Abstract
Formål
mirnas kan regulere de biologiske prosesser, herunder differensiering, spredning og apoptose. Dicer og drosha er to medlemmer av RNase III familie, spiller sentrale roller i vei av miRNAs biogenesis. I denne studien hypotese vi at genetiske varianter av dicer og drosha gener assosiert med blærekreft risiko.
Experimental Design
Vi utførte en case-control studie av 685 blære krefttilfeller og 730 kontroller for å undersøke sammenhengen mellom de syv funksjonelle SNPs av
dicer Hotell og
drosha
gener og blærekreft risiko. Vi vurderte deretter funksjonaliteten til de viktige SNPs
Resultater
Vi fant at rs10719T . C polymorfisme ligger i 3 «uoversatt region (UTR) av
drosha
genet ble forbundet med økt risiko for blærekreft. Stratifisert analyse antydet at rs10719TC /CC genotype kan øke risikoen for blærekreft blant mannlige pasienter (Justert OR = 1,34, 95% CI = 1,05 til 1,70,
P
= 0,018), og stadig røykere (1.56, 1.14- 2,14, 0,006), sammenlignet med TT genotype. Videre
drosha
rs10719T C polymorfisme ble spådd å regulere bindingsaktiviteten av HSA-MIR-27a /b. Luciferase rapportert genet analysen bekreftet at rs10719 T til G substitusjon påvirket bindingssetet for HSA-MIR-27b, som resulterer i økte nivåer av drosha protein.
Konklusjoner
Samlet utgjør disse funnene antydet at
drosha
rs10719T . C polymorfi kan være forbundet med blærekreft risiko i en kinesisk befolkning, og HSA-Mir-27b kan påvirke uttrykket av drosha protein ved å binde med 3’UTR
Citation : Yuan L, Chu H, Wang M, Gu X, Shi D, Ma L, et al. (2013) genetisk variasjon i
drosha
3’UTR Regulert av HSA-Mir-27b er forbundet med blærekreft Risk. PLoS ONE 8 (11): e81524. doi: 10,1371 /journal.pone.0081524
Redaktør: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine ved Dartmouth, USA
mottatt: 03.06.2013; Godkjent: 14 oktober 2013; Publisert: 28.11.2013
Copyright: © 2013 Yuan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av National Natural Science Foundation of China (81230068, 30901166, 81202268 og 81102089), Science Foundation i Jiangsu-provinsen (BK2011773 og BK2011775), Key Program for grunnforskning av Jiangsu Provincial Department of Education (11KJB330002, og 12KJA330002) Natural Jiangsu Provincial Seks talent Peaks Project (2012-SWYY-028), Specialized forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning (20123234110001), Nyutdannede Jiangsu Provincial Innovative Project (CXZZ12_0594), Qing-Lan-prosjektet i Jiangsu Provincial Department of Education, og Priority Academic Program Utvikling av Jiangsu høgskolerådet (Public Health og forebyggende medisin). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blære kreft står for omtrent 2% av alle menneskelige kreftformer med anslagsvis 72,570 nye tilfeller og 15,210 dødsfall i USA i 2013 alene [1]. I Kina, den samlede registrerte blærekreft forekomsten var 7,49 /100 000 i 2008, og forekomsten av blærekreft var stigende i løpet av 1998-2008 (gjennomsnittlig vekst per år, 4,60%) [2]. Mer enn 90% av blærekreft er overgangsordning celle carcinoma. Forekomsten av blærekreft er generelt høy i USA og Europa, men lav i Asia. Som andre vanlige kreftformer, er blærekreft en kompleks sykdom forårsaket av både genetiske og miljømessige risikofaktorer. Sigaretter røyke, yrkesmessig og miljømessige eksponeringer er veletablerte kjente risikofaktorer for blærekreft [3]. Det har blitt rapportert at FGFR3 mutasjon var forbundet med lav blære svulst klasse og scene, og mutasjoner i TP53 og FGFR3 viste en invers sammenheng [4-6]. Nylig har flere genom-wide assosiasjonsstudier (GWAS) med gjennomkjøringer identifisert som de vanligste genetiske variasjoner er knyttet til mottakelighet for blærekreft [7-11]. Tang et al. også identifisert som en uvanlig koding variant av
UGT1A
locus (GWAS relatert) kan påvirke
UGT1A
mRNA uttrykk og redusere risikoen for blærekreft [12], men de eksakte mekanismene av blæren kreft har ikke avklares.
microRNAs (mirnas) er en klasse av små ikke-kodende RNA-molekyler av ~ 22 nukleotider, som regulerer genekspresjonen på det post-transkripsjonelle nivå gjennom binding av den 3 «ikke-translatert region (UTR ) av målgener mRNA [13]. mirnas er generert i en to-trinnvis behandling reaksjonsvei mediert av to store enzymer (dicer og drosha): I kjernen, lengre forløpere bearbeides til primære RNA (pri-mirnas) ved RNase II og deretter pri-mirnas behandles av RNase enzym (drosha) i forløpere (pre-mirnas) med en stilk-løkke struktur [14,15]. Pre-mirnas eksporteres fra kjernen til cytoplasma ved exportin-fem protein. I cytoplasma, er pre-mirnas behandlet i modne mirnas av en annen RNase enzym (dicer). De modne mirnas spille roller ved å innlemme inn i RNA-induced Slå kompleks (RISC) [16]. Det har blitt foreslått at mirnas er forutsagt for å regulere 30% av humane gener [17]. Nylig har flere studier vist at mirnas kunne fungere som onkogener og tumor dempere ved å målrette 3’UTR viktige gener [18,19] og de genetiske varianter i 3’UTR av miRNA målgener ville påvirke miRNA-mediert genregulering, til slutt resulterer den økte risikoen for kreft [19,20]. Det er verdt å merke seg at dicer og drosha spille avgjørende rolle i kreftutvikling. Akkumulerte bevis har vist at ubalansen
dicer Hotell og
drosha
uttrykk nivåer er assosiert med blærekreft risiko [21-23]. Nylig, Han og hans kolleger fant også at
dicer Hotell og
drosha
uttrykk nivåer ble oppregulert i blærekreft vev sammenlignet med matchede normale blæren vev, og stanse dicer eller drosha kan hemme celle spredning og indusere celle apoptose [24]. Her foreslår vi at det er berettiget å undersøke rollene til
dicer
og
drosha
i mottakelighet for blærekreft.
Til nå har flere studier undersøkt tilknytningen mellom genetiske varianter av
dicer
og
drosha
gener og risiko for sykdommer. Lin et al. rapportert at
dicer Hotell og
drosha
haplotyper ble assosiert med den endrede overlevelse og gjentakelse av nyrecellekreft pasient i kaukasiere [25]. Men de genetiske varianter av
dicer Hotell og
drosha
ikke var assosiert med utviklingen av nyrecellekreft [26]. I tillegg Yang et al. også observert lignende resultat av blærekreft hos kaukasiske [27]. Nylig, Qin et al. viste at
dicer Hotell og
drosha
polymorfismer kan endre risikoen for unormal sædparametre og bli assosiert med det kinesiske mannlig infertilitet [28]. Til sammen har vi antatt at disse genetiske varianter av
dicer Hotell og
drosha
er også forbundet med mottakelighet for blærekreft i en kinesisk befolkning.
På bakgrunn av dette postulering, valgte vi syv polymorfismer av
dicer plakater (rs12323635CT, rs13078TA, rs1057035TC, og rs3742330AG) og
drosha plakater (rs2291109AT, rs10719TC, og rs642321CT) for å vurdere sammenhengen mellom genetiske varianter av
dicer Hotell og
drosha
gener og risiko for blærekreft. I denne studien fant vi at
drosha
3’UTR polymorfisme rs10719TC kan øke risikoen for blærekreft i en kinesisk befolkning, som lå i nærheten av en miRNA bindingssete. Videre har vi gjennomført en rekke funksjonelle analyser på
drosha
3’UTR polymorfismer å avsløre sin molekylære mekanismen.
Materialer og metoder
forsøkspersonene
I denne studien inkluderte vi 685 histopathologically bekreftet blære overgangsordning celle carcinoma og 730 kreftfrie kontroller. Inkludert forsøkspersonene ble rekruttert fra First Affiliated Hospital og Huai-An Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, og Jiangsu Province Hospital of tradisjonell kinesisk medisin (TCM) mellom januar 2003 og januar 2010. detaljert metode for å rekruttere forsøkspersonene i studien hadde blitt tidligere beskrevet [29]. Patologisk diagnose for blære svulst scenen ble i henhold til 2002 International Union Against Cancer tumor-noder-metastaser klassifisering og Verdens helseorganisasjon 1973 gradering av urothelial papilloma ble brukt til å definere blærekreft karakter: godt differensiert (grad 1, G1), moderat differensiert (grad 2, G2) eller dårlig differensiert (grad 3, G3). Blærekreftpasienter ble ekskludert, hvis noe hadde tidligere kreft, spredning kreft fra andre opprinnelse, tidligere strålebehandling eller cellegift. De kreftfrie fagene ble rekruttert fra de som søkte helsetjenester i poliklinikker på sykehuset. De kreftfrie kontroller ble matchet av alder (± 5 år) og kjønn til de sakene, som var genetisk relatert til sakene og hadde ingen individuelle historie av kreft inkludert melanom hudkreft. De kreftfrie emner som hadde symptomer på blærekreft, slik som hematuri, ble ekskludert. Vi brukte et kort spørreskjema for å få den demografiske og risikofaktor informasjon fra de inkluderte fag. I denne studien har vi definert noen gang røykere (tidligere og nåværende røykere) basert på røyking tilstand. Emner som røykte daglig i 1 år ble definert som noensinne røykere. Helt røykere som hadde sluttet å røyke for 1 år ble definert som tidligere røykere og de andre som nåværende røykere. Dette case-control studie ble godkjent av Institutional Review Board of Nanjing Medical University. Alle individer signert informert samtykke, og hvert fag donert 5 ml blodprøve for genomisk DNA-ekstraksjon.
SNPs velge og genotyping
I denne studien har vi studert genetiske varianter av
dicer
og
drosha
gener som spiller viktige roller i miRNA biogenesis. Her fokuserte vi på å studere enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) som strekker seg over disse to genene (HapMap data versjons 27), inkludert 2 kb oppstrøms og 2 kb nedstrøms bruker Haploview programvare [30]. Følgende kriterier bør inngå: (i) SNP’er bør være plassert i den 5 «flankerende region, 5» UTR, 3’UTR, og kodende region med aminosyreendringer, (ii) mindre allel frekvens (MAF) 5% i Han-kinesere i Beijing (CHB). Kriteriene ble fire SNPs identifisert i
dicer plakater (rs12323635, rs13078, rs1057035, og rs3742330) og tre SNPs i
drosha plakater (rs2291109, rs10719, og rs642321).
Genomisk DNA ble ekstrahert fra perifere blodlymfocytter i faget. De inkluderte syv SNPs ble genotypet i alle 1415 personer ved MGB TaqMan probe-analysen (7900HT Real Time PCR System, Applied Biosystems, Foster City, USA). Omtrent 10% av prøvene ble tilfeldig valgt ut for gjentatt genotyping for validering, og resultatene var 100% konkordant. Genotype analyse ble utført av to personer uavhengig av hverandre på en blindet måte og kontroller ble inkludert i hver plate for å sikre nøyaktigheten av genotyping. Men flere prøver mislyktes i genotyping skyldtes DNA kvalitet, og vi ville utelukke dem i videre analyser. Tabell 1 forutsatt at hoved informasjon om de valgte syv SNPs.
Gene (tiltredelse no.) Og locus
NCBI rs nei.
Plassering
en
beliggenhet
Base endring
MAF
P
for HWE
c
Genotyping rate (%)
HapMap
b
sak
Controls
dicer plakater (NM_030621) 14q31rs1232363595625711promoterC T0.3330.3760.3780.06798.2rs13078955567473’UTRT A0.0560.0570.0610.13199.1rs1057035955541423’UTRT C0.1110.1120.1100.741100.0rs3742330955533623’UTRA G0.2670.3310.3320.25799.6
DROSHA
(NM_013235) 5p14-p13rs229110931532301promoterA T0.2110.2190.2340.062100.0rs10719314014473’UTRT C0.2330.2820.2430.43799.7rs642321314010033’UTRC T0.4670.4740.5050.655100.0Table 1. Primær informasjon om genotypet SNPs.
ASNP posisjon i NCBI dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP).bMAF fra HapMap databaser (https://www.hapmap.org) .cHWE
P
verdi i kontrollgruppen. CSV Last ned CSV
Bioinformatikk analyse av
drosha
3’UTR
Basert på bioinformatikk analyse, spådde vi at HSA-MIR-27a /b kan binde med 3’UTR regionen
drosha
med fire vanlige nettsider (Target Scan: https://www.targetscan.org/~~number=plural, Miranda: https://www.microrna.org/~~number=plural, Microcosm: https://www.ebi.ac .uk /Enright-srv /mikrokosmos /cgi-bin /mål /v5 /genome.pl, og pita: https://genie.weizmann.ac.il/~~number=plural) (figur 1A). Vi vurderte at kombinasjonen av disse metodene vil sterkt redusere muligheten for falske positive.
(A) drosha 3’UTR ble spådd en bindingssetet for HSA-MIR-27a /b. Sekvensen av HSA-MIR-27a og HSA-Mir-27b bare hadde én base forskjell (understreket). Scanning omtrent ± 100bp områder av bindingssetet, har vi funnet at bare rs10719T C ble plassert i denne regionen. Forutsi effekten av allel variasjon på rs10719 på HSA-MIR-27a /b anerkjennelse og konstruere av pGL3-drosha 3’UTR-T /C inneholder Renilla luciferase genet og full-lengde 3’UTR av drosha gen med ulike alleler av rs10719 ( pil: T C substitusjon). (B, C) luciferase reporter-analyser for å måle rs10719T eller C-allelet forskjell i nærvær eller innblanding av HSA-MIR-27a /b. I (B), T24 celler seeded på 24-brønners plater ble midlertidig kotransfektert med konstruksjoner og HSA-MIR-27a /b ligner eller stabil negativ kontroll (NC). I (C), J82 celler seeded på 24-brønners plater ble midlertidig kotransfektert med konstruksjoner og HSA-MIR-27a /b-hemmere eller inhibitor NC. Resultatene er vist som relativ luciferaseaktivitet versus NC. Data var fra tre uavhengige transfeksjon eksperimenter.
**
P
0,05.
Sanntids kvantitativ revers transkripsjon-PCR (RT-PCR) assay
For å evaluere den endogene uttrykk nivå av HSA-MIR-27a /b, fire blære kreftcellelinjer (EJ, T24, J82, 5637) og sådd ut på 20 cm
2 plater ble underkastet ekstraksjon av totalt RNA isolert fra celler ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen, CA, USA). Tabell S1 i File S1 viste primere informasjon om HSA-MIR-27a /b og U6. Revers transkriptase reaksjonene (10 ul) inneholdt 2 pl total-RNA (500 ng /mL), 1 pl 10 x AMV RT-buffer, 10 pmol hver av dNTP (Toyobo, Tsuruga, Japan), 0,75 ul antisense-løkker primerblandingen, 0,25 U /ul RNase Inhibitor (Toyobo, Tsuruga, Japan), 1U /ul AMV revers transkriptase. Blandingen ble inkubert ved 16 ° C i 15 min, 42 ° C i 60 min, og 85 ° C i 5 minutter. Deretter ble Applied Biosystems 7900HT Real Time PCR System som brukes til å utføre sanntids kvantifisering PCR (ABI, CA, USA) basert på SYBR-grønn-metoden (Toyobo, Tsuruga, Japan). Alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer. Brett endringer ble normalisert til uttrykket nivåer av U6
For påvisning av sammenhengen mellom
drosha
mRNA nivåer og rs10719 T . C polymorfisme
in vivo
, totalt av 61 blæren tumorvev med forskjellige genotyper (32 til TT, 24 for TC, og 5 for CC genotyper) ble utsatt for ekstraksjon av total-RNA ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, CA, USA). Blære tumorvev ble bevart i flytende nitrogen etter å ha blitt fjernet fra kroppen. Det totale RNA ble evaluert ved begge revers transkriptase reaksjons og sanntids-kvantitativ PCR basert på den SYBR-grønn-metoden (Toyobo, Tsuruga, Japan). CDNA ble anvendt for amplifikasjon av
drosha
-gen og et endogent gen kontroll
GAPDH
. Den primere informasjon om
drosha Hotell og
GAPDH
gener ble inkludert i Tabell 1. Fold endringer ble normalisert ved uttrykket nivåer av
GAPDH Hotell og hver analyse ble utført i tre eksemplarer .
drosha
3’UTR inneholder rs10719TC reporter genkonstruksjoner og luciferaserapportørplasmid analyser
for å konstruere luciferase reporter plasmider av
drosha
3’UTR,
drosha
3’UTR fragmenter (937bp) bærer den store rs10719T allelet ble forsterket av PCR. Primerne var 5′-ACCTTGGTACCCCAGATGAGACTGAAGACATC-3 «(fremover) og 5′-ACCTTCTCGAGGCACTCACTATATATTTGCTG-3′ (bakover). PCR-produktene ble ekstrahert og separert ved agarose gel, som ble klonet med TA-kloningssettet (Invitrogen, CA, USA). I tillegg ble fragmentet inneholdende mindre rs10719C allel utført ved bruk av de følgende primere: 5»-TAGTTTTCCTGCAGACAATGAACGAAGTGTGC-3 «(fremover) og 5′-TTTATTTCAATGAGCACACTTCGTTCATTGTC-3» (revers). Til slutt ble det amplifiserte fragment som bærer T eller C-allelet innsatt nedstrøms for luciferasegenet i en pGL3-promoter plasmid og deretter ble plasmid inneholdende T eller C-allelet ble gjennomført, som ble bekreftet ved sekvensering.
For luciferase reporter analysen, T24 og J82 celler ble plassert i 24-brønners plater (1 × 10
5 celler per brønn) og deretter transfektert med pGL3-
drosha
3’UTR-T eller pGL3-
drosha
3’UTR-C og PRL-SV40 (50: 1). De etterligner og hemmere av HSA-MIR-27a /b og deres negative kontroller (GenePharma, Shanghai, Kina) ble transfektert med reporter plasmider ved en endelig konsentrasjon på 20nmol /mikroliter. Førti-åtte timer etter transfeksjon i T24 og J82-celler, ble luciferase-aktivitet i lysater målt med et dual-luciferase reporter Assay System (Promega, WI, USA) og normalisert mot aktiviteten av PRL-SV40. Analyser ble etterfulgt av produsentens forslag. Uavhengige tredoble eksperimenter ble utført for hver plasmid konstruksjon.
Statistisk analyse
Hardy-Weinberg likevekt av genotype fordelingen mellom kontrollene ble påført ved hjelp av en godhet-of-fit χ
2 test. Frekvens distribusjoner av utvalgte demografiske variabler mellom sakene og kontroller ble testet ved hjelp av χ
2 test. Genotype-spesifikke odds ratio (ORS) og deres 95% konfidensintervall (CIS) ble beregnet ved ubetinget univariate og multivariate logistiske regresjonsanalyser. Den multivariate justering inkludert alder, kjønn og røykestatus (aldri og aldri røyke). I tillegg ble Kruskal-Wallis enveis ANOVA tester brukes for å analysere resultatene av
drosha
mRNA uttrykk
in vivo
. I denne studien ble den relative luciferasereportergenet uttrykk for T eller C-allel beregnet separat. Student «s
t
test ble anvendt for å evaluere forskjellene i ekspresjonsnivåer av luciferase-rapportørgenet blant undergrupper. Alle testene var tosidig med SAS (versjon 9.1, SAS Institute, Inc, Cary, NC, USA) og
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Association studie mellom polymorfismer av
dicer Hotell og
drosha Hotell og blærekreft risiko
egenskapene til 685 blæren overgangscellekreft pasienter og 730 kontroller er oppsummert i tabell 2. Heri vi ikke observere statistisk forskjell i fordelingen av alder (
P
= 0,144) og kjønn (
P
= 0,825) mellom pasienter og kontroller. Men det var mer noensinne røykere (55,6%) blant pasientene flere enn blant kontrollene (38,4%), og denne forskjellen var statistisk signifikant (
P
0,001). Disse variablene ble justert for den påfølgende multivariate logistisk regresjonsanalyse. Av de 685 tilfellene var det 315 svulst grad 1 (46,0%), 261 tumor grad 2 (38,1%) og 109 tumor grad 3 (15,9%) pasienter. I tillegg 435 (63,5%) hadde overflatiske svulster og resterende 250 (36,5%) hadde invasive svulster.
Variabler
Cases (n = 685)
Controls (n = 730)
P
en
N
%
N
%
Alder ≤ 6532948.037951.90.144 6535652.035148.1Sex Male55480.958780.40.825 Female13119.114319.6Smoking status Never30444.445061.6 0.001 Ever38155.628038.4 Former17225.1729.9 Current20930.520828.5Tumor klasse G131546.0 G226138.1 G310915.9Tumor scenen Overfladisk (PT
a-PT
1) 43563,5 Invasive (PT
2-PT
4 ) 25036.5Table 2. frekvens distribusjoner av utvalgte variabler mellom blæren krefttilfeller og kreftfrie kontroller.
atwo ensidig χ
2-test for frekvensfordeling av utvalgte variabler mellom blære krefttilfeller og kreftfrie kontroller CSV Last ned CSV
de sju SNPs genotypefrekvensene blant kontrollen var i samsvar med de Hardy-Weinberg likevekter (
P
0,05; Tabell 1). Som vist i tabell 3, observerte vi at personer med
drosha
3’UTR rs10719C allel (TC og CC genotyper) hadde en 1,24 ganger økt risiko for blærekreft (Justert OR = 1,25, 95% KI = 1,01 til 1,55,
P
= 0,041) sammenlignet med rs10719TT genotype. Samtidig observerte vi at fordelingen av rs10719TC genotyper mellom sakene og kontrollene viste signifikant forskjell (
P
= 0,017). Vi har imidlertid ikke observere noen signifikante forskjeller i genotype fordeling av
dicer
rs12323635CT, rs13078TA, rs1057035TC, rs3742330AG og
drosha
rs2291109AT, rs642321CT polymorfismer mellom sakene og kontroller (alle
P
0,05, tabell 3). Vi evaluerte videre effekten av inkluderte syv polymorfismer om blærekreft risiko ved stratifisering etter kjønn og røykestatus. Som vist i tabell S2 i File S1, fant vi at rs10719TC polymorfisme kan øke risikoen for blærekreft blant mannlige pasienter (Justert OR = 1,34, 95% CI = 1,05 til 1,70,
P
= 0,018), og noen gang røykere (justert OR = 1,56, 95% CI = 01.14 til 02.14,
P
= 0,006).
genotyper
Cases Book Controls
Crude OR (95% KI )
Justert OR (95% CI)
a
P
a
P
b
N
%
N
%
DICER
rs12323635CT680710CC26639.128640.31.00 (Referanse) 1,00 (referanse) 0.887CT32147.231143.81.11 (0.88-1.40) 1,09 (0.86-1.37) 0.485TT9313.711315.90.89 (0.64-1.22) 0,88 (0.63-1.22) 0.441CT /TT41460.942459.71.05 ( 0.85-1.20) 1,03 (0.83-1.28) 0.793rs13078TA679723TT60388.864088.31.00 (referanse) 1,00 (referanse) 0.640AT7511.17810.81.02 (0.73-1.43) 0,99 (0.70-1.39) 0.937AA10.250.70.21 (0,03 til 1,82 ) 0,30 (0,03 til 2,57) 0.271AT /AA7611.28311.50.97 (0.70-1.35) 0,95 (0.68-1.33) 0.768rs1057035TC685730TT54880.057779.01.00 (referanse) 1,00 (referanse) 0.857TC12017.514519.90.87 (0,67 til 1,14) 0,88 (0,67 til 1,16) 0.371CC172.581.102.34 (0.96-5.23) 2,36 (1.00-5.59) 0.051TC /CC13720.015321.00.94 (0.73-1.22) 0,96 (0.74-1.25) 0.753rs3742330AG683727AA30244.233145.51.00 (referanse ) 1,00 (referanse) 0.942AG31045.430942.51.10 (0.88-1.37) 1,09 (0.87-1.37) 0.437GG7110.48712.00.90 (0.63-1.27) 0,88 (0.61-1.25) 0.464AG /GG38155.839654.51.06 (0.86- 1,30) 1,05 (0,84 til 1,30) 0,686
drosha
rs2291109AT685730AA42161.541957.41.00 (referanse) 1,00 (referanse) 0.332AT22833.328038.40.81 (0.65-1.01) 0,79 (0.63-0.99) 0.044TT365.3314.31. 16 (0,70 til 1,90) 1,20 (0,72 til 2,00) 0.482AT /TT26438.531142.60.85 (0.68-1.05) 0,83 (0.67-1.03) 0.098rs10719TC684727TT35251.541356.81.00 (referanse) 1,00 (referanse) 0.017TC27840.627537.81.19 (0.95-1.48) 1,20 (0.96-1.50) 0.116CC547.9395.41.63 (1.05-2.51) 1,61 (1.03-2.50) 0.036TC /CC33248.531443.21.24 (1.01-1.53) 1,25 (1.01-1.55) 0.041rs642321CT685730CC19728. 817624.11.00 (referanse) 1,00 (referanse) 0.107CT32647.637150.80.79 (0.61-1.01) 0,79 (0.61-1.02) 0.075TT16223.718325.10.79 (0.59-1.06) 0,78 (0.58-1.06) 0.112CT /TT48871.255475.90 0,79 (0,62 til 1,00) 0,79 (0.62-1.01) 0.056Table 3. genotypefrekvensene av
dicer
og
drosha
SNPs blant blærekreft tilfeller og kontroller og deres tilknytning til blærekreft risiko .
aAdjusted for alder, kjønn og røykestatus (aldri og aldri) i logistisk regresjon model.bTwo ensidig chi-kvadrat test for distribusjon av allel frekvens (mindre allel versus større allel). CSV Last ned CSV
drosha
3’UTR rs10719TC påvirker
drosha
uttrykk ved å regulere HSA-Mir-27b bindende
For å kunne utforske mulig mekanisme for
drosha
3’UTR i blærekreft risiko, utførte vi de funksjonelle analyser. Basert på bioinformatikk analyse ble
drosha
3’UTR spådd en bindingssetet for HSA-MIR-27a /b (figur 1A). Her viste vi at rs10719TC lå 46bp nedstrøms av HSA-MIR-27a /b bindingssete i
drosha
3’UTR.
Som vist i figur S1 i File S1, real -time kvantitativ RT-PCR-analyse antydet at endogene uttrykk nivåer av HSA-MIR-27a /b i J82 cellelinjen var mer betydelig høyere enn andre celler (T24, EJ, og 5637) (
P
0,001 ). Her, valgte vi J82 og T24 cellelinjer i den videre luciferase-assay. Deretter brukte vi plasmidene for transient kotransfeksjonen med T24 celler [stabil negativ kontroll (NC) miRNA: stabil NC eller HSA-MIR-27a /b ligner] og J82 celler (hemmer NC eller HSA-MIR-27a /b -inhibitor). Som vist i Figur 1B (T24-celler), HSA-MIR-27a /b trykkes luciferase-ekspresjon i nærvær av rs10719T allele, sammenligning med NC (
P
0,05), men ikke den rs10719C allelet (
P
0,05). I tillegg fant vi også at hemming av HSA-MIR-27a /b uttrykk kan øke luciferaseekspresjon effektivt for rs10719T inneholder plasmid snarere enn rs10719C inneholder plasmid i J82 celler (
P
0,05; figur 1C). Men vi fant også at en betydelig reduksjon i luciferase uttrykk, når vi lagt HSA-MIR-27a inhibitor til allel C i J82 celler. Den tilsvarende resultat ikke være observert i å legge HSA-Mir-27b inhibitor til allel C i J82 celler. Kanskje, HSA-MIR-27a ikke direkte påvirke drosha luciferase uttrykk. Våre data antydet at rs10719 T til C substitusjon fungerer som et tap-av-funksjon mutasjon og vil påvirke drosha luciferaseekspresjon av HSA-Mir-27b mål.
I denne studien har vi også utført RT-PCR-analyse for å undersøke om HSA-Mir-27b påvirket drosha uttrykk ved nedverdigende mRNA eller undertrykke mRNA post-translasjonell oversettelse (figur S1 i File S1). Totalt 61 blære tumorvev med ulike genotyper av
drosha
rs10719TC polymorfisme ble brukt for å vurdere uttrykk for
drosha
mRNA. Ingen signifikant forskjell nivåer av
drosha
mRNA blant personer med TT, TC og CC genotyper ble observert (
P
0,05). Til sammen kan HSA-Mir-27b påvirke drosha uttrykk ved å regulere protein oversettelse.
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi sammenhengen mellom syv polymorfismer av
dicer
og
drosha
gener og blærekreft risiko i en kinesisk befolkning, og funnet ut at rs10719TC polymorfisme ved siden av HSA-Mir-27b bindingssetet i
drosha
3’UTR var forbundet med betydelig økt risiko for blærekreft. Funksjonelle analyser viste at
drosha
rs10719 T til C substitusjon kan redusere bindingsaktiviteten av HSA-MIR-27b med
drosha
3’UTR.
drosha er medlem av RNase III super og er en viktig nuklease som utfører det første trinnet i miRNA behandling ved å kutte pri-miRNA til pre-miRNA [31]. RNA interferens av drosha resulterte i opphopning av pri-miRNA og reduksjon av pre-miRNA og modne RNA [31]. Opp til nå, har flere grupper studert rollen som
drosha
i kreft [32,33]. Det har rapportert at
drosha
rs644236 TT genotype og rs7737174 AA genotype var forbundet med risiko for brystkreft hos postmenopausale kvinner [32].
drosha
3’UTR rs10719 er i sterk koblingsulikevekt med rs644236 basert på ett tusen genomer data (r
2 = 0,88) [33]. I den foreliggende sammenheng studien fant vi at
drosha
3’UTR rs10719TC polymorfisme var assosiert med risiko for blærekreft. Stratifisert analyse viste at rs10719TC /CC genotyper i betydelig grad kan øke risikoen for blærekreft, spesielt blant menn og røykere. En mulig forklaring er at røyking er etablert som den viktigste risikofaktoren i utviklingen av blærekreft, som inneholder hundrevis av kjemikalier, for eksempel polysykliske aromatiske hydrokarboner [34,35]. Således kan noen gang røykere være tilbøyelige til å være kreft. En annen grunn kan være at sammenlignet med kvinner, de mannlige folk er mer sannsynlig å utsettes for akkumulerte miljørisikofaktorer som er involvert i etiologien av blærekreft som sigarettrøyking, yrkesmessig eksponering (dvs. dyestuff produksjon, lær arbeid). I tillegg har vi den relativt lille størrelsen på utvalget av kvinnelige mennesker. Derfor kan vi ikke påvise signifikant sammenheng i kvinnelige mennesker. Weng et al. også foreslått at rs10719TC polymorfisme var relatert med ondartet perifere nerve slire svulst risiko, som støttet våre funn [33]. Over ekspresjon av drosha ble vist å bevirke celleproliferasjon og predikerte dårlig prognose i spiserørskreft [36], eggstokk-kreft [37], brystkreft [38], og livmorhalskreft [39]. Forrige studien hadde også avdekket at over uttrykk for drosha kan fremme celleproliferasjon og hemme celle apoptose i blærekreft [24]. Derfor hypotese vi at
drosha
3’UTR rs10719C allel kan øke risikoen for blærekreft, hovedsakelig gjennom å regulere uttrykket av drosha.
Det er foreslått at noen av 3’UTR polymorfismer kan være i miRNA bindingssetet eller i nærheten av bindingssetet og kan forstyrre miRNA funksjon som fører til differensial-genekspresjon for å påvirke utviklingen av kreft [19,20]. Våre luciferasepreparater rapporterte gen-analyser viste at
drosha
rs10719 T til C substitusjon forstyrret et bindingssete for HSA-MIR-27b, som resulterer i økte nivåer av
drosha
3’UTR luciferase uttrykk. Således blir C-allelet forbundet med en økt risiko for blærekreft, gjennom en eventuell øket drosha uttrykk, som var sammenfallende med tidligere funn [24]. Videre ingen signifikant forskjell i
drosha
mRNA uttrykk nivå mellom ulike rs10719TC genotyper ble observert i blæren tumorvev ved hjelp av RT-PCR-analyse. Disse resultatene tyder på at SNP ikke påvirker mRNA-ekspresjon er imidlertid gitt at miRNA binding til mRNA ikke alltid fører til transkripsjon spalting, og noen ganger er det fører til oversettelse undertrykkelse, er det mulig at SNP fører til en endring i drosha protein. Vi har imidlertid ikke teste dette i vår studie, og derfor fortsatt en mulighet, men ikke bevist. Disse data antydet at HSA-Mir-27b kan påvirke drosha uttrykk ved å regulere protein oversettelse. Det var verdt å merke seg at våre funksjonelle funnene var i overensstemmelse med resultatene av en case-control studie.
I denne studien, HSA-MIR-27b ble først rapportert å regulere uttrykket av
drosha
i blærekreft.
