Abstract
Squamous celle lungekreft (SCC) og adenokarsinom er
de vanligste
histologiske subtyper av ikke- småcellet lungekreft (NSCLC), og har tradisjonelt blitt forvaltet i klinikken som en enhet. Økende bevis, men illustrerer det biologiske mangfoldet i disse to histologiske undergrupper av lungekreft, og støtter behovet for å forbedre vår forståelse av det molekylære grunnlaget utover de forskjellige fenotyper hvis vi tar sikte på å utvikle mer spesifikke og individualisert målrettet terapi. Hensikten med denne studien var å identifisere mikroRNA (miRNA) -avhengig transkripsjonen regulering forskjeller mellom SCC og adenokarsinom histologisk lungekreft subtyper. I dette arbeidet, sammen miRNA (667 mirnas av TaqMan Low Density Arrays (TLDA)) og mRNA-profilering (Whole Genome 44 K rekke G112A, Agilent) ble utført i tumorprøver av 44 NSCLC pasienter. Ni mirnas og 56 mRNA ble funnet å være forskjellig uttrykt i SCC versus adenokarsinom prøver. Elleve av disse 56 mRNA ble spådd som mål for de mirnas identifisert til å være annerledes uttrykt i disse to histologiske forhold. Av dem, 6 mirnas (MIR-149, MIR-205, MIR-375, MIR-378, MIR-422A og MIR-708) og 9 mål gener (CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1 ) ble validert av kvantitativ PCR i en uavhengig kohort av 41 lungekreftpasienter. Videre er omvendt korrelasjon mellom mRNA og microRNAs ekspresjon ble også bekreftet. Disse resultatene tyder på miRNA-avhengig transkripsjonsregulering forskjeller spiller en viktig rolle i å bestemme viktige kjennetegnene ved NSCLC, og kan gi nye biomarkører for personlige behandlingsstrategier
Citation. Molina-Pinelo S, Gutiérrez G, Pastor MD, Hergueta M, Moreno-Bueno G, García-Carbonero R, et al. (2014) mikroRNA-Dependent Regulering av transkripsjon i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 9 (3): e90524. doi: 10,1371 /journal.pone.0090524
Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Frankrike
mottatt: 29 august 2013; Godkjent: 03.02.2014; Publisert: 13 mars 2014
Copyright: © 2014 Molina-Pinelo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. LPA er finansiert av Fondo de INVESTIGACION Sanitaria (PI081156, PI1102688 og R12 /0036/0028), Proyecto de Excelencia de la Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucía (P08-CVI-04090), og Roche Fellowship i 75 år, Spania. SMP er finansiert av Fondo de INVESTIGACION Sanitaria (CD1100153), Fundación Científica de la Asociación Española Contra el Cancer, Consejería de Salud, Servicio Andaluz de Salud (PI-0224/2009 og PI-0046/2012), og Fundación Mutua Madrileña (2009 ). MDP er finansiert av Fondo de INVESTIGACION Sanitaria (CD0900148). RGC er finansiert av Fondo de INVESTIGACION Sanitaria (PI10 /02164). GMB er finansiert av SAF2010-20175 og Madrid Regional Government (S2010 /BMD-2303). AC lab ble støttet med tilskudd til fra det spanske departementet for økonomi og konkurranseevnen, ISCIII (PI12 /00137, RTICC: RD12 /0036/0028), Consejeria de Ciencia e Innovacion (CTS-6844) og Consejeria de Salud av Junta de Andalucia (PI-0135-2010 og PI-0306-2012). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den primære årsaken til kreftdød på verdensbasis, som er ansvarlig for en million dødsfall årlig [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for 80% av alle lungesvulster, og inneholder flere histologiske undergrupper som stor celle karsinom (LCC), plateepitelkarsinom (SCC), og adenokarsinom. SCC og adenokarsinom er
de vanligste
typer NSCLC, sto for 25% og 40% av alle tilfeller, henholdsvis [2], [3]. SCC stammer fra dysplastiske flerlags epitel i
sentrale
luftveiene, mens adenokarsinom stammer fortrinnsvis fra forløper celler av mono- eller bilaget overflaten epitel av lungen periferien [4].
NSCLC , uavhengig av histologisk subtype har
tradisjonelt blitt behandlet i klinikken som en enkel homogen enhet. Men viser økende bevis for det store biologiske mangfoldet i denne sykdommen, som gradvis fører til mer spesifikke diagnostiske og terapeutiske strategier avhengig av histologisk subtype bekymret. Faktisk fremskritt i målrettet kreftbehandling lunge nå krever nøyaktig klassifisering av NSCLC [5]. For eksempel EGFR mutasjoner er mer utbredt i pasienter med lunge adenokarsinom, og tilstedeværelsen av disse mutasjoner er assosiert med sensitiviteten til EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer [6]. Tilsvarende ALK traslocations, til stede i bare 4% av adenokarsinomer, er prediktive for en høy følsomhet for ALK-rettet behandling som crizotinib. Som kontrast er FGFR1 forsterkning oftere observert i SCC, og blir nå ansett som en potensielt praktisk mål i kliniske studier med FGFr hemmere [7]. Derfor er nødvendig for utvikling av spesifikke diagnostiske metoder og utformingen av mer adekvate, individualiserte og effektive terapeutiske strategier en større kunnskap om de molekylære mekanismene som er involvert i Genesis, progresjon og spredning av ulike undergrupper av NSCLC.
De store fremskritt i genomisk teknologi har generert mange kandidat biomarkører med potensial klinisk verdi i NSCLC. MicroRNAs, som post-transcriptional modulatorer, er sentrale aktører i reguleringen av mange biologiske prosesser. Dysregulering av deres fysiologiske roller bidrar til mange patologiske tilstander, herunder initiering og progresjon av kreft. I denne sammenheng har en rekke studier har vurdert potensielle rolle miRNA signaturer for å diskriminere histologiske undergrupper eller å forutsi tilbakefall eller overlevelse av NSCLC pasienter [8], [9], [10], [11], [12], [ ,,,0],13], [14], og miRNA profilering har vært foreslått som en svært pålitelig strategi for klassifisering NSCLCs [11], [15], [16]. Likevel, den høye kompleksiteten av transkriptomet regulering kompliserer full forståelse av gennettverk involvert i disse prosessene.
For å løse dette problemet, er målet med denne studien var å vurdere miRNA-avhengig transkripsjonsregulering forskjeller mellom SCC og adenokarsinom histologiske lungekreft subtyper. Med dette formålet, miRNA og mRNA paret uttrykk profiler ble analysert hos NSCLC tumorprøver, og de potensielle interaksjoner mellom dem ble utforsket. I denne studien har vi identifisert og validert en undergruppe av deregulerte miRNAs og målgener som er i stand til å definere forskjellige molekylære funksjoner i disse to store histologiske subtyper av NSCLC.
Materialer og metoder
Pasienter og vevsprøver
Pasienter inkludert i denne studien ble pålagt å ha histologisk bekreftet tidlig SCC eller adenokarsinom NSCLC. Tumorprøver fra 85 pasienter ble prospektivt samlet opp i løpet av den kirurgiske prosedyren og umiddelbart hurtigfrosset ved -80 ° C inntil videre anvendelse. Tilstøtende ikke-tumor lungevev ble også samlet inn fra pasienter som inngår i valideringen kohort. Studien protokollen ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene i de deltakende sentre [Hospital Universitario Doce de Octubre (Madrid) og Hospital Universitario Virgen del Rocío (Sevilla)] og alle pasientene gitt skriftlig informert samtykke før studiestart. Kliniske og patologisk data ble hentet fra medisinske poster og sentralt vurdering for hensikten med denne studien. Studiepopulasjonen ble delt i en trenings kohort (N = 44) som ble brukt for profilen utvikling og en uavhengig validering kohort (N = 41). Hovedtrekkene i studiepopulasjonen er oppsummert i tabell 1 og 2.
bilder
Microarray genuttrykk profiler
microarray eksperimenter ble utført ved hjelp av menneskelig Whole Genome 44 K rekke G4112A (Agilent Technologies , Wilmington, DE). RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol (Invitrogen) og RNAesy Extraction Kit (Qiagen, Tyskland) som angitt av produsentene. RNA ble merket og rekke hybridiserte med lav RNA Linear Amplification Kit og In Situ Hybridisering Kit Plus (Agilent Technologies, Wilmington, DE) hhv. Etter hybridisering og vasking, ble platene skannet i en Axon GenePix Scanner (Axon Instruments Inc., Union City, CA) og analysert ved hjelp Feature Extraction programvare 6.1.1 (Agilent Technologies, Wilmington, DE). RNA fra tumorprøver ble merket med Cy5-dUTP, og hybridisert mot en lungekreft henvisning basseng (merket med med Cy3-dUTP) som består av primærtumor vev fra pasienter med forskjellige histologiske subtyper av lungekreft. Som kontroll ble ti ekstra hybridizations utført ved hjelp av gjensidige fluorochrome merking.
For å oppdage differensielt uttrykte gener mellom de to histologiske subtyper, to typer analyser ble foretatt med MIDAW verktøy [17]. Først ble en t-test utført med falske funnrate (FDR) kontroll beregnes ved hjelp av enkeltvise Bonferroni prosedyren. Gener som passerte t-test filter ble underkastet en andre filter. Bare gener som viser en logaritmiske forholdet verdi lavere enn -0,3 eller større enn 0,3 (tilsvarende en 2-gangers forandring) ble valgt som uttrykt forskjellig. For det andre, diskriminant en analyse for identifikasjon av settet av beste markørgener ble utført basert på det Prediksjon Analyse av Microarray (PAM) algoritme. Microarray rå datatabeller er blitt deponert i Gene Expression Omnibus under tiltredelse antall GSE42998.
mikroRNA QRT-PCR-analyse
Total RNA, som inneholder små RNA, ble hentet fra svulsten vevsprøver av Mirvana miRNA isolasjon kit (Ambion, Austin, TX, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Det totale RNA Utbyttet ble bestemt ved anvendelse av et Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Tech, DE, USA). Agilent 2100 Bioanalyzer ble benyttet for å bestemme mengden og kvaliteten på RNA prøver (Agilent, Palo Alto, California). Moden menneskelige miRNA uttrykket ble påvist og kvantifisert ved hjelp av TaqMan Low Density Arrays (TLDA) basert på Applied Biosystems «7900 HT Micro Fluidic kort (Applied Biosystems, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. The Human mikroRNA kort sett v2.0 array (katalognummer 4400238) er en to-kort sett som inneholder totalt 384 TAQMAN mikroRNA Analyser per kort for nøyaktig kvantifisering av 667 menneske microRNAs, alle katalogisert i miRBase database. TLDAs ble utført i en to-trinns prosess. I korthet, i løpet av det første trinnet, 450 ng av total RNA ble revers transkribert ved hjelp av megaplex RT-primere, og TaqMan miRNA revers transkripsjon sett i et totalt volum på 7,5 pl. 7,5 pl reaksjonsblandinger ble inkubert i en G-Storm Thermal Cycler (Gene Technologies, Essex, UK) i 2 min ved 16 ° C, 1 minutt ved 42 ° C, og 1 min ved 50 ° C i løpet av 40 cykler, holdt i 5 min ved 85 ° C, og deretter holdt ved 4 ° C. I det andre trinnet, ble 6 mL av cDNA prøven og TaqMan Universal PCR Master Mix lagt i fyll portene på TLDA microfluidic kort. Kortet ble kort sentrifugert i 1 min ved 331 g for å fordele prøvene i flere brønner som er koblet til fylleportene og deretter forseglet for å forhindre brønn-til-brønn forurensning. Reaksjonene ble inkubert i en 384 brønners plate ved 50 ° C i 2 sekunder og 94,5 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med 30 sek ved 97 ° C og 1 min ved 59 ° C. Til slutt ble kort behandlet og analysert på en ABIPrism 7900 HT Sequence Detection System. TLDA rå datatabeller er blitt deponert i Gene Expression Omnibus under tiltredelse antall GSE43000. Uttrykk for målet miRNAs ble normalisert til uttrykk av RNU48. En ikke-human miRNA, ble anvendt i hvert eksperiment som en negativ kontroll. Cycle terskel (CT) verdiene ble beregnet ved hjelp av SDS-programvaren v.2.3 bruke automatiske baseline innstillinger og en terskel på 0,2. Relativ kvantifisering av miRNA ekspresjon ble beregnet ved 2
-ΔCt metode (Applied Biosystems brukerbulletin nr. 2 (P /N 4.303.859)). Bare miRNA påvises i minst 80% av prøvene ble ansett for evaluering. Betydningen av miRNA uttrykk forskjeller observert mellom de to histolofical undergrupper (adenokarsinom og SCC) ble vurdert av t-test.
mRNA og miRNA Expression korrelasjon Assessment
For å vurdere potensialet sammenhengen mellom forskjellig uttrykt mRNA og miRNA observert i vår studie, vi søkte på transkripsjons målene for de identifiserte mirnas i tre nett databaser for miRNA mål prediksjon: Miranda [18], slipper TargetScan 6.0 [19], og miRWalk [20]. Antatte målgener som passet med de som finnes for å bli feilregulert i vår pasientpopulasjon ble valgt for videre validering av qPCR.
Validering av Microarray genuttrykk profiler av qPCR
Eleven differensielt uttrykte gener blant de to studieforhold (SCC og adenokarsinom NSCLC), identifisert som mulige mål for flere dis-regulerte mirnas, ble valgt ut for videre validering av qPCR i den opprinnelige trening kohort og deretter i en uavhengig validering kohort. RNA ble revers transkribert til cDNA med High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). I korte trekk ble enkeltkjedet cDNA syntetisert fra 1 ug total RNA i 10 ul reaksjonsvolum, i henhold til produsentens protokoll. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 25 ° C i 10 minutter etterfulgt av 120 minutter ved 37 ° C og inaktivering ved 85 ° C i 5 minutter. Den TaqMan Gene Expression analyse system (Applied Biosystems) ble brukt for kvantifisering transkripsjons nivåer av utvalgte gener (
CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1, DMRT2, DSC3 Hotell og
KRT6A ).
Tre endogene kontrollgener (
B2M
,
ACTB Hotell og
GAPDH
) og en nei-mal-kontroll (NTC) ble også kjørt for hver RNA prøve. Vi valgte
B2M
for normalisering på tvers av ulike gener som dette genet viste mest relativt konstant uttrykk på tvers av ulike vevsprøver (data ikke vist). Genekspresjonen for hvert gen ble bestemt ved anvendelse av median ekspresjonsnivået av de tre tekniske replikater. PCR-reaksjoner ble utført på et Applied Biosystems 7900HT Sequence Detection system i 10 ul volumer ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min. Ct-verdier ble oppnådd med SDS programvaren v.2.3 (Applied Biosystems). Relativ kvantifisering av mRNA uttrykk ble beregnet av 2
-ΔCt metode (Applied Biosystems bruker bulletin nr. 2 (P /N 4303859)).
Validering av miRNA TLDA Expression Profiler av qPCR
uttrykk av ni utvalgte mirnas (MIR-149, MIR-205, MIR-375, MIR-378, MIR-422A, MIR-483-5p, MIR-494, MIR-601 og MIR-708) ble vurdert i uavhengig validering kohort av de spesifikke TaqMan mikroRNA analyser i henhold til produsentens instruksjoner (Applied Biosystems). I korthet, 2 ng /mL av total RNA ble omdannet til cDNA ved revers transkriptase reaksjon som ble utført ved sekvensiell inkubasjon ved 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 minutter og 85 ° C i 5 minutter. PCR reaksjonsblanding (10 mL) inneholdt 0,66 mL av RT produkt, 5 mL av TaqMan 2X Universal PCR Master Mix og 0,5 mL av passende TaqMan mikroRNA-analyse (20X) som inneholder primere og probe for miRNA av interesse (Applied Biosystems). Blandingen ble først inkubert ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 60 sekunder. MikroRNA uttrykk ble kvantifisert ved sammenlignende 2
-ΔΔCt metode, normal Ct verdier til RNU48. I valideringen kohort, tumor uttrykk verdiene var i tillegg normalisert til uttrykk verdier sammen tilstøtende normalt lungevev.
3′-UTR Reporter analyse for Mir Target Validering
Bekreftelse på MIR-149-binding til 3′-UTR av ABCC3 og MIR-378 og MIR-422-binding til 3′-UTR av TMEM45B. HEK 293 celler på 80% konfluens ble ko-transfektert med luciferase reporter plasmider som bærer hele 3′-UTR av det ønskede genet (Bryter Genomics) sammen med 100 nM av hver MIR-etterligne eller miRNA kontroll (Sigma). DharmaFECT Duo (Thermo Scientific) ble brukt som transfeksjon reagens i
Opti-MEM plakater (Life Technologies). Luminescence ble analysert 24 timer senere ved hjelp av lysbryter assayreagenser (Bryter Genomics) i henhold til produsentens instruksjoner. Knockdown ble vurdert ved å beregne luciferasepreparater signalforhold for spesifikke miRNA /ikke-måls kontroll, bruker tom reporter vektor som kontroll for ikke-spesifikke effekter. Hvert forsøk ble utført in triplo. t-test ble utført for brønner fra flere eksperimenter, og vi sammenlignet ligne-transfektert celler med en etterligner kontroll for hvert gen vektor.
Diagnose Resultater Vurdering av utvalgte gener
Diagnostiske ytelse parametere ble beregnet for utvalgte gener i 2×2-krysstabeller. Konfidensintervall for disse parametrene ble beregnet med Pearson metode basert på F-fordelingen. Som sensitivitet, spesifisitet, positiv prediktiv verdi (PPV) og negativ prediktiv verdi (NPV) er statistiske tiltak av ytelsen til en binær klassifisering test, ble genuttrykk verdiene konvertert til binære variabler med median uttrykk verdi som referanseverdi (høy kontra lav uttrykk). Disse parametrene ble beregnet for hver validert miRNA /target mRNA par. Den samtidige forekomsten av høy miRNA uttrykk og lav mål mRNA uttrykk i den aktuelle histologiske tilstand (SCC eller adenokarsinom) ble betraktet som en sann positiv test. Følsomhet eller sanne positive Prosenten måler andelen av faktiske positive som er korrekt identifisert. Spesifisitet eller sanne negative Prosenten måler andelen av negativer som er korrekt identifisert. PPV beskriver sannsynligheten for å få tilstanden gis en positiv filtrering testresultat i den analyserte populasjonen. Den NPV beskriver sannsynligheten for ikke å ha tilstanden gitt en negativ screening test resultat i den analyserte befolkningen.
Resultater
Profil Development
genuttrykk profiler etter histologisk subtype.
Hele genomet uttrykk arrays ble utført i tumorprøver av pasienter med opplæringen kohort og uttrykk profiler av SCC og adenokarsinom tumortyper ble sammenlignet ett gen om gangen ved hjelp av en-utvalg
t Anmeldelser – test. Etter ett-trinns Bonferroni justering, ble 727 gener identifisert til å være forskjellig uttrykt av mer enn to ganger i enten histologisk undertype i forhold til referanse bassenget (tabellene A, B, C og D i tabell S1). Av disse 727 genene, fem ble oppregulert og 195 nedregulert i pasienter med adenokarsinom, og 13 ble oppregulert og 516 nedregulert i pasienter med SCC.
I tillegg er en annen uavhengig evaluering av mRNA differensial uttrykk ble utført av diskriminant microarray data analyse for å minimere falske positive funn. Prediksjon Analyse av Mikromatrise (PAM) algoritme identifisert 61 gener som definerte en molekylær signatur i stand til å diskriminere adenokarsinom fra SCC prøver (figur 1). Av disse 61 genene, 56 matchet deregulerte gener funnet ved tidligere utførte one-sample t-test, og ble derfor valgt for videre analyse og validering.
Tippe Analyse av Mikromatrise algoritmen identifisert 61 gener som definerte en molekylær signatur for hver histologisk subtype. Modulatorene «dendrogram betegner en ukontrollert hierarkisk clustering analyse av 19 adenokarsinom og 25 SCC basert på deres genekspresjon profil. Varmen kartet var fargekodet bruker rød for oppregulering og grønt for nedregulering fra en lungekreft reference pool. På
toppen av kartet haugen; Eksporter Fargene tilsvarer genuttrykk profiler av SCC prøver (blå) versus adenokarsinom prøver (rød).
mikroRNA uttrykk profil ved histologisk subtype.
microRNAs TLDA arrays ble utført i tumorprøver av pasienter med opplæringen kohort. Ni mirnas (MIR-149, MIR-205, MIR-375, MIR-378, MIR-422A, MIR-483-5p, MIR-494, MIR-601 og MIR-708) ble funnet å være forskjellig uttrykt mellom SCC og adenokarsinom histologiske subtyper av en FDR-korrigert terskel på 0,05. Åtte av disse 9 mirnas ble over-uttrykt i SCC sammenlignet med adenokarsinom, og en (MIR-375) ble overuttrykt i adenocarcinom i forhold til SCC (tabell 3).
mikroRNA mål prediksjon.
elleve av de 56 gener (20%) ble funnet å bli deregulert av tumortypen i vår studie ble funnet å være antatte mål for minst en av de 9 mirnas også identifisert til å være forskjellig uttrykt i våre studiepopulasjonen ifølge histologisk subtype (SCC versus adenokarsinom). For de 8 over-uttrykt mirnas i SCC, 8 mRNA (
CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B Hotell og
MUC1
) ble spådd som mål ved flere algoritmer. Disse genene ble funnet å bli nedregulert i SCC sammenlignet med adenokarsinom i vårt studium (tabell 2). Tre av disse 8 gener (
CEACAM6, MLPH Hotell og
TMEM45B)
ble spådd mål på mer enn én av disse miRNAs (figur 2). Som vist i tabell 2, tre gener (
DSC3, KRT6A Hotell og
DMRT2
) ble spådd som mål for MIR-375, miRNA oppregulert i adenokarsinom, og disse genene ble konsekvent nedregulert i denne histologisk subtype.
grafen viser transkripsjons mål av forskjellig uttrykt mirnas i SCC og adenokarsinom tumortyper ved hjelp av tre nett databaser av miRNA mål prediksjon (Miranda, TargetScan og miRWalk). Standard fargevalg brukes til å representere uttrykk nivå er rød /blå (rød for over-uttrykk for mRNA eller miRNAs i SCC versus adenokarsinom og blå for ned-uttrykk av mRNA eller miRNAs i SCC versus adenokarsinom).
piler
indikerer mRNA undertrykkelse av
koblet mirnas
. Squares representerer deregulert mRNA og ovaler representerer forskjellig uttrykt mirnas i lunge adenokarsinom og SCC.
Profil Validering
Validering av genet differensial uttrykk ved kvantitativ RT-PCR.
elleve deregulerte gener (
CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1, DSC3, DMRT2 Hotell og
KRT6A), etter identifisert som mulige målgener av deregulerte mirnas i vår studie , ble så valgt for ytterligere bekreftelse av rtPCR både i opplæring kohort og i en uavhengig kohort av pasientene.
i opplæringen kohort, 9 av de 11 gener som ble testet ble bekreftet å være forskjellig uttrykt ved histologisk subtype ved kvantitativ PCR (figur 3).
CEACAM5
,
CLDN3, CGN, ABCC3, MUC1, ACSL5
,
MLPH Hotell og
TMEM45B
var signifikant nedregulert i SCC, og
KRT6A
var signifikant nedregulert i adenokarsinom.
for å validere gener identifisert som forskjellig uttrykt ved tumorhistologi i microarray data, relative uttrykk nivåer av mRNA ble kvantifisert ved real-time PCR med ΔCt-metoden av
B2M
som husholdningsgenet. Tomtene viser median ΔCt verdier av validerte gener hos pasienter med adenokarsinom versus SCC. Data fra RT-qPCR presenteres som log
2 2
-ΔCt verdier.
P
verdi under 0,05 ble betraktet som signifikant.
Basert på resultatene oppnådd i opplæringen kohorten, ble ni mRNA og 9 mirnas valgt for ytterligere validering av Taqman basert RT-qPCR i svulst og matchet normalt vev fra en uavhengig kohort av lungekreftpasienter. I dette kullet, uttrykk mønstre av mRNA var i samsvar med de kvantifisert i opplæringen kohort. Uttrykk mønstre av histologisk subtype av alle 9 mRNA testet lignet de som ble observert i opplæringen årsklasse, og forskjellene som ble observert blant undergruppene var statistisk signifikant (figur 4). Når det gjelder 9 mirnas, fem (MIR-149, MIR-205, MIR-378, MIR-422A og MIR-708) ble funnet å være betydelig over uttrykt i SCC og MIR-375 var betydelig over uttrykt i adenokarsinom (figur 5).
uttrykk av ni mRNA ble validert ved real-time PCR i en uavhengig kohort av NSCLC pasienter. mRNA uttrykk nivåene ble bestemt i tumorprøver og paret normalt lungevev fra lungekreftpasienter og relative uttrykk ved histologisk subtype ble vurdert. Median ΔΔCt verdier ble bestemt i de validerte gener hos pasienter med adenokarsinom og SCC. Data fra RT-qPCR presenteres som 2
-ΔΔCt verdier.
P
verdi under 0,05 ble betraktet som signifikant.
Uttrykk av deregulerte miRNAs ble evaluert i valideringen kohort. MikroRNA uttrykk nivåene ble bestemt i tumor og paret normalt lungevev fra lungekreftpasienter og relative uttrykk ved histologisk subtype ble vurdert. Median ΔΔCt verdier ble fastsatt i ni mirnas hos pasienter med adenokarsinom versus SCC. Data fra RT-qPCR presenteres som 2
-ΔΔCt verdier.
P
verdi under 0,05 ble betraktet som signifikant.
Sammenheng mellom miRNA og mRNA uttrykk.
For å studere den funksjonelle relevansen av miRNAs i reguleringen av spesifikke mRNA identifisert som potensielle biomarkører, analyserte vi i validerings kullet korrelasjonen mellom mirnas og forutsagte mål-mRNA-ekspresjon i hver enkelt pasient (figur 6). Det ble observert en invers korrelasjon mellom
ABCC3, MUC1 Hotell og
CEACAM6 Hotell og Mir-149 uttrykk nivåer. Videre høyere nivåer av
CEACAM6
var assosiert med lavere nivåer av MIR-205 og MIR-708, som er sammenhengen signifikant for MIR-708 (r = -0362; p = 0,030).
ACSL5 Hotell og
KRT6A
hadde en statistisk signifikant sammenheng med MIR-205 (r = -0,475, p = 0,003) og Mir-375 (r = -0,311, p = 0,065), henholdsvis .
Ved
TMEM45
B, signifikante sammenhenger ble funnet for MIR-378 og MIR-422A (r = Anmeldelser –
0,394, p = 0,016 og r = Anmeldelser –
0,413, p = 0,015, respektivt).
disse resultatene tyder på en mulig rolle av mirnas i reguleringen av disse genene. Deretter ble noen av disse målene testet ved anvendelse av luciferase-rapportørgenet analyser. Vi oppnådd at overekspresjon av MIR-149 i HEK 293-celler ned regulerer luciferaseaktiviteten av reporter konstruksjon inneholdende ABCC3 3-UTR (figur 7). Dette viser at MIR-149 binder direkte til dette målet RNA og hemmer deres uttrykk. I tillegg overekspresjon av MIR-378 og MIR-422A hemme TMEM45B uttrykk (figur 7).
Uttrykk for de 6 validerte mirnas og at deres antatte målgener ble målt i hver pasient i valideringen kohort. Betydningen av den inverse sammenheng mellom hver av disse miRNA /mRNA-par som ble undersøkt ved den Spearmans korrelasjonskoeffisient. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. A) Forholdet mellom
ABCC3
,
MUC1 Hotell og
CEACAM6
med MIR-149. B) Forholdet mellom
ACSL5 Hotell og
CEACAM6
med MIR-205. C) Forholdet mellom
TMEM45B Hotell og MIR-378. D) Forholdet mellom
TMEM45B Hotell og MIR-422A. E) Forholdet mellom
CEACAM6 Hotell og MIR-7018. F) Forholdet mellom
KRT6A Hotell og MIR-MIR-175.
HEK 293 celler ble transfektert med luciferase reporter vektor som inneholder 3 «UTR regionen ABCC3 og TMEM45B. Reporter vektorer ble ko-transfektert med miRN ligne eller kontroll miRN ligne. Etter 24 timers inkubering, ble luciferase-aktiviteten målt. * P 0,05 og ** p 0,001 av
t
-test
Diagnose Utførelse av utvalgte gener å diskriminere SCC fra adenokarsinom Histologisk NSCLC Subtyper
Til slutt. , evaluerte vi den spesifisitet og sensitivitet av disse seks validerte mirnas i kombinasjon med deres forutsagte mRNA for å diskriminere mellom SCC og adenokarsinom (figur 8). Det ble ikke observert den beste ytelsen for
KRT6A, etter som et mål av MIR-375, med sensitivitet og spesifisitet verdier på 94,1% og 88,9%, henholdsvis. God diagnostisk ytelse ble også observert for
CEACAM6, ACSL5 y MLPH, etter som mål for MIR-205, med lavere spesifisitet verdier (71,4 til 76,2%), men høyere følsomhet (100%). Til slutt,
TMEMB45B, etter som målet for MIR-378, viste en sensitivitet på 87,5% og en spesifisitet på 57,7%. De andre miRNA /mRNA par åpenbart lavere sensitivitet og spesifisitet verdier, selv om de var større enn 75% og 50% i alle tilfeller, henholdsvis (tabell S2).
plot som viser spesifisitet og sensitivitet av validerte mirnas i kombinasjon med spådd mRNA å diskriminere mellom SCC og adenokarsinom. Fargene representerer nedregulert mRNA fra seks deregulerte mirnas i SCC eller adenokarsinom.
Diskusjoner
I denne studien vi analyserte mRNA og miRNA uttrykk signaturer av pasienter med ulike undergrupper av NSCLC . Dette tillot oss å bygge en robust transcriptional profil lunge adenokarsinom og SCC. Våre resultater ikke bare indikerer eksistensen av en mRNA og /eller miRNA uttrykk mønstre som er i stand til å skille mellom SCC og adenokarsinom, men også at den endrede genuttrykk signatur er delvis forårsaket av spesifikke miRNA deregulering.
Først vi analysert av to tilnærminger hele genomet uttrykk microarray data for å minimere falske positiver. Vi undersøkte differensial genuttrykk nivåer av diskriminere microarray data analyse og ved ett-prøven
t
-test. Femti-seks gener ble funnet å være signifikant deregulert av både analyser og ble derfor valgt for videre evaluering og validering. Bemerkelsesverdig, flere av dem hadde tidligere blitt innblandet i relevante biologiske prosesser (i henhold til genet ontologi) i lungekreft. For eksempel er noen gener av
KRT
familie, som ble nedregulert i adenokarsinom, involvert i flere viktige cellefunksjoner som for eksempel celle migrasjon, vekst og spredning [21]. For det andre, miRNA profilering identifisert 9 mirnas som ble forskjellig uttrykt blant de to histologiske subtyper av NSCLC studert. Seks av dem (MIR-149, MIR-205, MIR-375, MIR-378, MIR-422A og MIR-708) ble ytterligere validert i en uavhengig kohort av NSCLC pasienter som biomarkører i stand til å diskriminere adenokarsinom og SCC. For å vurdere om disse mirnas kan være direkte regulerer noen av de 56 deregulerte gener identifisert flere bredt brukt algoritmer ble brukt. Elleve av disse 56 gener (20%) ble således anslått til å være antatte mål for minst en av de seks mirnas funnet å være forskjellig uttrykt i SCC i forhold til adenocarcinoma.
