Abstract
Formål
Colon kreftformer som mangler mismatch reparasjon (MMR) kan fremvise redusert ekspresjon av DNA-reparasjon genet,
MRE11
, som følge av sammentrekning av en T
11 mononukleotid kanalen. Denne studien undersøkte MRE11 status og sin tilknytning til prognosen, overlevelse og legemiddelrespons hos pasienter med stadium III tykktarmskreft.
Pasienter og metoder
Kreft og leukemi Gruppe B 89803 (Alliance) randomisert 1264 pasienter med stadium III tykktarmskreft til postoperativ ukentlig adjuvant bolus 5-fluorouracil /folinsyre (FU /LV) eller irinotecan + FU /LV (IFL), med åtte års oppfølging. Svulster fra disse pasientene ble analysert for å bestemme stabiliteten av en T
11 veiene i
MRE11
genet. Det primære endepunktet var total overlevelse (OS), og et sekundært endepunkt var sykdomsfri overlevelse (DFS). Ikke-proporsjonal farer ble adressert ved hjelp av tidsavhengige kovariater i Cox analyser.
Resultater
Av 625 kreft sakene, 70 (11,2%) viste sammentrekning ved T
11 veiene i en eller begge
MRE11
alleler og ble dermed spådd til å være mangelfull i MRE11 (dMRE11). I analyser pooled behandling, viste dMRE11 pasientene ved redusert DFS og OS, men forbedret langsiktig DFS og OS sammenlignet med pasienter med intakt MRE11 T
11 kanalen. I undergruppen av dMRE11 pasienter behandlet med IFL, en uforklarlig tidlig økning i dødelighet, men bedre langsiktig DFS enn IFL-behandlede pMRE11 pasienter ble observert.
Konklusjoner
Analyse av denne relativt lite antall av pasientene og hendelser viste at dMRE11 markør spår bedre prognose uavhengig av behandlingen på lang sikt. I subgruppeanalyser, dMRE11 pasienter behandlet med irinotecan utstilt uforklarlig kortsiktig dødelighet. MRE11 status er lett analyseres og kan derfor vise seg å være et nyttig prognostisk markør, forutsatt at resultatene som rapporteres her for et relativt lite antall pasienter kan generaliseres i selvstendige analyser av større antall prøver.
Trial Registrering
ClinicalTrials.gov NCT00003835
Citation: Pavelitz T, Renfro L, Foster NR, Caracol A, Welsch P, Lao VV, et al. (2014) MRE11-mangel assosiert med økt Long-Term Sykdomsfri overlevelse og total overlevelse i en undergruppe av Stage III tykktarmskreft Pasienter randomisert CALGB 89803 Trial. PLoS ONE 9 (10): e108483. doi: 10,1371 /journal.pone.0108483
Redaktør: Pierlorenzo Pallante, Institute of Experimental endokrinologi og onkologi G. Salvatore «(IEOS), Italia
mottatt: 26 mars 2014; Godkjent: 19 august 2014; Publisert: 13 oktober 2014
Copyright: © 2014 Pavelitz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Forskning rapportert her ble støttet av National Institutes of Health National Cancer Institute P01 CA077852 (WBG, PSR, RJM, NM); og NIH F31 GM073318 og HHMI MedIntoGrad Scholar Awards (AC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftformen, og den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i USA, etter lungekreft [1]. Det vil være anslagsvis 143.000 nye tilfeller i USA i 2013, og mer enn 51.000 dødsfall på grunn av denne kreftformen. Det er viktig å identifisere markører som rapporterer om sykdom prognose.
I likhet med mange andre typer kreft, CRC er preget av svikt i DNA reparasjons trasé som kan påvirke utviklingen av svulsten, dens respons på kjemoterapi og overlevelse i på kort og lang sikt [2]. Omtrent 15% av sporadisk CRC og mest arvelig CRC er kjennetegnet ved mangelfull mismatch reparasjon (MMR-D), som også er vanlig i andre krefttyper, inkludert endometrial og gastriske tumorer [3] – [5]. MMR-D CRC er anerkjent som en egen patologisk og klinisk underklassen, med bedre langtidsprognose, men muligens begrenset respons på standard adjuvant kjemoterapi bestående av 5-fluorouracil (FU) og folinsyre (LV) [2], [6], [ ,,,0],7].
Mangel MMR løfter den somatiske mutasjonsfrekvensen og destabiliserer enkel sekvensen gjentas, eller mikro, som i sin tur kan påvirke gensekvensen og genfunksjoner [8]. Mangelfull MMR kan påvirke prognose direkte eller indirekte, ved å endre funksjonen til et annet gen eller gener. En konsekvens av mangelfull MMR er sammentrekning av en T
11 veiene i intron 4 av
MRE11
genet, som er tydelig i over 60% av MMR-D CRC [9] – [11]. T
11 polypyrimidine kanalen fremmer lariat formasjonen i spleising av ekson 4 til exon 5 av MRE11 karakterutskriften. Sammentrekning av det kanalen svekker spleising, noe som resulterer i ekson hopper og syntese av et mRNA som bærer en ut-av-ramme-stoppkodonet. Dette mRNA koder for et avkortet MRE11 polypeptid, med potensielt dominant negativ virkning på funksjonen av normal-proteinet [12]. Statusen for
MRE11
T
11 kanalen kan lett bestemmes ved vanlig klinisk test som benyttes til å bestemme MMR status basert på ustabilitet i nøytrale mikro markører [13].
MRE11- mangel kan påvirke både klonal evolusjon innenfor en svulst samt terapeutisk respons. MRE11 utgjør en komponent av sterkt konservert MRE11 /RAD50 kompleks, som er essensiell for DNA dobbel tråd bryte reparasjon mediert av både homolog rekombinasjon og ikke-homologe ende-sammenføyning, for telomere vedlikehold, og for signalering i respons til DNA-skade [14 ] – [18]. MRE11 kan særlig påvirke responsen på topoisomerase 1 gift, som funksjon av fangst normalt forbigående kovalente bindingen som topoisomerase 1 skjemaer med DNA for å slappe av supercoiling. Denne klassen av narkotika inkluderer naturlig forekommende stoff camptothecin, og dets derivater irinotecan og topotekan. MRE11 er svært konservert, og genetisk analyse i gjær,
S. cerevisiae
, har vist at MRE11-mangel forårsaker ekstrem følsomhet for camptothecin [19]. In vitro, renset rekombinant MRE11 /RAD50 kan kløyve den kovalente tyrosyl-DNA obligasjon dannet av topoisomerase 1 og resect DNA slutten for reparasjon [20]. I tillegg er en begrenset studie av fem CRC cellelinjer funnet at de som var MRE11 /RAD50-mangel var mer følsomme for irinotecan [21], men kunne avgjøre om irinotecan motstand kan gjenopprettes ved å supplere den MRE11 /RAD50-mangel /.
observasjonene oppsummert ovenfor fører til to hypoteser. Først kan MRE11-mangel være en nyttig markør for tumor prognose; og andre, at MRE11-mangel (dMRE11) svulster kan svare bedre på behandling med topoisomerase 1 giftstoff enn MRE11-dyktigere (pMRE11) svulster. Disse mulighetene var av spesiell interesse på grunn av beredskap som MRE11 status kan analyseres i løpet av standard klinisk molekylær profilering [13].
Nytten av irinotecan er vurdert for adjuvant behandling av stadium III CRC i en to arm kreft og leukemi Gruppe B (CALGB) 89803 klinisk studie som sammenlignet DFS og OS hos pasienter behandlet med FU /LV alene eller i kombinasjon med irinotecan. Ingen forskjell i OS eller DFS ble rapportert samlet, men pasienter med MMR-D svulster utstilt noe forbedret og utvidet DFS hvis behandling inkludert irinotecan [22]. Denne studien gitt derfor informative prøver for å ta opp spørsmålet om MRE11 status korrelert med DFS, OS, eller med svar til irinotecan. For å avgjøre om MRE11 status spår DFS, OS, eller svar på IFL, vi analysert MRE11 status på 625 tumorprøver fra pasienter i CALGB 89803 klinisk studie, både totalt og etter behandling med FU /LV behandling med eller uten irinotecan, mens regnskap for potensielle relasjoner med andre pasientkarakteristika inkludert MMR
Materialer og metoder
protokollen for denne rettssaken og støtte CONSORT sjekkliste er tilgjengelig som tilleggsinformasjon.; se Protocol S1 og sjekkliste S1.
Study befolkningen
Pasienter i denne studien ble deltakerne i NCI-sponset kreft og leukemi Gruppe B (CALGB) adjuvant behandling rettssak for stadium III tykktarmskreft sammenligner terapi med den ukentlige Roswell Park regimet av 5-fluorouracil (FU) og folinsyre (FU /LV) med den ukentlige bolusregime av irinotecan, FU og folinsyre (CALGB 89803 [23]). Totalt 1264 pasienter ble rekruttert mellom april 1999 og april 2001. Alle pasientene gjennomgikk komplett kirurgisk reseksjon og begynte kjemoterapi mellom postoperative dager 21 til 56. Pasientene ble randomisert ved datamaskinen til to behandlingsarmer, 629 pasienter til FU pluss LV og 635 pasienter til irinotecan pluss FU pluss LV (figur 1). Det primære endepunktet i studien var total overlevelse (OS). Sykdomsfri overlevelse (DFS) var et sekundært endepunkt. Oppfølging ble fanget som i mars 2008.
Oversikt over CALGB 89803 randomisert studie som genererte de 625 prøvene testet.
Etikk uttalelse
Undersøkelsen var godkjent av Mayo Clinic Institutional Review Board og North Central kreftbehandling Group (nå en del av Alliance for kliniske studier i Oncology). CALGB protokollen 89803 ble anmeldt av Institutional Review Board of hver deltakende sentrum. Alle pasienter ga skriftlig informert samtykke før deltakelse.
Trial struktur og organisering
Dette forsøket ble utført av CALGB med deltakelse fra North Central Cancer Treatment Group, National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group, Eastern Cooperative Oncology Group, Southwest Oncology Group og National Cancer Institute Cancer Trials Support Unit. Protokollen og listen over deltakende områder er tilgjengelig som tilleggsinformasjon. Den CALGB data sikkerhetsovervåking bord anmeldt sikkerhetsdata to ganger årlig og effekt data på protokolldefinerte intervaller i samsvar med CALGB politikk. Den CALGB Statistiske Center ved Duke University i Durham, NC, opprettholdt klinisk og laboratorie database.
Behandling
Etter sentral registrering, kvalifiserte pasienter ble randomisert (av en datamaskin, ved hjelp av en randomisert fast blokk design) for å motta FU /LV eller FU /LV i kombinasjon med irinotecan (IFL). Behandling har tidligere blitt beskrevet i detalj [24]. I korte trekk, FU /LV Gruppen fikk Roswell Park regimet, som består av ukentlig LV 500 mg /m
2 intravenøst over 2 timer, med en bolus på FU 500 mg /m
2 ved intravenøs injeksjon en time etter initiering av LV, i 6 påfølgende uker etterfulgt av en to-ukers hvile, for fire sykluser (32 uker). Den IFL gruppen fikk ukentlig irinotecan 125 mg /m
2 over 90 minutter umiddelbart etterfulgt av intravenøse bolusinjeksjoner av LV 20 mg /m
2, så FU 500 mg /m
2, for 4 påfølgende uker etterfulgt av en to-ukers hvile, for fem sykluser (30 uker).
DNA-ekstraksjon
DNA ble ekstrahert fra arkivert formalinfiksert parafin-embedded svulstvev ved å inkubere parafin ekstrahert, rehydrert vev i 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) med 0,5% Tween 20 og 20 mg /ml proteinase K i 3 timer ved 55 ° C; eller ved inkubering av vevet i Instagene (BioRad, Hercules, CA) og 30 mg /ml proteinase K i 3 timer ved 55 ° C. Etter inkubasjonen ble prøven deretter inkubert ved 95 ° C i 9 minutter, vortex-blandet forsiktig, og deretter underkastet sentrifugering for å pelletere alle ufordøyd materiale eller den Instagene, respektivt. Den ekstraherte DNA ble deretter porsjonert og lagret ved -20 ° C inntil nødvendig for PCR baserte analyser.
Fastsettelse av
MRE11 Hotell og
RAD50
mononukleotid veis lengder
mononukleotid kanalen lengde ble bestemt ved PCR-amplifisering og DNA-sekvensering, ved anvendelse av en veletablert metode er mye brukt for å karakterisere heterogenitet i mononukleotid trakter karakteristisk av MMR-mangelfull kolorektal, gastrisk og endometriale tumorer, og fremgår ikke i normalt vev eller MMR -proficient tumorprøver (f.eks [9] – [11], [25]). Analysen involverer PCR-amplifisering av området som bærer mononukleotid røret, etterfulgt av DNA-sekvensanalyse. Den samme enkle prosedyren brukes til å vurdere mikro ustabilitet diagnostikk mismatch reparasjon mangel.
Til sammen 625 prøver generert DNA egnet for analyse av regionen
MRE11
intron 4 inneholder T
11 kanalen, 320 fra FU /LV studie arm og 305 fra IFL armen (figur 1).
Nøstet PCR primere ble brukt til å forsterke en region som inneholder mononukleotid område av interesse i MRE11 intron 4. MRE11 forsterkning var med første runde primere, MRE11 x 1F, 5′-GTGGTCATATGCCAATGTAGATTATGC-3 «, og MRE11 x 1R, 5′-CCCTGTGGGATCGTCATGATTGCC-3′, fremstilt et 211 bp produkt; og med andre runde primere, MRE11 x 2F, 5»-GGAGGAGAATCTTAGGGAAAACAGC-3 «, og MRE11 x 2R, 5′-GATTGCCATGAATACTAAACACTGG-3», fremstilt et 139 bp produkt. MRE11 ble sekvensert i både forover og bakover med den andre runden PCR primere.
RAD50 status ble bestemt for 34 CRC med sammentrekninger i
MRE11
. Amplifisering var med første runde primere R50 x 1F, 5′-CTCCCAGTTCATTACTCAGC-3 «, og R50 x 1R, 5′-GACAGGGCATACCAGCT-3′, fremstilt et 326 bp produkt; og med andre runde primere R50 x 2F, 5»-GCTAACAGACGAAAACCAG-3 «, og R50 x 2R, 5′-CATACCAGCTCAGAGTCC-3′, fremstilt et 301 bp produkt. RAD50 ble sekvensert i motsatt retning med primer 5»-CATACCAGCTCAGAGTCC-3 «.
MRE11 status og RAD50 status ble bestemt ved visuell inspeksjon av tracings fra automatisert sekvensering i både forover og bakover av etterforskere blindet til MMR status , som hadde blitt bestemt uavhengig [22], [26]. Resultatene er presentert i tabell 1 og 2.
Fastsettelse av MMR status
MMR status av tumorprøver var på forhånd bestemt av IHC, supplert i noen tilfeller ved analyse av mikro stabilitet ved hjelp av Bethesda panel markører [22], [26]. MMR status av en undergruppe av prøvene ble uavhengig bekreftet i en blindet analyse av PCR amplifisering og sekvense 5 mikro markører (Promega, Madison, WI). Prøvene ble klassifisert som MMR-D hvis 3 eller flere markører utstilt ustabilitet.
Statistiske metoder
Målet med denne studien var å finne ut om svulsten MRE11 status ble assosiert med utfall for pasienter med stadium III tykktarmskreft behandlet med enten FU /LV alene eller i kombinasjon med irinotecan. Den felles primære endepunktene var OS, målt fra oppføring på klinisk utprøving til død uansett årsak; og DFS, målt fra studiestart til dokumentert progresjon av sykdom eller død uavhengig av årsak. OS og DFS fordelinger ble estimert totalt og innenfor kategorier som etter MRE11 og behandling, ved hjelp av Kaplan-Meier metoden. Forskjeller i OS og DFS mellom grupper ble testet ved hjelp av log-rank test. Effektene av MRE11 på OS og DFS ble analysert ved hjelp av Cox-modeller. Hvor den Cox antagelse var signifikant brutt i henhold til fremgangsmåten ifølge Grambsch og Therneau [27], tidsvarierende koeffisienter ble innført gjennom automatisert valg av en eller flere cutpoints på tidsaksen, som i sin tur optimalt tilfredsstilte den proporsjonale farer forutsetningen i en stykkevis mote [28]. Potensialet prediktiv evne MRE11 ble utforsket gjennom toveis interaksjoner med behandling arm, og gjennom partielle interaksjoner når effekten av MRE11 ble modellert som tidsavhengig. Interaksjoner som både var statistisk signifikant (p 0,01) og av tolke klinisk relevans var nødvendig for å konkludere med meningsfylt prediktiv evne til MRE11. Multivariable Cox modeller ble brukt til å studere MRE11 effekt mens kontrollerende for behandling og clinicopathologic faktorer som alder, kjønn, tumor beliggenhet, funksjonsstatus, antall positive lymfeknuter, tumor stadium, og svulst klasse. Potensielle MRE11 samhandling med og justeringer av MMR, KRAS, og BRAF ble også utforsket. Ved anvendelsen av denne analysen, ble oppfølging begrenset til 8 år. Alle statistiske analyser ble utført av Alliance statistikere.
Resultater
Fastsettelse av MRE11 status
Tumor DNA egnet for PCR forsterkning ble hentet fra totalt 625 CRC prøver, 320 fra FU /LV-gruppen og 305 fra ILV gruppen (Consort Diagram, figur 1). De 625 prøvene representerer 49% av 1264 pasienter inkludert på CALGB 89803 [23]. Regionen
MRE11
intron 4 inneholdende T
11 kanalen ble amplifisert og sekvensert (figur 2A), ved anvendelse av en vel-etablert analysen (f.eks [9] – [11], [25]). Eksemplene viser sekvenser av en kontrollprøve med ensartet T
11 traktene på begge allelene, og prøver hvor begge allelene utføres 10 nt veiene, eller traktene fra 10-11 eller 9-11 nt (figur 2B). Skrift lengde heterogenitet var ikke et PCR-sekvensering eller gjenstand, som lengde heterogenitet var ikke tydelig i DNA fra normale celler, og identiske veislengder deduseres fra sekvensering av en enkelt prøve i begge retninger (ikke vist). Heterogenitet kunne reflektere tilstedeværelse av flere under-klonal populasjoner i svulsten.
(A) Skisse av
MRE11
intron 4 /ekson 5 veikryss, viser T
11 veiene i intron 4, flankerende sekvens og primere. Sammentrekning av T
11 veiene hemmer Lariat dannelsestrinnet i mRNA-spleising og fører til hoppe av ekson 5. Den resulterende mutante mRNA som koder for et avkortet MRE11 polypeptid med potensielt dominant negativ virkning på proteinfunksjon [12]. MRE11 er viktig for celle levedyktighet, og
MRE11
mutasjoner som oppstår i MMR-D CRC er ikke null-alleler, men redusere uttrykk og aktivitet av MRE11 protein. (B) Sequence spor av regionen
MRE11
intron 4 som bærer T
11 veiene i fire tumorprøver. Lengder av traktater i nt vist til venstre
Cases ble scoret basert på antall nukleotider tapt ved sammentrekning. En 11 nt kanalen ble scoret som 0; en 10-11 nt kanalen som en; områder med 9-11 nt som 2; og områder med 10 nt (på grunn av tap av en nt på hvert allel) som 2. En total av 555 tilfeller (89%) gjennomføres en intakt T
11 kanalen (skår 0); mens 70 tilfeller (11%) hadde kontraksjoner av 1-6 nt i lengde (1 nt, n = 36; 2 nt, n = 26; 3 nt, n = 6; 4 nt, n = 1, og 6 nt, n = 1). Den totale hyppigheten av
MRE11
T
11 sammentrekninger var 11%, tilsvarende det som er rapportert i andre analyser av CRC prøvene [9] – [11], [25]. Omtrent like mange tilfeller viste sammentrekninger av en nt (36 tilfeller, 5,8%) eller 2 eller flere nt (34 tilfeller, 5,8%). På grunn av en ubalanse av tilfellene uten sammentrekninger verus sammentrekning, og det lave antallet tilfeller i hver sammentrekning kategori, vi definert en dikotom
MRE11
T
11 kanalen variabel: ingen sammentrekninger eller MRE11 dyktigere (pMRE11 , 555 tilfeller) verus sammentrekning eller MRE11 mangel (dMRE11, 70 tilfeller). Ved hjelp av denne dikotomisert klassifisering,
MRE11
T
11 veistrekningen status ble funnet å være signifikant assosiert med tumorlokalisering, histologisk grad, MMR status, og BRAF, KRAS, og P53 mutasjonsstatus (tabell 2).
Fastsettelse av RAD50 status
i noen MMR-D CRC, en exonic A
9 veiene i
RAD50
genet er destabilisert, forårsaker et rammeskifte mutasjon og syntese av en avkortet protein [29]. I en eksplorativ analyse, bestemt vi denne frekvensen blant kreft DNA ekstrahert fra 34 CRC med sammentrekninger i
MRE11 plakater (18 saker med MRE11 score på 1, og 16 med score på 2).
RAD50
A
9 kanalen var ustabil i 11/34 tilfeller (tre med MRE11 score på 1, og 8 med score til to) eller 32% av CRC analysert, lik frekvensen av 40% tidligere rapportert [11].
Fastsettelse av MMR status
MMR status for alle CALGB 89803 prøvene var tidligere blitt bestemt av IHC, genomisk sekvensering med Bethesda panel markører, eller begge deler [26]. Den analysen klassifisert MMR som intakte (MMR-I) i 86% av prøvene, og mangelfull (MMR-D) i 14% (tabell 1). Ustabilitet av
MRE11
T
11 kanalen var sterkt assosiert med MMR-mangel og dermed bestemt: 79% av dMRE11 CRC var MMR-D, og 21% MMR-I (chi-squared test, p 0,0001 ;. Tabell 2)
i en unders analyse, ble MMR status separat bestemt av PCR og sekvensering ved University of Washington (UW) diagnostisk anlegget, utelukkende ved hjelp av kommersielle primere (Promega) som avhøre annen nøytral og ikke -polymorphic markører enn Bethesda panel markører. En totalt 83 CRC ble analysert, blant annet 63 av de 70 dMRE11 prøvene. Av disse ble 50 CRC klassifisert som MMR-D ved CALGB og 56 ved UW (chi-squared test, p 0,0001).
Ustabilitet på
MRE11
T
11 veiene og
RAD50
A
9 kanalen er spådd å korrelere med MMR-D. For å få en følelse av om de ulike analysene som brukes av CALGB og UW kan over-count eller under-teller MMR-D svulster, spurte vi om 9 CRC klassifisert som MMR-I av CALGB analysene, men som MMR-D ved UW analysen var dMRE11 eller pMRE11. Alle disse var dMRE11, og to av dem var også dRAD50. Dette øker muligheten for at
MRE11
T
11 kanalen kan med fordel inkluderes blant markører for bestemmelse av MMR status.
Tumor MRE11 status er betydelig prognostisk for DFS og OS
forholdet mellom MRE11 status og DFS og OS ble bestemt ved bruk av data som samles inn fra og med 10 mars 2008, som representerer en median oppfølging av 6,0 år. Univariate analyser av OS og DFS basert utelukkende på MRE11 status for 625 CRC analysert, uavhengig av kjemoterapeutiske regime, viste at dMRE11 pasienter viste ingen signifikant forbedring i OS (HR 0,98, 95% KI, 0,64 til 1,51) eller DFS (HR 0,80; 95% CI, 0,52 til 1,21) i forhold til pMRE11 pasienter. Men Kaplan-Meier plott av OS og DFS ved MRE11 status (figur 3) viste en mulig overtredelse av proporsjonale farer forutsetning, med de to kurvene krysser under oppfølgingsperioden for hvert endepunkt. Non-forholdsmessighet ble statistisk bekreftet, med nullhypotesen av proporsjonale farer avvist både for DFS (p = 0,0038) og OS (p = 0,0005)
(A) Sykdomsfri overlevelse for dMRE11 (n = 70.; events = 24); 5-yr rate: 67% (95% CI: 56-79%) vs. pMRE11 (n = 555, events = 240); 5-yr rate: 59% (95% CI: 55-63%). (B) Total overlevelse for dMRE11 (n = = 70, events = 23); 5-yr rate: 68% (95% CI: 58-80%) vs. pMRE11 (n = 555, events = 194); 5-yr rate: 71% (95% CI: 67-75%).
For å løse dette brudd på Cox modellering forutsetninger, en stykkevis proporsjonal risikomodell ble konstruert for hvert endepunkt (DFS og OS), noe som resulterer i tid avhengige koeffisienter (HRS) for MRE11 status, som følger. Først en automatisk søking algoritme over et gitter av tidspunkter {t
1 = 0.1 år, t
2 = 0,2 år, …, t
79 = 7,9 år} ble brukt til å identifisere skjæringspunkt t * hvor den forholdsmessige farer antagelsen var optimalt oppfylt på hver side av skjæringspunkt; spesielt er t * definert som verdien av t hvilket ga den største maksimert log delvis sannsynligheten blant Cox modeller som inneholder separate MRE11 effekter (timer) for de to tidsintervaller som er definert av t. Stykkevis forholdsmessighet ble deretter testet og bekreftet i de siste modellene for OS og DFS, produsere den endelige (univariate) modeller for MRE11. De samme cutpoints og tidsavhengige koeffisienter ble brukt i påfølgende samhandling og multivariable Cox-modeller.
Den optimale cut-punktet som ble identifisert for OS var 3,4 år. Før 3,4 år, dMRE11 pasienter opplever betydelig verre OS i forhold til pMRE11 pasienter (HR = 10,95, 95% KI: 6,83 til 17,55, p 0,0001), mens etter 3,4 år dMRE11 er assosiert med økt OS (HR = 0,09, 95% KI: 0,02 til 0,37, p = 0,0008), uavhengig av behandlingsgruppen. Cut-punktet som ble identifisert for DFS var 3,3 år. Før 3,3 år, ble dMRE11 forbundet med dårligere utfall (HR = 7,02, 95% KI: 4,49 til 10,99, p 0,0001), mens etter 3,3 år DFS er forbedret i forhold til pMRE11 pasienter (HR = 0,07, 95% KI: 0,02 til 0,30, p = 0,0002). MRE11 status forble betydelig generell når det justeres for kliniske /svulst variabler (alder, kjønn, antall positive noder, tumorstadium, klasse, og åsted for primærtumor).
I forhold til andre pasient biomarkører, er MRE11 fellesskap betydelig i multivariable modeller med KRAS (OS og DFS), BRAF (OS og DFS), og P53 mutasjonsstatus (OS). Videre MRE11 fortsatt en signifikant prediktor for både OS (p 0,0001) og DFS (p 0,0001) etter justering for MMR, mens MMR er ikke signifikant i disse modellene (DFS p = 0,799; OS p = 0,647). Det ble ikke observert signifikante interaksjoner mellom MRE11 og biomarkører.
univariatanalyser for RAD50 status viste ingen signifikant sammenheng med OS eller DFS. Kovariat justert modeller for RAD50 ble ikke utført på grunn av den begrensede utvalgsstørrelsen (n = 34) og lite antall hendelser.
Vurdering av tumor MRE11 status som prediktiv stønad fra IFL og FU /LV
MRE11 status ble vurdert som en potensiell prediktor nytte IFL gjennom partielle interaksjoner med behandling i stykkevis Cox (ikke-proporsjonal farer) modeller for DFS og OS. Kaplan-Meier plott for MRE11 effekt presenteres ved behandling arm i figur 4A, mens tomter for tilsvarende behandlingseffekten blir presentert av MRE11 status i 4B. Mens noen forskjeller i behandlingseffekten av MRE11 status er visuelt synlig, behandling-av-MRE11 samspillet var ikke signifikant for begge endepunkt. Blant irinotecan-behandlede pasienter (Figur 4A, ikke sant), men dMRE11 pasienter utstilt verre DFS enn pMRE11 pasienter i løpet av det første året med oppfølging (basert på en undergruppe valgt cut-point; p 0,0001), men bedre resultater etterpå (p = 0,004). Tilsvarende dMRE11 pasienter hadde økt risiko for død for de første 3,5 års oppfølging i forhold til pMRE11 pasienter (p 0,0001), og redusert risiko etterpå (p = 0,011). Disse forholdene forble signifikant når justert for alder, kjønn, lymfeknutestatus, tumor stadium, klasse, og åsted for primærtumor, men dette subgruppeanalyse blant IFL-behandlede pasienter bør betraktes som utforskende gitt den lille størrelsen på utvalget og ikke-betydningen av behandling-av-MRE11 interaksjon
(A) Top:. Sykdomsfri overlevelse for dMRE11 vs. pMRE11 behandlet med FU /LV [n = 320; dMRE11 n = 31; events = 11; 5-yr rate: 67% (95% CI: 52-86%); pMRE11 n = 289; events = 122; 5-yr rate: 61% (95% CI: 56-67%)] eller med IFL [n = 305; dMRE11 n = 39; events = 13; 5-yr rate: 67% (95% CI: 53-83%); pMRE11 n = 266; events = 118; 5-yr rate: 57% (95% CI: 51-63%)]. Bunn: Total overlevelse for dMRE11 vs. pMRE11, behandlet med FU /LV [n = 320; dMRE11 n = 31; events = 10; 5-yr rate: 70% (95% CI: 55-89%); pMRE11 n = 289; events = 98); 5-yr rate: 73% (95% CI: 68-79%)] eller med IFL [n = 305; dMRE11 n = 39; events = 13; 5-yr rate: 67% (95% CI: 53-83%); pMRE11 n = 266; events = 96; 5-yr rate: 69% (95% CI: 63-75%)]. (B) Top: Sykdomsfri overlevelse for IFL vs. FU /LV behandlet dMRE11 [n = 70; IFL N = 39; events = 13; 5-yr rate: 67% (95% CI: 53-83%); FU /LV n = 31; events = 11; 5-yr rate: 67% (95% CI: 52-86%)] eller pMRE11 (n = 555; IFL n = 266, events = 118, 5-yr rente: 57% (95% CI: 51-63% ; FU /LV n = 289, events = 122, 5-yr rente: 61% (95% CI: 56-67%)] Bottom. Total overlevelse for IFL vs. FU /LV-behandlet dMRE11 [n = 70; IFL n = 39, events = 13, 5-yr rente: 67% (95% CI: 53-83%), FU /LV n = 31, events = 10, 5-yr rate: 70% (95% CI: 55-89%) eller pMRE11 [(n = 555; IFL n = 266, events = 96, 5-yr hastighet: 69% (95% CI: 63-75%), FU /LV n = 289, events = 98 ; 5-yr rate:. 73% (95% CI: 68-79%)]
Diskusjoner
Denne analysen av behandlede utfall i en kohort av stadium III CRC pasienter behandlet med FU /LV eller IFL viste at etter kontroll for uventede ikke-proporsjonal farer, er MRE11 status betydelig prognostisk for både DFS og OS, og er fortsatt betydelig når det justeres for clinicopathologic variabler og publisert betydelige markører som MMR, KRAS, BRAF, og p53. Videre, etter justering for MMR, MRE11 fortsatt en betydelig prognostisk markør, mens det motsatte er ikke sant. I en eksplorativ subgruppe analyse, ble MRE11 status knyttet til forskjeller i OS og DFS blant pasienter behandlet med IFL. Sistnevnte funn er klinisk interessant, men basert på et relativt lite antall pasienter, og kan bli ytterligere undersøkt i studier melde større antall pasienter. Virkningen på responsen best kan vurderes i en studie av stadium IV pasienter med målbar metastatisk sykdom, selv om det har blitt vist ved flere anledninger at effekten av anti-tumor terapi skiller mellom scene III og stadium IV sykdom.
MMR status var tidligere blitt vist å være både en prognostisk markør [2], [6], [7] og prediktor for respons på IFL i forhold til FU /LV [22]. I lys av den sterke korrelasjonen mellom dMRE11 og MMR-D-status nevnt her, er det ikke overraskende at de prognostiske og prediktive mønstre for de to markører parallelt med hverandre. Men i multivariable prognostiske modeller for DFS eller OS som inneholder begge merkene, forble MRE11 men ikke MMR status sterkt statistisk signifikant under begge tidlige og sene tidsperioder. Dermed gjør betydningen av MRE11 status ikke nødvendigvis sin avhengighet av MMR status.
Det bør bemerkes at dMRE11 pasienter behandlet med IFL utstilt bedre langsiktig DFS enn pMRE11 pasienter i samme behandlingsgruppen, selv om dMRE11 pasienter hadde en uforklarlig økt dødelighet i den første 2 år etter behandling. Det var ingen sammenheng mellom dårlig første reaksjon og kliniske faktorer som alder, kjønn eller lymfeknutestatus. Behandling med irinotecan strakte seg over bare 30 uker, mens forskjellen i respons ikke blitt klart til senere (figur 4), så tidlig behandling-assosiert toksisitet alene er lite sannsynlig å forklare denne forskjellen.
Analysen av MRE11 funksjon i respons til irinotecan ble foretatt basert på resultater fra grunn mekanistiske studier som viser at MRE11 /RAD50 bidrar til reparasjon av DNA-skader indusert av topoisomerase 1 forgifter [19], [20]. Topoisomerase 1 gifter (som irinotecan) og topoisomerase 2 gifter (som etoposid) både fremmer dannelsen av protein-DNA addukter, som er cytotoksiske hvis ikke reparert. Noen innsikt i den betydelige kortsiktige dødelighet blant dMRE11 pasienter behandlet med irinotecan kan gis av studier av mus som mangler enzymet TDP2, som reparerer skader forårsaket av topoisomerase 2 gifter [30].
