ hjelp SamToFastq [25] og deretter realigned mot hg19 hjelp Hat [26] med følgende parametre: «-G [Gencode v7 transkripsjoner [27]] -mate-indre-dist 300 -mate -std-dev 500 «. En AML prøve mislyktes RNA-Seq re-justering og behandling, og ble ekskludert: TCGA-AB-2977. RNA-Seq justeringer av lunge adenokarsinom prøver brukes MapSplice [28].
RNA-Seq FASTQ filer fra HeLa celleforsøk ble lastet ned fra DDBJ depotet med tiltredelses tallene DRR001796-DRR001799. Leser ble justert ved hjelp Hat [26] med Gencode v7 [27] som en transkripsjon guide.
Skjøting analyse
Lung adenokarsinom prøver, AML prøver og prøver fra HeLa cellelinje eksperimenter (HeLa +
U2AF1
villtype non-indusert, HeLa +
U2AF1
S34F ikke-indusert, HeLa +
U2AF1
villtype indusert, HeLa +
U2AF1
S34F induced ) ble kjørt gjennom JuncBASE v0.6 [11] som tre separate analysesett. For lunge adenokarsinom og AML prøver, de JuncBASE parametrene som brukes til å identifisere alternative spleise hendelser og beregne «prosent spleises på» (PSI) verdier var følgende:
-c 2 j [introner fra Gencode v7 product: [27]
] -jcn_seq_len 88
. For de HeLa celleforsøk, de JuncBASE parametrene som ble brukt var følgende:
-c 2,5 j [introner fra Gencode v7 product: [27]
] -jcn_seq_len 202
. For lunge adenokarsinom, mansjettknapper [29]
de novo
transkripsjon merknader var tilgjengelige for å innlemme potensielt nye eksoner i spleising analyse (TCGA,
legges
). UCSC knownGenes hg19 avskrift merknaden ble brukt til å definere kommentert eksoner [30].
For å identifisere
U2AF1
S34F /Y-forbundet differensial skjøting hendelser i lunge adenokarsinom og AML,
compareSampleSets.py
av JuncBASE v0.6 pakken ble brukt med følgende parametre:
-thresh 10 -mt_correction BH -which_test Wilcoxon -delta_thresh 5.0
. Spleise hendelser med en signifikant forskjell (FDR og mindre enn 5%) i PSI verdier mellom prøvene uten spicing faktor mutasjon og prøver med
U2AF1
S34F /Y mutasjon ble ytterligere filtrert for arrangementer med en forskjell i median PSI større enn 10%. Å identifisere spleise hendelser påvirket av uttrykk for
U2AF1
S34F i HeLa-celler,
pairwise_fishers_test_getASEvents_w_reference.py
ble brukt til å sammenligne inkludering og ekskludering isoform lese teller mellom HeLa +
U2AF1
vill -type non-indusert sekvensert bibliotek og HeLa +
U2AF1
S34F-indusert sekvensert bibliotek med følgende parametre:
-thresh 25 -min_dpsi_threshold 5.0 -metoden BH -sign_cutoff 0,05
. Å identifisere spleise hendelser som er spesifikke for
U2AF1
S34F induksjon, arrangementet kan ikke også være vesentlig forskjellig mellom de to kontroller eller når du sammenligner
U2AF1
villtype non-indusert til
U2AF1
villtype indusert. Denne siste restriksjonen ble pålagt å skille spleise endringer på grunn av den S34F mutasjon i stedet for overekspresjon av
U2AF1
. I noen tilfeller, slik som 3′-UTR skjøting ved
CTNNB1
,
U2AF1
villtype-induksjon forårsaket en endring i spleising, men i motsatt retning som
U2AF1
S34F induksjon. For å være konservativ, anser vi en
U2AF1
S34F rammede spleising hendelse som har noen endring på
U2AF1
villtype induksjon å være ikke-spesifikk for
U2AF1
mutasjon ; Men gjør vi oppmerksom i tabell 1 i
CTNNB1
hendelse som også viste en spleising endring i
U2AF1
villtype induksjon, men i motsatt retning.
I tilfeller
