Abstract
Den langsomme frigjørende hydrogensulfid (H
2S) donor, GYY4137, forårsaket konsentrasjonsavhengig drap på sju forskjellige menneskelige kreftcellelinjer (HeLa, HCT-116, Hep G2, HL -60, MCF-7, MV4-11 og U2OS), men ikke påvirke overlevelsen av normale humane lungefibroblaster (IMR90, WI-38), som bestemt ved trypan blå eksklusjon. Natriumhydrosulfid (NaHS) var mindre potent og ikke er aktive i alle cellelinjer. En strukturell analog GYY4137 (ZYJ1122) mangler svovel og derfra ikke i stand til å frigjøre H
2S var inaktiv. Lignende resultater ble oppnådd ved anvendelse av en klonogene assay. Inkubasjon av GYY4137 (400 uM) i kulturmedium førte til dannelsen av lav ( 20 mM) konsentrasjoner av H
2S opprettholdes over 7 dager. I motsetning til dette, inkubasjon av NaHS (400 uM) på samme måte ført til mye høyere (opp til 400 uM) konsentrasjoner av H
2S som varte i bare en time. Mekanistiske studier viste at GYY4137 (400 mm) inkubert i 5 dager med MCF-7, men ikke IMR90 celler forårsaket generasjon av spaltede PARP og kløyvde caspase 9, en indikasjon på en pro-apoptotisk effekt. GYY4137 (men ikke ZYJ1122) også forårsaket delvis G
2 /M arrest av disse cellene. Mus xenograft studier ved hjelp av HL-60-celler og MV4-11 viste at GYY4137 (100-300 mg /kg /dag i 14 dager) betydelig redusert tumorvekst. Vi konkluderer med at GYY4137 viser anti-kreft-aktivitet ved å frigjøre H
2S over en periode på dager. Vi foreslår også at en kombinasjon av apoptose og cellesyklus arrest bidrar til denne effekten, og at H
2S givere bør undersøkes nærmere som potensielle kreftlegemidler
Citation. Lee ZW, Zhou J, Chen CS, Zhao Y, Tan CH, Li L, et al. (2011) The Slow-Releasing hydrogensulfid Donor, GYY4137, utstillinger Novel anti-kreft effekter
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE seks (6): e21077. doi: 10,1371 /journal.pone.0021077
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 27 mars 2011; Godkjent: 17 mai 2011; Publisert: 20 juni 2011
Copyright: © 2011 Lee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet er støttet av et National University of Singapore forskningsstipend til PKM, LWD og CHT (R-183-000-240-720, R183-000-240-101, R183-000-268-733). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hydrogensulfid (H
2S) syntetiseres naturlig fra cystein ved flere enzymer inkludert cystationin γ lyase (CSE), cystationin β syntetase (CBS) og 3-mercaptosulfurtransferase (3-MST) i et bredt spekter av pattedyr og ikke-pattedyrceller både
in vitro Hotell og
in vivo
. I det siste tiåret, har mange fysiologiske og patofysiologiske roller blitt foreslått for denne gassen sammen med en overflod av cellulære og molekylære mål, inkludert et utvalg av ionekanaler, enzymer og transkripsjonsfaktorer [1].
Bortsett fra dens potensial roller i normal fysiologi er det også en omfattende litteratur som beskriver toksisitet av H
2S og dens rolle som en miljøgift [2]. En rekke studier har undersøkt rollen til H
2S i å utløse celledød og bevis er blitt presentert at denne gassen kan utøve både pro- og anti-apoptotiske aktivitet i dyrkede celler [3], [4]. Men den nøyaktige mekanismen (e) som er involvert er fortsatt uklart.
Kanskje overraskende, det har vært få studier av effekten av H
2S på kreftceller
in vitro Hotell og ingen rapporter om dens effekt på tumorprogresjon
in vivo
. Flere år siden rapporterte vi at H
2S beskyttet kolon kreftceller (HCT-116) fra apoptose på grunn av p-fenyletyl isothiocyanate [5]. Andre har senere rapportert at H
2S øker menneskets tykktarm kreft celle spredning og reduserer apoptose i flere cellelinjer (f.eks HCT-116, [6]) mens redusere overlevelse i andre menneskelige kolon cellelinjer (f.eks WiDr, [7]) . Disse ulike observasjonene er vanskelig å forene. Imidlertid kan en forklaring ligger i valget av H
2S donor. Sulfidsalter slik som natrium hydrosulfid (NaHS) og natriumsulfid (Na
2S) har blitt mye brukt for å undersøke de biologiske effektene av denne gassen i mange celler, vev og dyr. Ved tilsetning av vann, disse saltene genererer en stor mengde av H
2S løpet av en kort tidsperiode. Etter cellekultur finner sted over en periode på timer eller dager, er det sannsynlig at lite, om noen, er H
2S tilstede i mediet i løpet av kort tid til å legge enten NaHS eller Na
2S. Således, mens ingen direkte målinger har blitt gjort opp til dette punktet, synes det sannsynlig at konsentrasjonen av H
2S som kreft (eller faktisk andre) ikke-cancerceller blir utsatt for i løpet av kulturen med NaHS vil være høy ved begynnelsen og ikke opprettholdt gjennom hele forsøket. Dermed kan det være vanskelig å trekke bastante konklusjoner om evnen til H
2S å påvirke kreftcelleoverlevelse ved hjelp sulfidsalter som donormidler.
Med dette i tankene, vi tidligere rapportert at GYY4137 utgivelser H
2S langsomt både i vandige media, og når det gis til intakte dyr over en periode på timer til dager, [8], [9]. Vi har nå sammenlignet effekten av GYY4137 og NaHS på overlevelse av en rekke kreft og ikke-kreftceller i kultur og korrelert deres virkning med endringer i konsentrasjonen av H
2S i mediet. I tillegg har vi undersøkt effekten av GYY4137 på tumorvekst ved hjelp av en xenograft modell i immunsvikt mus.
Materiale og metode
Protokoller ble gjennomført med godkjenning av National University of Singapore (NUS) Institutional Review Board (IRB, referansekode: 09-120E) og NUS Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, protokollnummer: 804/05).
Kjemisk syntese av GYY4137 og ZYJ1122
GYY4137 ble syntetisert kjemisk i huset, som beskrevet tidligere [8]. ZYJ1122 (morfolin-4-ium diphenylphosphinate) ble syntetisert som følger. Til en oppløsning av diphenylphosphinic syre i diklormetan (1,0 mmol, 1,0 ekv.) (DCM; 2 ml) ved romtemperatur, morfolin (. 2,0 mmol, 2,0 ekv) ble tilsatt dråpevis. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved den samme temperatur i 1 time, og produktet ble deretter oppsamlet ved sugefiltrering. Det rene produkt ble oppnådd etter vasking med kald DCM. Hvitt faststoff ble oppnådd som 56% utbytte.
1 H NMR (500 MHz, CDCh
3, ppm): δ = 7,77 til 7,74 (m, 4H), 7,38 til 7,32 (m, 6H), 3,77 til 3,75 (m, 4H), 2,95 til 2,93 (m, 4H); LRMS (ESI) m /z 217,2 (M
-). Renheten og strukturer av forbindelsene ble bekreftet ved hjelp Protonkjernemagnetisk resonansspektroskopi (
1H NMR) og massespektrometri (figurer S1, S2, S3, S4).
Måling av H
2S
Den generasjonen av H
2S fra enten NaHS (Sigma), GYY4137 eller ZYJ1122 (alle 400 mm) ble bestemt i porsjoner (100 pl) trukket tilbake ved tidsintervaller (opp til 7 dager) fra kultivert MCF- 7-celler opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Sigma) som beskrevet nedenfor. Konsentrasjonen av H
2S (bestemt som en kombinasjon av fri H
2S, HS
– og S
2-) ble målt spektrofotometrisk som tidligere beskrevet [10]. I korthet medium (100 pl) ble blandet med 0,85% vekt /volum sinkacetat /3% NaOH-blanding (1: 1 forhold, 100 ul). Metylenblått ble deretter dannet ved tilsetning av N, N-dimetyl-p-fenylendiamin-dihydroklorid fargestoff og FeCl ^
3 (sluttkonsentrasjoner henholdsvis 2,5 mM og 3,3 mM) og absorbansen deretter overvåket ved 670 nm. Konsentrasjonen av H
2S (definert som ovenfor) ble bestemt ved hjelp av en standardkurve for NaHS. (0-400 mikrometer, R
2 = 0,9987)
Cell kultur og celleviabilitet
Alle cellelinjene, bortsett fra HCT-116 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). Menneskelig livmorhalskreft (HeLa), tykktarmskreft (HCT-116), leverkreft (Hep G2), osteosarkom (U2OS), bryst adenokarsinom (MCF-7) og menneske diploid lunge fibroblaster (IMR90 og WI-38) ble dyrket i DMEM supplert med 10% volum /volum føtalt bovint serum (FBS; HyClone), penicillin /streptomycin (100 U /ml; Sigma) og L-glutamin (2 mM; Caisson) ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2. Humane akutt promyelocytisk leukemiceller (HL-60) ble dyrket i DMEM inneholdende 20% volum /volum FBS mens human myelomonocytic leukemi (MV4-11) celler ble dyrket i RPMI med 10% volum /volum FBS under de samme inkuberingsbetingelser. Live-cellepopulasjoner inkubert med NaHS, GYY4137 eller ZYJ1122 (400 eller 800 mm) ble samlet etter 5 dager, og regnet i tre eksemplarer etter farging med trypanblått hjelp av en hemocytometer. Konsentrasjon respons for GYY4137 (100-1000 um) ble samlet i MCF-7, HL-60 og MV4-11 utsettes for medikamenter i 5 dager, og evnen til å redusere overlevelse bedømmes til IC
50 verdier. Kolonidannelse ved hjelp av MCF-7-celler ble også undersøkt ved en klonogene overlevelsesanalyse som beskrevet andre steder [11]. Kort sagt ble MCF-7-celler (10.000) sådd ut i triplikat i 6-brønners plater i nærvær av GYY4137, NaHS eller ZYJ1122 (200 og 600 uM) i 10 dager inntil kolonier var lett synlig. Kolonier ble deretter farget med krystallfiolett (5% w /v) og de representative bildene ble tatt med en ChemiGenius to Bio Imaging System (Syngene Ltd).
In vivo
effekten av GYY4137
dyret eksperimentelle protokollen er beskrevet tidligere [12]. Kort fortalt, ble kvinnelig, alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus (17-20 g, 4-6 uker gamle) oppvokst i huset og opprettholdes gjennom i patogenfrie (SPF) isolatorer. Eksponensielt voksende HL-60 og MV4-11-celler (1 x 10
7) (mer enn 95% levedyktighet) ble vasket to ganger i fosfat-bufret saltløsning og injisert subkutant inn i den løse huden mellom skulderbladene og den venstre fremre ben mottaker mus. Dyr ble behandlet med enten GYY4137 (100, 200 og 300 mg /kg /dag, ip) eller saltvann (1 ml /kg /dag, ip) i 14 dager med oppstart 14 dager etter injeksjon av cellene ved hvilket punkt mus hadde palpable tumorer 100 mm
3 gjennomsnittlig størrelse Alle dyrene ble nøye overvåket. Vekt og tumorstørrelse ble målt ved daglige intervaller. For tumorstørrelsesmåling, lengde (L) og bredden (W) av tumoren ble målt med en skyvelære, og tumorvolum (TV) ble beregnet som TV = (L x W
2) /2.
Cellesyklusanalyse og Western blotting
MCF-7-celler (40.000) ble inkubert i 6-brønners plater i nærvær eller fravær av GYY4137 (400 uM) for enten 5 eller 8 dager. Celler behandlet med ZYJ1122 ble anvendt som en kontroll. For å analysere cellesyklus profilen ble cellene fiksert med 70% volum /volum etanol på is i minst 2 timer, og deretter beiset i propidiumjodid-løsning (20 ug /ml propidiumjodid, 100 ug /ml RNase A og 0,1% v /v Triton X-100) i 15 min ved 37 ° C. Fargede celler ble så utsatt for DNA innholdsanalyse av flowcytometri (Dako cyan ADP) og data innhentet ble behandlet ved hjelp av Summit programvare (Beckman Coulter). Cellelysater av MCF-7 ble underkastet SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. De ble blokkert i Tris-membraner bufret saltvann (TBS) inneholdende ikke-fettholdig tørrmelk (5% vekt /volum) og deretter inkubert med det relevante primære antistoff (1 ug /ml) ved 4 ° C over natten. Antistoffer som ble brukt var α-PARP, α-spaltet-PARP, α-spaltet-caspase 9 (Cell Signaling Ltd.) og α-tubulin (Sigma).
Statistisk analyse
Cell overlevelse, IC
50 og tumorvolum ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil (SEM). For
in vitro
studier, celle overlevelse av både ikke-behandling (NT) og behandlingsgruppene ble analysert ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av en post-hoc t-test. For
in vivo
studier ble sammenligninger mellom kjøretøy kontrollgruppe og forskjellige doserings behandlinger analysert ved hjelp av lineær blandet modell for longitudinelle data analyse av SPSS programvare (IBM).
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Offentliggjøring av H
2S fra NaHS og GYY4137 i kulturmediet
Inkubasjon av enten NaHS eller GYY4137 i kulturmediet resulterte i frigjøring av påvisbare mengder av H
2S som reflekteres ved en økning i konsentrasjonen av H
2S (uM) etter fjerning av aliquoter og analysen for metylenblått formasjonen. Offentliggjøring av H
2S fra NaHS var rask – topp på eller før 20 min og fallende til ikke målbare nivåer av 90 min. I sterk kontrast, H
2S frigjøring fra GYY4137 var mye lavere ( 10% av det som ble observert med NaHS), men ble opprettholdt, gjenværende høyere enn grunnlinjen i opptil 7 dager. Ingen utslipp av H
2S var tydelig fra ZYJ1122, en kontroll for GYY4137 mangler svovel og dermed ute av stand til å danne H
2S, under de samme forsøksbetingelser for opp til 7 dager (Figur 1a). De kjemiske strukturer av GYY4137 og ZYJ1122 vises i innfelte til figur 1A.
(A) H
2S-frigjørende profilen til NaHS, GYY4137 og ZYJ1122. H
2S løslatt fra NaHS, og GYY4137 (400 mm) ble bestemt i porsjoner (100 pl) av medium trukket tilbake ved tidsintervaller (opp til 7 dager) fra dyrkede MCF-7 celler. Konsentrasjonen av H
2S mengder ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av N, N-dimetyl-p-fenylendiamin-dihydroklorid og resultatene viste H
2S konsentrasjon (uM). H
2S utgivelse fra GYY4137 var signifikant forskjellig (
P
0,05) fra T = 0 ved alle tidspunkter fra 0,3 time til 7 dager. H
2S utgivelse fra NaHS var signifikant forskjellig (
P
0,05) fra T = 0 til enhver tid peker opp til 1,5 timer. Ingen påviselig H
2S ble løslatt fra ZYJ1122 (400 mm) under identiske eksperimentelle conditons. Resultatene viser gjennomsnitt ± S.E. mener, n = 3. De kjemiske strukturer av GYY4137 og ZYJ1122 vises i innfelt. (B) Vekstkurve analyse av MCF-7, HL-60 og MV4-11 celler behandlet med NaHS, GYY4137 og ZYJ1122 (400 uM) i løpet av 5 dager. Celleoverlevelse ble bestemt ved trypan blå farging. Resultatene viser cellevekst i prosent i forhold til NT celle tall på dag 5 og er gjennomsnitt ± S.E. mener, n = 3.
Effekt av NaHS og GYY4137 på cellevekst og levedyktighet
Effekten av NaHS, GYY4137 og ZYJ1122 på vekst av tre kreftcellelinjer dvs. MCF-7 (bryst adenokarsinom), MV4-11 (akutt promyelocytisk leukemi) og HL-60 (myelomonocytic leukemi), ble overvåket i 5 dager. Ved hvert angitte intervall, ble antall levende celler fra hver behandlingsgruppe tatt opp i tre eksemplarer. GYY4137 (400 mm) betydelig redusert celleproliferasjon av alle tre kreft linjer mens både NaHS og ZYJ1122 var inaktive (figur 1B).
For å bestemme effekten av to ulike konsentrasjoner (400 mikrometer og 800 mikrometer) av GYY4137, NaHS og ZYJ1122 på et bredere panel av humane kreftcellelinjer, celleoverlevelse på ytterligere fire kreftcellelinjer av ulik opprinnelse dvs. livmorhalskreft (HeLa), tykktarmskreft (HCT-116), leverkreft (Hep G2) og osteosarkom (U2OS -celler) ble bestemt i sammenligning med to normale humane diploide fibroblaster (WI-38 og IMR90) (figur 2A). Over en 5-dagers kulturperiode, NaHS (400 uM) mislyktes i å påvirke overlevelsen av en hvilken som helst av de syv kreftlinjene som ble testet. I motsetning til dette er effekten av GYY4137 på celle overlevelse var mye mer uttalt med 30-70% (
P
0,01) død i alle kreftcellelinjer ved den samme konsentrasjon. En høyere konsentrasjon av NaHS (800 mm) resulterte i en ytterligere, om enn liten, reduksjon i HCT-116, Hep G2 og MCF-7 celleoverlevelse (ca. 15-30%) selv om igjen ingen signifikant forskjell i celleoverlevelse var tydelig i HeLa , HL-60, U2OS og MV4-11 celler. I motsetning til dette, GYY4137 ved samme konsentrasjon, markert redusert overlevelse med omtrent 75-95% i alle kreftcellelinjer. Den absolutte graden av celledød forårsaket av GYY4137 varierte mellom kreftcellelinjer med størst effekt i HepG2, HL-60, MV4-11, MCF-7 og U2OS celler og minst effekt i HCT-116 og HeLa celler. Av denne grunn ble det etterfølgende eksperimenter utført ved bruk av en eller flere av HL-60, MCF-7 og MV4-11 kreftceller. Viktigere, verken NaHS eller GYY4137 vesentlig endret overlevelsen av menneske ikke-kreft WI-38 og IMR90 fibroblaster. Den svovel-manglende kontrollforbindelse, ZYJ1122, var uten signifikant effekt på overlevelse av en hvilken som helst cellelinje, noe som antyder at de observerte effekter av GYY4137 på kreftceller skyldes mest sannsynlig H
2S frigivelse. Konsentrasjonen responsforholdet for GYY4137 (100-1000 um) for å redusere celle-overlevelse ble også undersøkt i MCF-7, HL-60 og MV4-11 celler. IC
50 verdier for denne forbindelsen var 337,1 ± 15,4, 389,3 ± 16,8 og 341,8 ± 21,2 mikrometer (alle n = 3) henholdsvis (figur 2B).
(A) Effekten av behandlingen (5 dager) av et utvalg av kreft og ikke-kreftceller med NaHS, GYY4137 og ZYJ1122 (400 pM eller 800 pM) som bestemt ved trypan blå farging. Resultatene viser prosentandel av cellelevedyktigheten til ikke-behandling (NT) etter inkubasjon i fravær av medikamentbehandling, og er gjennomsnitt ± S.E. mener, n = 3, (
#
P
0,05; *
P
0,01). (B) Konsentrasjons-respons kurver som viser effekten av GYY4137 behandling i 5 dager på overlevelse av MCF-7, HL-60 og MV4-11 celler. Resultatene viser gjennomsnitt ± S.E. bety, n = 3 (C) Representative fotografier som viser klonogene overlevelsesanalyser av MCF-7-celler etter eksponering (5 dager, 200-600 pM) til enten NaHS (øverste rad), GYY4137 (midterste rad) og ZYJ1122 (nederste rad) . NT = non-behandling.
Effekten av NaHS, GYY4137 og ZYJ1122 (200-600 mm) på overlevelse av MCF-7 celler ble også vurdert
in vitro
bruker en klonogene analyse. Representative fotografier er vist i figur 2C. For disse forsøk ble MCF-7-celler sådd ut i nærvær eller fravær av medikamenter og dyrkes over en 10-dagers periode. GYY4137 forårsaket en konsentrasjonsavhengig tap av cellekolonidannelse som var nær maksimal ved en konsentrasjon på 600 uM. Celletap var ikke tydelige i både NaHS og ZYJ1122 behandlede prøver.
Effekten av GYY4137 (400 pm, 5 eller 8 dager) på MCF-7-celler ble også undersøkt ved anvendelse av cellesyklusanalyse. Den sub-G1 populasjon av MCF-7-celler eksponert for GYY4137 var signifikant høyere (
P
0,05) sammenlignet enten med ikke-behandlede celler eller celler som er utsatt for den samme konsentrasjon av ZYJ1122 på dag 5 (figur 3A ). Således sub-G1 populasjon av celler behandlet med GYY4137 utgjorde 7,5% av den totale cellepopulasjon på dag 5 og 14,8% ved dag 8 av behandlingen sammenlignet med ca. 1% av celler som enten ikke har fått behandling eller ble eksponert for ZYJ1122 ( Figur 3A). I tillegg var det en signifikant akkumulering av 4N-DNA cellepopulasjon i celler behandlet med GYY4137 (til 18,6% og 26,6% etter 5 og 8 dagers inkubering henholdsvis) sammenlignet med enten ubehandlet (14,8%) eller ZYJ1122-behandlede (14 %) celler (figur 3A). I videre forsøk, ble muligheten for at GYY4127 utløser cancercelledød ved å fremme apoptose også studert. Et sterkt signal for spaltet-PARP og aktivert caspase 9 ble påvist i MCF-7-prøvene som er behandlet med GYY4137 (400 uM, 5 dager) med en sterkt redusert signal i celler behandlet med ZYJ1122 (figur 3B). Interessant, ble det ikke observert noen spalting av PARP og ingen aktivering av caspase 9 i IMR90 celler inkubert med enten GYY4137 eller ZYJ1122.
(A) Cell syklus analyse av MCF-7 celler etter 5 dager (NT og ZYJ1122) og 5 og 8 dager (GYY4137) medikamentell behandling. Innfellinger viser prosentvis fordeling av celler i hver cellesyklus fase. Resultatene som vises er veiledende av 3 individuelle eksperimenter. NT: non-behandling. (B) Western blot-analyse av apoptose markører (α-spaltet PARP-, α-spaltet caspase-9) av MCF-7 og IMR90 som ble behandlet (5 dager) med GYY4137 eller ZYJ1122 (begge 400 uM). Den anti-spaltede caspase-9-antistoffet anvendt detekterer det store fragmentet av caspase-9 Etter spalting, men gjenkjenner ikke uspaltede procaspase-9. α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. Resultatene som vises er veiledende av 3 individuelle eksperimenter.
Effekt av GYY4137 på tumorvekst
in vivo
Subkutan transplantasjon av enten HL-60 eller MV4-11 celler resulterte i tidsavhengig tumorvekst i SCID-mus (figur 4A, B). Tumorvolum ved slutten av eksperimentet var 3024 ± 220 mm
3 og 1166 ± 199 mm
3 (n = 4-6) i dyr som mottok daglig kjøretøy injeksjon og administrert HL-60 og MV4-11 celler respektivt . Administrering av GYY4137 på en daglig basis i en signifikant (
P
0,05) doserelatert hemming av tumorvekst i begge settene av dyr. GYY4137 (ved den høyeste dosen som brukes dvs. 300 mg /kg) administrert daglig i 14 dager redusert tumorvolum ved 52,5 ± 9,2% (n = 6) og 55,3 ± 5,7% (n = 4) i HL-60 og MV4-11 injisert dyr. Selv om det ikke målt objektivt i disse forsøkene, ble GYY4137 behandling ikke påvirker dyrets vekt eller grov oppførsel.
Endringer i volum av etablerte tumorer i, (A) HL-60-xenograft mus (B) MV4-11 xenograft mus behandles daglig med enten GYY4137 (100, 200 og 300 mg /kg, ip) eller bærerkontroll. Behandling med GYY4137 betydelig redusert tumorvolumet i begge dyremodeller, på en doseavhengig måte. Resultatene viser endringer av tumorvolumet i gjennomsnitt ± S.E. mener (n = 4-6, #
P
0,05; *
P
0,01).
Diskusjoner
rapport her at, (i) GYY4137 (men ikke NaHS) forårsaker en konsentrasjonsavhengig reduksjon i kreftcelleoverlevelse, (ii) hverken GYY4137 eller NaHS, ved hjelp av identiske konsentrasjoner og eksperimentelle betingelser, påvirket overlevelsen av normale dvs. ikke-cancerceller, (iii) GYY4137 fremmet kreftceller (MCF-7), men ikke normal celle (IMR90) apoptose som vist ved måling av sub-G1 befolkning og ved observasjon av spaltet PARP og spaltet caspase 9 og utløste cellesyklus-stans av MCF-7-celler in G
2 /M-fase, (iv) H
2S-konsentrasjonen funnet i medium inneholdende MCF-7-celler skredet «basal» nivåer i opp til 7 dager etter eksponering for GYY4137 men i mindre enn 2 timer etter eksponering til NaHS, (v) ZYJ1122, en kontroll for GYY4137 mangler svovel og således ute av stand til å danne H
2S, var inaktive i alle tilfeller og, (vi) GYY4137 administrert daglig til immundefekte mus i 14 dager forårsaket en doseavhengig reduksjon i tumorvekst fremkalt ved forutgående injeksjon av en av to humane leukemicellelinjer.
fore~~POS=TRUNC liggende~~POS=HEADCOMP data viser for første gang, en anti-kreft effekt av langsom-frigjørende H
2S donor , GYY4137. Alle kreftceller som ble testet var utsatt for denne forbindelsen om enn i forskjellig grad. Det er nå godt etablert som NaHS frigjør store mengder H
2S over kort tidsperiode. I dagens eksperimenter, viser vi at GYY4137, som NaHS, også utgivelser H
2S følgende inkubasjon i kulturmedium som inneholder MCF-7 celler og dermed bekrefter vår tidligere observasjon av spontan H
2S generasjon i vandige media [8]. Siden ZYJ1122 viste ingen anti-kreft aktivitet i noen av de
in vitro
modeller vi konkludere med at den anti-kreft aktivitet av både GYY4137 og NaHS (ved høy konsentrasjon) er svært sannsynlig å være H
2S- avhengig. Kanskje overraskende, GYY4137 utstilt større kreftcelle drapet aktivitet enn gjorde NaHS
in vitro
selv om det fører til markert lavere konsentrasjoner av H
2S i cellen medium. Dermed vil optimalt drap av cancerceller med H
2S under disse forsøksbetingelser synes å forekomme ved lave konsentrasjoner av gassen fordelt over en periode på flere dager, i motsetning til en mye høyere konsentrasjon oppnås over en kortere tidsperiode etter eksponering av celler til NaHS. Det bør bemerkes at selv om forholdsvis høye konsentrasjoner av GYY4137 (dvs. 400-800 um) er nødvendig for denne virkning, er den effektive konsentrasjon av H
2S genereres er mye mindre, dvs. 20 uM basert på målingene i kulturmediet. Men vi kan ikke utelukke muligheten for at GYY4137 kan samle seg inne kreftceller og dermed slipper større mengder av H
2S intracellulært. Med denne forutsetning i tankene, innebærer den foreliggende data at hastigheten ved hvilken cellene er utsatt for H
2S, så vel som konsentrasjonen av H
2S oppstått er kritisk i bestemmelse av evnen av denne gassen for å fremme celledreping.
Interessant, verken GYY4137 eller NaHS medført betydelig drap på normale dvs. ikke-kreftceller som tyder på at effekten av både H
2S givere er spesifikk for kreftceller. Virkningsmekanismen av kreftcelledrepende virkning av GYY4137 er også blitt undersøkt. Behandling av MCF-7-celler med GYY4137 resulterte i cellesyklusarrest i G
2 /M-fase og fremming av apoptose som bevis ved øket sub-populasjon G1, så vel som nærvær av både spaltet PARP og spaltet caspase 9. Nei signifikant effekt enten på cellesyklusen eller på apoptose var tydelig i ZYJ1122-behandlede celler igjen tyder på at begge disse effektene var sekundært til vedvarende eksponering av cellene for lave nivåer av H
2S. Evnen til H
2S å forårsake kreft celledreping på denne måten har ikke tidligere blitt rapportert. Imidlertid har H
2S tidligere er blitt vist å påvirke både cellesyklus og apoptose. For eksempel, H
2S fremmer cellesyklus oppføring og spredning av intestinal IEC-18 celle
in vitro
ved å aktivere MAPK [13]. H
2S kan også oppvise både pro- (for eksempel [14]), og anti- (for eksempel [15]) apoptotisk aktivitet avhengig av celletypen studert og forsøksbetingelsene, spesielt er konsentrasjonen av H
2S anvendt. En rekke potensielle molekylære mål har vært implisert i virkningen av H
2S på apoptose, inkludert p38 og caspase-3 [15], [16], andre MAPK slik som MEK og JNK [17] samt forsterket produksjon av varmesjokkprotein (HSP-90) [18]. Selv om den nøyaktige cellulære virkningsmekanismen til GYY4137 er uklar, virker det ikke urimelig at H
2S, frigis langsomt over en periode på flere dager, kan påvirke redoks mekanismer inne i cellen for å få til den anticancer-effekt. I lys av dette, kan det være av interesse å vurdere effekten av GYY4137 på reaktive oksygen arter generasjon og antioksidant enzym nivåer i kreftceller.
I konklusjonen, viser GYY4137 anti-kreft celle aktivitet både
in vitro Hotell og
in vitro
. Vi foreslår at GYY4137 bryter ned langsomt, hvilket ga H
2S, som ved en kombinasjon av cellesyklus-stans og fremme apoptose, hemmer tumorvekst. Ingen celledød var tydelig i ikke-cancerceller. Enten slike celler bare bryte ned H
2S i et raskere tempo eller om kreftcellene er unikt følsomme for drapet effekten av denne gassen krever videre studier. Oppdagelsen av at kreftceller kan bli drept selektivt når de utsettes for forholdsvis små mengder av H
2S over en relativt lang tidsperiode er nøkkelen. Denne observasjonen må huske på i en eventuell fremtidig arbeid å undersøke hvilken rolle H
2S i kreftcelleoverlevelse og også i utviklingen av romanen H
2S-baserte antitumormidler.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
1 H NMR spekter av GYY 4137.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021077.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Massespektrometri spekter av GYY 4137.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021077.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
1 H NMR-spekteret av ZYJ1122.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021077.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Massespektrometri spekteret av ZYJ1122.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021077.s004 plakater (TIF)
Takk
Vi er svært takknemlige for Dr. Thilo Hagen for hans verdifulle forslag om eksperimentelle design, og Dr. Zhao Yudong for hans råd om
in vivo
dataanalyse. Vi takker Dr. Bert Vogel for å gi HCT-116 cellelinje.
