Abstract
En økt risiko for tykktarmskreft er relatert til utvikling av metabolsk syndrom inkludert hyperglykemi, og hyperinsulinemi. De høye sirkulatoriske nivåer av glukose og /eller insulin eller anvendelsen av eksogent insulin kan fremme carcinogenese, progresjon av kreft og metastasering, som kan tilskrives den Warburg effekt eller aerob glykolyse. Vi forsøkte å løse disse eksisterende spørsmål ved å bruke glukose analog 2-deoxyglucose (2DG). Ifølge
in vitro
studier vi har utført, kunne glykolyse av kolorektal kreft celler bli avbrutt av 2DG som det redusert de cellulære produksjoner av ATP og laktat. I tillegg 2DG indusert apoptose og cellesyklus-stans, og inhiberte proliferasjon, migrering og invasjon av disse cellene. Siden insulin kan stimulere den cellulære opptak av heksose, herunder 2DG, kombinasjonen av 2DG og insulin forbedret cytotoksisitet av 2DG og i mellomtiden overvant de kreftfremmende virkninger av insulin. Dette
in vitro
studien gitt et synspunkt av 2DG som en potensiell terapeutisk middel mot tykktarmskreft, særlig for pasienter med samtidig hyperinsulinemi eller behandlet med eksogent insulin
Citation. Zhang D, Fei Q, Li J, Zhang C, Sun Y, Zhu C, et al. (2016) 2-deoxyglucose Snur fremme effekten av insulin på kolorektal kreft celler
In Vitro
. PLoS ONE 11 (3): e0151115. doi: 10,1371 /journal.pone.0151115
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 30 september 2015; Godkjent: 22 februar 2016; Publisert: 03.03.2016
Copyright: © 2016 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Priority Academic Program Utvikling av Jiangsu høgskolerådet (PAPD). Ingen potensielle interessekonflikter ble avslørt
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er kjent for å være sterkt. assosiert med en vestlig livsstil. Forekomsten øker raskt over det siste århundret parallelt med den blomstrende økonomisk utvikling [1] .Given økt sykelighet av metabolske syndrom, har mange studier blitt gjennomført for å undersøke deres forbindelse med CRC. Bevis tyder på at type 2-diabetes mellitus (DM), insulinresistens, hyperinsulinemi er uavhengige risikofaktorer for kolorektal kreft [2,3].
Type 2 DM er karakterisert ved hyperglykemi som resulterer fra kombinasjonen av insulinresistens og en relativ mangel på insulin. Høyt sirkulerende glukosenivået er egnet til å favorisere utviklingen av kreft. Hovedårsaken er at de fleste kreftceller hovedsakelig avhengige av aerob glykolyse for å generere energi som er nødvendig for cellulære prosesser, et fenomen kjent som Warburg virkning [4]. Bortsett fra å være den viktigste energikilden er glukose anvendes som en hovedkarbonkilde for anabole reaksjoner [5] .Denne egenskap har vært utnyttet til bilde kreft i klinikker ved å anvende 2- (18F) -fluor-2-deoksy-D- -glukose (FDG) i positronemisjonstomografi (PET). Målrette glukosemetabolismen har blitt en potensiell strategi mot kreft. En av de mest lovende glykolytiske inhibitorer er 2-deoksyglukose (2DG) [6-8]. 2DG er en syntetisk analog glukose som har C-2-hydroksyl-gruppen erstattes med hydrogen (figur 1A). Etter inn i cellen via glukosetransportører (gluts), blir 2DG omdannes ved heksokinase under dannelse av fosforylert 2DG som akkumuleres i cellen, som fører til den ikke-konkurrerende hemming av heksokinase, redusert produksjoner av ATP og laktat, og til slutt hemming av cellevekst og celle død (figur 1B) [6-8].
(A) molekylstruktur av glukose og 2-deoksyglukose. (B) På grunn av strukturell likhet med glukose, entrer 2-deoksyglukose cellen via gluts, som fører til avbrudd i glykolysen med redusert produksjoner av ATP og laktat [6-8]. G: glukose. 2DG. 2-deoxyglucose
I tillegg til effekten av hyperglykemi, insulinresistens og kompenserende hyperinsulinemi er også viktige bidragsytere til utvikling og progresjon av flere svulster [9]. Insulin har blitt bekreftet å være i stand til å stimulere glukoseopptak i mange kreftceller [10], som kan fremme Warburg virkning. Insulin kan også utøve mitogen og antiapoptotic effekter [11-13]. Dessuten kan insulin forsterke biotilgjengeligheten av insulin lignende vekstfaktor-1 (IGF-1) [14-16]. Pasienter med samtidig kolorektal kreft og type 2 DM som også kan bruke insulin står overfor den potensielle trusselen som insulin kan fremme kreft progresjon. Studier med dyremodeller har allerede bekreftet antagelsen [17]. Selv om tiden forholdet mellom insulin eller insulinresistens og tykktarmskreft er ikke eksplisitt, ingen kan overse de potensielle effektene av insulin på ulike stadier av kreftutvikling.
Forstå glukosemetabolismen og funksjonen av insulin i kolorektal kreftceller vil fremme utviklingen av noen nye tilnærminger for forebygging og behandling. Dette
in vitro
studien tar sikte på å fastslå kreft effekter av 2DG og effekten av insulin på kolorektal kreft cellelinjer. I tillegg undersøkte denne studien muligheten for insulin i styrke anticancer effektiviteten av 2DG.
Materialer og metoder
Cell kultur
To kolorektal kreft cellelinjer (HCT116, LoVo ) ble oppnådd fra Celle Bank of Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina) og dyrket i høy glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (4,5 g /l glukose) som inneholder 10% føtalt bovint serum (FBS ), 1% penicillin-streptomycin, i en 5% CO
2 fuktet inkubator ved 37 ° C.
Kjemi
2DG og insulin fra storfe bukspyttkjertelen ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Legemidler ble oppløst i fullstendig kulturmedium. Løsninger ble filter sterilisert ved hjelp av 0,22-mikrometer sprøyte-filter enheter (Beyotime bioteknologi, Shanghai, Kina).
Celleproliferering analysen
Cell Counting Kit-8 (CCK8) assay for celleproliferasjon ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina). Cellene ble behandlet med 2DG og /eller insulin for 24, 48 eller 72 timer. Deretter kulturmedier ble erstattet med friskt medium supplert med celleproliferasjon reagens. Etter 2 timer inkubasjon, ble målinger utført ved bruk av en 96-brønns spektrofotometrisk plateleser (Sunrise-Basic Tecan, Østerrike) med absorbansen ved 450 nm bølgelengde. Effekt av insulin på celleproliferasjon ble evaluert og en passende insulinkonsentrasjon ble bestemt for å lykkes studier.
Flowcytometri i analyse av apoptose og cellesyklus
Flowcytometri i analyse av apoptose ble utført ved hjelp av en dobbel fargemetode med Annexin V-FITC-og propidiumjodid (PI). Analysen ble utført ved hjelp av apoptose Kit (KeyGen Biotech. Co Ltd, Nanjing, Kina) i henhold til produsentens anvisninger. Celler ble dyrket med 2DG og /eller insulin i 24 timer og deretter trypsinert uten EDTA, vasket med PBS, farget med Annexin V-FITC og PI og analysert ved flowcytometri (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Data ble behandlet av Kaluza flowcytometri analyse programvare 1.2 (Beckman Coulter).
For cellesyklusanalyse ble Cell Cycle Analysis Kit fra Beyotime Bioteknologi (Shanghai, Kina) brukes basert på produsentens anvisninger. Celler ble samlet opp, vasket med PBS, fiksert i 75% kald etanol og inkubert over natten ved 4 ° C. Deretter ble cellene vasket og resuspendert i fargeløsning som inneholdt PI og RNAseA og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C før strømningscytometri-analyse. Cellesyklus fraksjonene ble kvantifisert med WinCycle programvare (Phoenix Flow Systems, San Diego, California).
Cell migrasjon og invasjon analysen
migrasjon og invasjon av kolorektal kreft celler ble vurdert ved hjelp av Transwell permeable Støtter (Corning Incorporated, Corning, NY, MA) med filtre på 8,0 mikrometer porestørrelse, 6,5 mm diameter. Kreftcellesuspensjoner i DMEM (5 x 10E5 celler /ml, 100 pl) supplert med eller uten medikament ble tilsatt til det øvre rom av kammeret, og 600μL DMEM inneholdende 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer. Etter 24 timers inkubasjon ble filtrene høstet og nedsenket i krystallfiolett. Celler på den øvre overflaten av filteret var tørket bort med bomullspinner. Antallet celler som passerte gjennom filteret ble tellet i fem feltene under et mikroskop. For
in vitro
invasjon assay, Matrigel (BD Biosciences) ble tilsatt til den øvre overflate (50 ul /cm
2) for å danne en matrise barriere og den inokulerte cellekonsentrasjon var 1 x 10E6 celler /ml .
ATP innholdsanalyser
Den intracellulære ATP-innholdet ble bestemt ved hjelp av en luciferin-luciferase basert metode. Celler ble inkubert med 2DG og /eller insulin i 24 timer. Deretter ble cellene trypsinert, telte og behandles ved hjelp av ATP Assay Kit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina) og målinger ble utført ved hjelp av et luminometer (GloMaxTM 20/20, Promega Corporation, Madison, WI). ATP-produksjonen var normalisert til cellenummer og uttrykt som prosent av et normalisert ATP verdier som finnes i kontrollceller.
laktat produksjon analyserer
laktatproduksjon analysene ble utført ved hjelp av laktat analysesett (Beyotime Biotechnology, Shanghai , Kina). Etter 24 timer behandling med 2DG og /eller insulin ble cellene skrapet av med en celleskrape og celle tall ble talt opp. Deretter ble suspensjonene ble sonikert på is i 3 sykluser. Hver syklus besto av 5s sonikering med en 100W utgangseffekt fra en Qsonica ultralyd celle disruptor (Newtown, CT) etterfulgt av 30-årene inkubasjon. De ultralydbehandlede prøvene ble analysert for å bestemme hele laktatnivåer etter produsentens anvisninger. Ekstracellulære laktatnivåer ble også bestemt som dyrkningsmedier ble samlet opp og testet. Målinger ble utført ved å bruke en Tecan spektrofotometrisk plateleser med absorbansen ved 540 nm bølgelengde. Laktat produksjoner ble normalisert til cellenummer, og uttrykt som prosent av kontrollen.
proteinekstraksjon og Western blotting
Celler ble behandlet med 20uU insulin og /eller 5 mM 2DG i 24 timer og deretter ble lysert med Radioimmun nedbør analysen (RIPA) buffer (Beyotime bioteknologi, Shanghai, Kina) supplert med 1% phenylmethanesulphonyl (PMSF) (Beyotime bioteknologi). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med en BCA Protein Assay Kit (Beyotime bioteknologi). Prøvene ble blandet med 5 × SDS-PAGE utvalg lasting buffer. Like mengder av hele proteinekstrakter ble elektroforert gjennom en polyakrylamidgel og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Billerica, Massachusetts) ved våt elektroforetisk overføring. Membraner ble blokkert i 5% skummet melk i Tris-bufret saltvann pluss 0,1% Tween 20 (TBS-T) og deretter inkubert over natten med angitte primære antistoffer mot Phospho-AMPKα (Thr172) (Cell Signaling Technology), AMPKα (Cell Signaling Technology) , SLC16A3 /MCT4 (Abcam), LC3A /B (Cell Signaling Technology), GAPDH (Cell Signaling Technology), Mcl-en (Cell Signaling Technology), survivin (Cell Signaling Technology), MMP2 (Cell Signaling Technology), p62 (Cell Signaling Technology). Blottene ble deretter vasket og inkubert med pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., USA) og visualisert med Immobilon ™ vestlige Chemiluminescent HRP-substrat (Millipore Corp., USA) ved anvendelse av FluorChem E systemet (ProteinSimple, Santa Clara, CA ).
Statistical Analysis
data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra minst tre uavhengige forsøk. Statistisk analyse ble utført basert på t-test. En P-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. De statistiske operasjoner ble utført ved hjelp av statistiske Package for Social Science versjon 19 programvare (SPSS, Chicago, IL).
Resultater
Insulin forbedret antiproliferation og apoptose induksjon av 2DG
in vitro
i første rekke eksperimenter, undersøkte vi om 2DG besatt noen antiproliferativ effekt i kolorektal kreft cellelinjer. Celle proliferasjonsanalyse ble utført hver 24. time i 72 timer. Dataene viste at 2DG utøves en betydelig inhiberende virkning på proliferasjonen av begge celler sammenlignet med kontrollen (Fig 2B1 og 2C1). Den inhibitoriske effekt var dose- og tidsavhengig. I motsetning til dette, insulin generelt viste en beskjeden kampanje på celleformering (figur 2A), som ikke øke i takt med økningen av insulinkonsentrasjonen. 20μU /ml insulin nær den øvre grensen for normal fysiologisk nivå i fastende tilstand ble valgt for å lykkes studier. Kombinasjonen av 2DG og insulin (20μU /ml) resulterte i en signifikant større undertrykkelse av cellulær proliferasjon sammenlignet med 2DG behandling alene (Fig 2B og 2C).
Prosentandeler av levedyktige celler ved forskjellige tidspunkter (24,48 , 72h) ble vist. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD av resultatene oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter. (A) Cellulær proliferasjon i respons til ingrediens konsentrasjoner av insulin. (B og C) HCT116 og LoVo kolorektal kreft celler ble behandlet med 2DG ved indikerte konsentrasjoner med eller uten tilstedeværelse av insulin (20μU /ml). (D) Cellene ble behandlet i 72 timer med 5 mM 2DG og /eller 20μU /ml insulin. Celle vekstkurver ble konstruert. *, signifikante forskjeller versus kontrollene (P 0,05). #, Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen på samme tid (P 0,05).
celle apoptose analyse ved strømningscytometri viste en svak økning i kreftcellen apoptose etter behandling 2DG
in vitro
(fig 3). Andelene av annexin V-positive /PI-negative celler, noe som indikerer begynnelsen av apoptotiske celler, og Annexin V-positive /PI-positive celler, noe som indikerer slutten av apoptotiske eller nekrotiske celler, økte på en doseavhengig måte (data ikke vist) under effekten av 2DG. Western blot analyse viste at 2DG hemmet uttrykk for overlevelse proteiner MCL-en og Survivin (fig 4). Selv om det ikke er statistisk signifikant, har en tendens til å undertrykke insulinkreftcelle apoptose. Når insulin ble administrert samtidig, ble apoptotiske celler ytterligere økt sammenlignet med 2DG monoterapi (fig 3). Resultatene av mobilnettet spredning og apoptose analyser antydet at insulin fremmet kreft effekter av 2DG og at 2DG snudd kreft fremme effekten av insulin.
Flowcytometri analyse av celle apoptose ble oppdaget av PI og Annexin V-FITC farging (A: HCT116, B: LoVo). Celler ble behandlet med 5 mM 2DG og /eller 20μU /m insulin. Eksperimentet ble utført i tre eksemplarer. Representative bildene ble vist. *, P 0,05. # Betydelige forskjeller versus kontrollene (P 0,05)
Western blot analyse av Mcl-en og Survivin.. GAPDH ble brukt som en lasting kontroll.
2DG indusert G1 cellesyklus arrest
in vitro
Raskt prolifererende kreftcellene er avhengige av økte mengder glukose ikke bare for energiproduksjon, men også for biosyntesen av nukleinsyrer, proteiner og lipider [18]. Interferensen med glukosemetabolismen kan arrestere eller forsinke cellecyklusprogresjonen. Strømningscytometri-analyse av cellesyklusfordelingen viste at inkubasjon av celler med 2DG resulterte i en økt prosentandel av celler i G1 fase (fig 5). Motsatt, insulin induserte en kraftig økning av celler i S og G2-fasene. Imidlertid ble det G1 cellesyklus-stans ved 2DG dempes men ikke markedsført av insulin
Cell syklus fordeling av kreftceller behandlet under varierende betingelser. (A: HCT116, B: LoVo). Eksperimentet ble utført i tre eksemplarer. Representative bildene ble vist. *, P 0,05. # Betydelige forskjeller versus kontrollene (P 0,05).
Kombinere 2DG med insulin markert trykt kreft celle migrasjon og invasjon
in vitro
For å finne ut enten 2DG kunne dempe metastatisk potensial, ble Transwell permeable Støtter benyttes med og uten Matrigel belegg for å vurdere invasjon og migrasjon, henholdsvis. Sammenlignet med kontrollgruppen, invasjon og migrering var signifikant hemmet i begge celler behandlet med 2DG (figur 6). Omvendt, insulin betydelig forbedret kreft celle migrasjon og invasjon. Antallet migrerte og invaderte celler var henholdsvis 1,28 folder og 1,32 folder av kontrollene i HCT 116, 1,25 folder og 1,42 folder i LoVo. Sammenlignet med 2DG monoterapi, ble migrering og invasjon i begge cellene ytterligere deprimert av en kombinasjon av insulin og 2DG. Antallet migrerte og invaderte celler falt med over 50% av de i kontrollgruppene. Western blot analyse viste at insulin fremmet ekspresjon av MMP2 protein-en nøkkel medlem blant matriksmetalloproteinaser, noe som kan til en viss grad forklare invasjonen fremme effekten av insulin. I motsetning til dette, 2DG hemmet ekspresjon av MMP2 (figur 7B).
i migrering og invasjon analyser av kreftceller, ble fem tilfeldig valgte felt analysert. Representative bilder vises. Antallet migrerte og invaderte celler ble presentert. Resultatene ble representert som middelverdi ± SD. #, signifikante forskjeller sammenlignet med kontroller (P 0,05). * P 0,05.
(A) De totale og ekstracellulære laktatnivåer ble vist for celler behandlet med 2DG og /eller insulin for 24 timer. Det intracellulære laktat ble bestemt som forskjellen mellom de av den totale og ekstracellulært. #, signifikante forskjeller sammenlignet med kontroller (P 0,05). * P 0,05. (B) Western blot analyse av SLC16A3 /MCT4, MMP2. GAPDH ble brukt som en lasting kontroll.
Kombinere 2DG med insulin førte til markert nedgang i ATP og laktat produksjon
in vitro
På bakgrunn av anticancer effekter, vi deretter undersøkt effekten av 2DG på glykolyse
in vitro
. Raskt prolifererende kreftceller er kjennetegnet ved forhøyet glykolysen, derfor hypotesen om at vi 2DG ville føre til glykolysen undertrykking på grunn av sin nonmetabolizable karakter og hemming av noen glykolyse enzymer. ATP og laktatnivåer som svar på 2DG ble analysert. Betydelig nedgang i totale intracellulære ATP-nivåer ble observert etter 2DG administrasjon (Fig 8A). Inkubasjon av HCT116 og LoVo-celler med 2DG på 5 mM i 24 timer førte til ATP-nivåer ved 53% og 42% av nivåene i ubehandlede celler, respektivt. Tilstedeværelsen av insulin har ikke påvirke ATP produksjon. Når de to stoffene ble anvendt sammen, ble ATP-innholdet ytterligere redusert. Som en konsekvens av ATP deprivasjon, 2DG indusert oppregulering og aktivering av AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) som demonstrert ved Western blot analyse (figur 8B). 2DG også indusert oppregulering av LC3I og konverteringen fra LC3I til LC3II (fig 8B), som foreslo oppregulering av autophagy. En annen markør for autophagy – p62- avtar med høyden av autophagy som det kan bli degradert i denne prosessen [19]. Som vist i figur 8B, 2DG senket P62 nivå. 2DG strukturelt ligner glukose, men det kan ikke bli metabolisert til å generere energi og dermed etterligne effekten av glukosemangel og aktivering autofagi.
(A) ATP-nivåer etter behandling av 2DG og /eller insulin (20μU /ml) i 24 timer i kolorektal kreftceller. ATP-nivåer ble normalisert til ubehandlede kontrollprøve. Dataene er gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. #, signifikante forskjeller sammenlignet med kontroller (P 0,05). * P 0,05. (B) Western blot analyse av Phospho-AMPKα (Thr172) representerer aktiv AMPK, AMPKα representerer total AMPK, p62, LC3A /B. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting.
Når det gjelder bestemmelse av laktatproduksjon
in vitro
, ble cellesuspensjoner sonikert og analysert for det totale laktatnivåer (figur 7A). Forskjellen mellom de totale og ekstracellulære laktatnivåer kan indirekte indikere intracellulære laktatnivå. Resultatene viste at både totalt og ekstracellulære laktatnivåer ble økt med insulin sammenlignet med kontroll, mens overraskende de intracellulære laktatnivåer ble svakt redusert i begge celler. Vi antok at laktat kan bli fortært av disse normoksisk cellene for anabolisme eller eksporteres mye mer kraftig under påvirkning av insulin. Som forventet, 2DG betydelig redusert laktatproduksjon. Kombinasjonen av de to midlene førte til en ytterligere redusert laktat nivå, mens det intracellulære laktat syntes å være svakt øket. Monokarboksylat transportør 4 (MCT4), som er involvert i ekstrudering av laktat, var signifikant nedregulert ved en kombinasjon som vist ved Western blot (Fig 7B), noe som kan forklare økningen i intracellulær laktat i en viss grad.
diskusjon
Type 2 DM pasienter kan hyperglykemi øker risikoen for kreft, som til en viss grad kan tilbakeføres til den Warburg effekt et fenomen at de fleste kreftceller hovedsakelig produsere energi ved glykolyse i stedet for oksidativ fosforylering, etterfulgt av en forhøyet utskillelse av melkesyre, selv i den tilstand av tilstrekkelig oksygen spenning [5]. Hyperinsulinemi kan også være en potensiell bidragsyter til kreft som den metaboliske virkning av insulinet kan fremme Warburg virkning. En høy (suprafysiologiske) dose av eksogent insulin er ofte nødvendig ved behandling av diabetes, for å oppnå normalt blodsukkernivå. Mens bedre metabolsk kontroll, kan forhøyet insulinnivå øker kreftrisiko ved doseavhengige effekter på cellulær differensiering, vekst, spredning, migrasjon og invasjon [20]. For diabetes pasienter med kreft, er utvikling av insulinresistens rapportert å bli kombinert med hyppig insulin reseptor-overekspresjon og økt insulinaktivitet i kreftceller [12]. Insulin kan også hindre effektiviteten av mange kjemoterapeutiske medikamenter [21-23]. Selv om det fortsatt gjenstår et spørsmål om hvorvidt, eller i hvilken grad, fører eksogen insulinbehandling kreft progresjon hos pasienter, ingen kan overse den potensielle trusselen av insulin som har blitt bekreftet av
in vivo
dyrestudier [11 ].
Når det gjelder tykktarmskreft, diabetes har blitt foreslått som en viktig bidragsyter til utviklingen [11]. Epidemiologiske studier observert en positiv korrelasjon mellom faste hyperglykemi (≥ 6,1 mmol /l) og tykktarmskreftforekomst. Til tross for betydelige fremskritt innen kirurgisk og medisinsk behandling, kolorektal kreft er fortsatt en svært utbredt og dødelig kreft i utviklede land. Basert på ovennevnte standpunkter, foreslår vi at målretting glukosemetabolismen i behandling av kolorektal kreft er lovende. Selv om mange kreftceller er følsomme og sårbare for glukosemangel [24]. Denne strategien er upraktisk i pattedyr, fordi prosessen med glukoneogenese, hovedsakelig finner sted i leveren, noe som gir en kilde for glukose fra ikke-karbohydratkarbon substrater, slik som laktat, glyserol. Det er således oppnåelig og bærekraftig å etterligne glukosemangel
in vivo
gjennom hemming av glukosemetabolismen ved anvendelse av farmakologiske midler så som 2DG. Når transportert inn i cellene via gluts er 2DG fosforylert av heksokinase under dannelse 2DG-6-fosfat, som ikke kan metaboliseres videre via glykolyse, men snarere akkumuleres og noncompetitively hemmer heksokinase og kompetitivt hemmer fosfoglukoseisomerase [18,25,26]. Derfor er normal glukosemetabolisme forstyrret, noe som fører til energimangel og til slutt celledød. Heri, foreslo vi 2DG som en potensiell kandidat mot tykktarmskreft. Spesielt når eksogent insulin blir administrert eller sirkulasjons hyperglykemi er kombinert, effektiviteten av 2DG kan bli ytterligere forbedret ettersom insulin kan fremme cellulært opptak av heksose.
in vitro
studie utført funksjonelle analyser av kolorektal kreftceller slik som celleproliferasjon, apoptose, migrering og invasjon. Glykolyse ble analysert ved oppsetninger av ATP og laktat. 2DG og insulin ble anvendt til behandling av disse cellene enten alene eller i kombinasjon. Resultatene viste at 2DG hadde hemmende effekt på cancercelle mens insulin hadde direkte fremmende effekt. Når insulin ble kombinert, ble kreft effekter av 2DG forbedret og kreft fremme effekten av insulin ble reversert. Den glykolyse hemming av 2DG ble også fremmet av insulin.
Western blot analyse for overlevelsesproteiner, inkludert Mcl-en og survivin, ble også analysert. Resultatet viste at 2DG hemmet uttrykk for begge proteiner (fig 4). Survivin er medlem av inhibitor av apoptose (IAP) familie. Det er sterkt uttrykt i de fleste humane kreftceller. Survivin kan hemme caspaseaktivering og undertrykke apoptose. [27,28]. Mcl-1 er et anti-apoptotiske medlem av Bcl-2-familien. Det lokaliserer til mitokondriene, motvirker pro-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer, og hemmer apoptose indusert av cytotoksiske stimuli. Mcl-1 er rapportert å være involvert i celledød indusert av inhibisjon av cellemetabolismen. MCL-en nedregulering spiller en avgjørende rolle i 2DG indusert apoptose [7,29].
2DG administrasjon med en lav dose var ikke helt effektiv til å indusere celledød og apoptose. Mens, migrasjon og invasjon ble markert undertrykt av 2DG, som ble neppe tilskrives den beskjedne cytotoksisitet av 2DG på det dose. Sottnik et al. rapportert at 2DG var svært effektiv til å hemme metastatisk fenotype av et stort utvalg av tumortyper både
in vitro Hotell og
in vivo
, som ble assosiert med cytoskeletal omorganisering og hemming av cathepsin L uttrykk [ ,,,0],30]. I denne studien vi oppdaget at ekspresjonsnivået av MMP2. Matrix metalloproteinaser (MMP) er en familie av sink- og kalsium- avhengige proteolytiske enzymer som er involvert i nedbrytningen av ekstracellulære matrise og metastatisk fenotype av kreft. Som en viktig medlem av MMP’er, har MMP2 vist seg å være i stand til å nedbryte kollagen IV, er den viktigste strukturelle komponenten i basalmembran [31-33] .Western blot-analyse viste at insulin fremmet ekspresjon av MMP2-protein, noe som kan til en viss grad forklare sin promotering av invasjonen. I motsetning til dette, 2DG hemmet ekspresjon av MMP2. Glykolyse ble markert hemmet av 2DG som demonstrert av de begrensede produksjoner av ATP og laktat. På grunn av ATP uttømming og økt intracellulær AMP /ATP-forhold, AMPK, en viktig cellulær energi sensor, er aktivert. AMPK aktivering forsøker å gjenopprette ATP generasjon via slått på katabolisme og slå av anabolisme. ATP-tidkrevende prosesser som biosyntese, cellevekst og spredning er behersket [34,35]. Cellesyklusutvikling kan bli stoppet ved den G1-S-fase overgang [36]. Forhøyede glykolyse resulterer i genereringen av store mengder av laktat som må transporteres ut av celler for å forhindre forgiftning seg selv. Melkesyre transport over plasmamembranen er mediert av en familie av proton-koblede monokarboksylat transportører (MCT) [37]. Øket ekspresjon av MCT4 i tumorceller er blitt rapportert tidligere [38]. Våre resultater viste at 2DG behandling førte til redusert laktatproduksjon og nedregulering av MCT4. Hemninger av laktatproduksjon og ekstrudering er viktige aspekter i kreft effekter av 2DG siden forhøyet laktat under glukosemetabolismen generelt viser seg å være gunstig for kreftceller. På den ene siden, laktat eksport resulterer i surgjøring av mikromiljøet som muliggjør tumorangiogenese og gir en gunstig betingelse for aktivering av katepsin og metalloproteinaser som fører til ekstracellulær matriks nedbrytning og tumorcellemetastase [38,39]. På den annen side, ekstracellulær surgjøring bidrar indirekte motstand av kreftceller til stråling og noen cytotoksiske medikamenter, såsom doksorubicin [40]. I tillegg er laktat stand til å inhibere differensieringen av monocytter til dendrittiske celler og inaktiverende cytokin frigivelse derved bidrar til immun rømning av kreftceller [40]. Laktat kan også favorisere tilstøtende aerob tumorcellevekst fordi det kan brukes for å ta plassen til glukose for oksidativ fosforylering [38].
Basert på mange nylige undersøkelser, toksisiteten følgende 2DG behandling kunne forklares med mer enn en mekanisme avhengig av metabolsk profil av en spesiell kreftcelletype. Etterligning av glukose deprivasjon, er 2DG stand til å indusere autofagi [41-43]. Konverteringen fra LC3-I til LC3-II er en representativ prosess for autofagi fluks [19]. En signifikant oppregulert uttrykk for LC3 II protein ble påvist i 2DG behandlet kolorektal kreftceller. Foruten LC3, er p62 en annen produsent av autofagi. p62 er et ubikvitin-bindende protein, og er nødvendig for dannelsen av ubiquitinmolekyler proteinaggregater. p62can selektivt innlemmet i autophagosome gjennom binding til LC3, fører proteinaggregater til degradering. Lysosomal degradering av autophagosomes fører til nedgang i p62 [19,44]. Western blot analyse viste reduserte nivåer av p62 etter 2DG administrasjon. Selv om autofagi er kjent som en celle overlevelse mekanisme i henhold stressfaktorer, gang omfattende aktivert, selvoppholdelsesdriften kan bli til massiv ødeleggelse [45]. Til tross for inhibering av glykolyse og induksjon av autophagy, kan 2DG føre til endring av N-bundet glykosylering og intensivering av oksidativt stress [25,26,46].
i betraktning de bivirkninger av 2DG, andre høyt glukose- uselvstendige vev til tross for kreftceller, så som hjerne, hjerte, retina og testiklene, er alle potensielle ofre [38]. Tidligere kliniske studier bekreftet at 2DG administrasjonen var generelt trygt og godt tolerert av pasientene. Forbløffende nok selv om intravenøs administrering av 2DG kan føre til hyperglykemi, observerte bivirkninger var ganske lik de av hypoglykemi [47-49].
Når det gjelder sammenhengen mellom CRC og diabetes, meformin har også vist seg å være en potensiell legemiddel mot tykktarmskreft gjennom regulering av AMPK og mammalian target of rapamycin (mTOR) -signaling vei [50]. I likhet med 2DG, kan meformin hemme energiproduksjon av kreft celle og påvirker celle metabolisme. En kombinasjon av metformin og 2DG har vært undersøkt for å være mye mer effektiv i å undertrykke kreftceller gjennom induksjon av apoptose. [51,52].
Strategien med å kombinere 2DG og insulin viste seg å være lovende mot tykktarmskreft og kan være nyttig i behandling av andre kreftformer. 0,05.
