Abstract
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er en dødelig kreft med en dårlig prognose som er preget av overdreven mitogen sti aktivering og merket chemoresistance til et bredt spekter av cellegifter. Dual spesifisitet protein fosfatase 1 (DUSP1) er en viktig negativ regulator av mitogen aktivert protein kinaser (MAPK). Likevel er DUSP1 uttrykt i kreft i bukspyttkjertelen celler (grunnfondsbevis) i PDAC hvor det paradoksalt forbedrer kolonidannelse i soft agar og fremmer
in vivo
tumorigenicity. Det er imidlertid ikke kjent om DUSP1 overekspresjon bidrar til PDAC chemoresistance. Ved hjelp av BxPC3 og COLO-357 humane PCC, viser vi at gemcitabin aktiverer c-Jun N-terminal kinase (JNK) og p38-mitogen aktivert proteinkinase (p38 MAPK), nøkkel kinaser i to store spenningsaktiverte signalveier. Gemcitabin-indusert JNK og p38 MAPK aktivisering medierer økt apoptose, men også transcriptionally oppregulerer DUSP1, noe som gjenspeiles av økte DUSP1 mRNA nivåer og RNA polymerase II lasting på DUSP1 genet kroppen. Omvendt, shRNA-mediert hemming av DUSP1 forbedrer JNK og p38 MAPK aktivering og gemcitabin kjemosensitivitet. Ved hjelp av doksycyklin-induserbare knockdown av DUSP1 i etablerte ortotopiske pankreastumorer, fant vi at å kombinere gemcitabin med DUSP1 hemming forbedrer dyr overlevelse, demper angiogenese, og forbedrer apoptotisk celledød, sammenlignet med gemcitabin alene. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at gemcitabin-mediert oppregulering av DUSP1 bidrar til en negativ feedback loop som demper sine gode handlinger av stress stier og apoptose, øke muligheten for at målretting DUSP1 i PDAC kan ha nytte av å styrke gemcitabin kjemosensitivitet mens undertrykke angiogenese.
Citation: Liu F, Gore AJ, Wilson JL, Korc M (2014) DUSP1 er en roman Target for Styrking Bukspyttkjertelkreft kreft~~POS=HEADCOMP Cell Følsomhet for gemcitabin. PLoS ONE 9 (1): e84982. doi: 10,1371 /journal.pone.0084982
Redaktør: Rajesh Agarwal, University of Colorado Denver, USA
mottatt: 23. oktober 2013, Godkjent: 27 november 2013; Publisert: 07.01.2014
Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute (NCI) stipend CA-R37-075059 til MK, tildelt av National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Murray Korc er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA, med en årlig dødelighet på nesten 38 000, en median overlevelse på 6-7 måneder og en fem-års overlevelse på 6% [1]. Mens reseksjon forlenger overlevelse og tilbyr en potensiell kur, 80-85% av PDAC er unresectable ved diagnosetidspunktet på grunn av tilstedeværelsen av fjernmetastaser, peritoneal seeding eller invasjonen i tilgrensende vitale strukturer [2]. Den kjemoterapeutisk middel gemcitabin (2 «, 2»-difluorodeoxycytidine, dFdC) har vært standard på omsorg for pasienter med lokalavansert eller metastatisk sykdom [3]. Nylig godkjente Food and Drug Administration kombinasjonen av gemcitabin og nab-paclitaxel, basert på funn at denne kombinasjonen bedre total overlevelse 8,5 måneder versus 6,7 måneder med gemcitabin alene [4]. Det er generelt akseptert at forbedrer responsen til gemcitabin i PDAC ville føre til en ytterligere økning i pasientens overlevelse.
Motstanden PDAC til gemcitabin og mange andre kjemoterapeutika skyldes delvis til et bredt spekter av genetiske og epigenetiske forandringer som fører til unormal aktivering av celleoverlevelse og anti-apoptotiske reaksjonsveier [5], en intens desmoplasia som interfererer med levering av legemidler til tumormassen [6], [7], og endringer i ekspresjon av viktige molekyler som er involvert i gemcitabin opptak, intracellulær aktivering og effluks [8]. Det er et presserende behov, og derfor å fremme vår forståelse av mekanismene bak chemoresistance i PDAC, for å utvikle nye og mer effektive kjemoterapeutiske strategier.
Unormal aktivering av mitogenaktiverte protein kinaser (MAPK) spiller en avgjørende rolle i regulering av celleoverlevelse og apoptose [9], [10]. MAPKs kan grupperes i tre familier: ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK), c-Jun-NH2 kinase (JNK), og p38 MAPK [9], [10]. Ved stimulering av mitogen eller miljøproblemer, er MAPK aktivert ved fosforylering på sine tyrosin og treonin-rester av oppstrøms MAP2K kinaser [9], [10]. Aktiverte MAPK fosforylere et spekter av mål-substrater, inkludert proteinkinaser og transkripsjonsfaktorer som er involvert i reguleringen av celleproliferasjon, differensiering, overlevelse, og apoptose [9], [10]. Til tross for eksistensen av krysstaleveier mellom ulike MAPK, støtter de fleste bevis på konseptet at aktiverte ERK fremmer cellevekst, overlevelse, og motilitet, mens JNKs og p38 MAPK negativt regulerer cellesyklusprogresjon og indusere apoptotisk celledød i respons på miljøstress [9] [10].
Den dual-spesifisitet fosfatase (DUSP) familie av proteiner består av 25 medlemmer [11]. DUSPs kan dephosphorylate både treonin /serin og tyrosin rester av sine substrater og dermed fungere som negative regulatorer av MAPKs [11]. DUSP1 /MKP-1 er en kjernefysisk MAPK fosfatase som er en direkte transcriptional mål av p53, E2F-1, c-Jun og ATF2, og som er indusert som reaksjon på oksidativt stress, hypoksi og andre påkjenninger som for eksempel næringsmangel og kjemoterapeutiske medikamenter [12] – [14]. DUSP1 er overuttrykt i et utvalg av epiteliale tumorer inkludert PDAC, ikke-småcellet lungekreft, brystkreft, eggstokk, gastrisk og tidlig stadium prostatakreft [15] – [20], og denne overekspresjon er korrelert med dårlig pasientens overlevelse i eggstokk-kreft [18]. Den økte DUSP1 ekspresjon i brystkreft er inverst korrelert med JNK-aktivitet og markører for apoptose, noe som tyder på en anti-apoptotiske rolle DUSP1 via dets aktivitet overfor JNK [17]. Til støtte for denne konklusjonen, har kreftceller som overuttrykker DUSP1 er resistente overfor kjemoterapi, og Fas-ligand-fremkalt apoptose, mens reduksjon av DUSP1 nivåer ved hjelp av en liten interfererende RNA forbedrer følsomheten til disse midler [21] – [23]. Omvendt, i leverkreft (HCC) økte DUSP1 nivåer korrelerer med bedre prognose [24]. Videre DUSP1 regulerer negativt ERK-signalisering i HCC celler, og derved hemmer deres proliferative potensial, noe som tyder på at DUSP1 er et tumorsuppressorgen i HCC [24]. Dermed de skadelige konsekvensene av DUSP1 overekspresjon er sannsynlig kreftspesifikke.
Vi rapporterte at DUSP1 er overuttrykt i PDAC, og at antisense-mediert hemming av DUSP1 uttrykk reduserer tumorutvikling i nakne mus [15]. Det er ikke kjent, men om DUSP1 kan være et mål for bedre respons på gemcitabin-basert kjemoterapi i PDAC. Vi viser nå at gemcitabin aktiverer JNK og p38 MAPK, og dermed føre til økt apoptose og DUSP1 transkripsjon. Omvendt, shRNA-mediert hemming av DUSP1 forsterker gemcitabin-indusert JNK og p38 MAPK-aktivering og sensitizes PDAC celler til gemcitabin. Ved hjelp av en doksycyklin-induserbar strategi for å undertrykke DUSP1 i etablerte ortotopiske pankreastumorer, viser vi at å kombinere gemcitabin med DUSP1 hemming forlenger overlevelse, demper angiogenese, og forbedrer apoptotisk celledød. Dermed kan DUSP1 være en potensiell terapeutisk mål for å styrke PDAC følsomhet for gemcitabin.
Resultater
JNK og p38 MAPK signalveier er aktivert i Response til gemcitabin
Virkningene av gemcitabin på PCC-vekst ble evaluert ved hjelp av MTT-analysen. I alle tre cellelinjer, gemcitabin utøves en dose-avhengig veksthemmende virkning. ASPC-1 var mest motstandsdyktige mot gemcitabin, med en IC50 større enn 100 ng /ml, mens BxPC-3 og COLO-357-celler var mer følsomme for gemcitabin, med IC50-verdier på 10 ng /ml og 5 ng /ml, henholdsvis ( fig. 1A).
(A) ASPC-1, BxPC-3, og COLO 357-celler ble inkubert i 48 timer i fravær eller nærvær av varierende konsentrasjoner av gemcitabin, og MTT-analyser ble utført. Dataene er gjennomsnitt ± SEM fra 3 eksperimenter. * P 0,05; ** P 0,01, sammenlignet med kontrollen. (B) ASPC-1, BxPC-3, og COLO 357-celler ble inkubert i de angitte tidsrom med 100 ng /ml, 10 ng /ml og 5 ng /ml gemcitabin, henholdsvis, og analysert ved immunblotting. (C) BxPC-3-celler ble inkubert i 48 timer med 10 ng /ml gemcitabin (G), i fravær eller nærvær av 10 pM SB203580 (SB) eller 10 pM SP600125 (SP), og analysert ved immunblotting.
for å evaluere effekten av gemcitabin på aktiveringen av MAPK, ble celler inkubert med gemcitabin i en konsentrasjon nær deres respektive IC50-verdier. I BxPC-3 og Colo-357, gemcitabin indusert fosforylering av p38 MAPK og JNK, nøkkel kinaser i to store stress-aktivert signalveier (Fig. 1B). Gemcitabin også økte nivåene av fosfo-c-Jun i disse cellene (fig. 1B). Gitt at fosfo-c-Jun er et felles nedstrøms mål for p38 MAPK og JNK-reaksjonsveiene, bekreftet denne observasjonen aktivering av p38 MAPK og JNK signalering. Videre er nivået av spaltede kaspase 3 og spaltet PARP korrelert med p38 MAPK, JNK, og c-Jun-aktivering, noe som antyder at p38 MAPK og JNK-reaksjonsveiene medierer celledød ved apoptose i respons til gemcitabin (Fig. 1B). I motsetning til dette ASPC-1-celler var mer resistente overfor gemcitabin, som vist ved fravær av p38 MAPK og JNK-aktivering og de lavere nivåer av spaltet kaspase 3 og spaltet PARP, selv ved en konsentrasjon så høy som 100 ng /ml (fig. 1B). For å bestemme hvorvidt gemcitabin apoptose via p38 MAPK og JNK-aktivering, ble BxPC-3-celler inkubert med gemcitabin i fravær eller nærvær av p38 MAPK (SB203580) eller JNK (SP600125) hemmere. Nivåene av spaltet PARP og kløyvet caspase 3 ble redusert med SB203580 og SP600125, da lagt til gemcitabin (Fig. 1C). Derfor, i sensitive cellelinjer, aktiverer gemcitabin p38 MAPK og JNK-signalering som induserer celledød ved apoptose, mens gemcitabin-resistens er assosiert med lavere nivåer av apoptose og markert svekket p38 MAPK /JNK-aktivering.
Gemcitabin Aktiverer DUSP1 Transkripsjon gjennom JNK og p38 MAPK Signa
med tanke på at DUSP1 er en viktig regulator av MAPK aktiviteter [11], vi neste undersøkt uttrykk for DUSP1 i respons til gemcitabin og den underliggende mekanismen regulere sitt uttrykk. I begge BxPC-3 og COLO 357-celler, ble DUSP1 mRNA og proteinnivåene indusert ved 24 timer og 48 timer etter tilsetning gemcitabin, samtidig med aktivering av p38 MAPK og JNK (fig. 2A). Derimot ble det ikke observert noen signifikante endringer i DUSP1 nivåer i gemcitabin-resistente ASPC-1 celler, i samsvar med lave nivåer av apoptose og fravær av p38 MAPK og JNK-aktivering ved behandling (Fig. 2A).
(A) ASPC-1, BxPC-3, og COLO 357-celler ble inkubert i de angitte tidsrom med 100 ng /ml, 10 ng /ml og 5 ng /ml gemcitabin, henholdsvis, og DUSP1 nivåene ble bestemt ved Q- PCR og immunoblotting. (B, C) BxPC-3 og COLO-357-celler ble inkubert i 24 timer med 10 ng /ml og 5 ng /ml gemcitabin, henholdsvis i fravær eller nærvær av 10 umol /l U0126, 10 umol /L SP600125, 10 umol /L SB203580, eller begge deler SP600125 og SB203580, og Q-PCR (B) og RNA polymerase II ChIP fulgt av Q-PCR for DUSP1 gen kroppsregion (C) ble utført. Alle data er gjennomsnitt ± SEM fra 3 eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01, sammenlignet med kontroll
I respons på ulike stimuli, transkripsjonsfaktor AP-1 (c-Jun, c-Fos, ATF2), som er den viktigste nedstrøms målet for p38 MAPK og JNK-signalering, er blitt vist å assosiere med DUSP1 promoteren og regulere dens transkripsjon [14], [25]. For å bestemme hvorvidt p38 MAPK og JNK-signal mediere induksjon av DUSP1 ekspresjon av gemcitabin, ble BxPC-3 og COLO-357-celler behandlet med gemcitabin i fravær eller nærvær av SB203580, SP600125, eller deres kombinasjon. SB203580 og SP600125 redusert induksjon av DUSP1 mRNA nivåer av gemcitabin, mens kombinasjonen fullstendig blokkert denne induksjon. I motsetning ERK hemming med U0126 mislyktes i å endre gemcitabin-mediert induksjon av DUSP1, støtter konklusjonen om at p38 MAPK og JNK heller enn ERK signaliserer mekle DUSP1 induksjon av gemcitabin (Fig. 2B).
Økningen i DUSP1 mRNA nivåer kan skyldes økt transkripsjonen aktivitet eller posttranskripsjonelt mRNA stabilitet. Derfor kromatin immunoutfelling mot RNA-polymerase II, som er kjernekomponenten av transkripsjons maskineri, ble så utført, etterfulgt av Q-PCR for å kvantifisere mengden av RNA-polymerase II bundet til genet kroppsregion av DUSP1. Denne analyse tillater direkte måling av det aktive forlengelse trinn og gjenspeiler den transkripsjonelle aktivitet av den DUSP1 genet. Inkubering BxPC-3 og Colo-357 celler med gemcitabin 24 timer økte mengden av RNA-polymerase II lasting ved genet kroppsregion av DUSP1 ved 6 ganger og 12 ganger henholdsvis (fig. 2C), som peker til transkripsjonen aktivering av DUSP1 av gemcitabin . SB203580 og SP600125, men ikke U0126, hemmet gemcitabin-induserte økning i mengden av RNA-polymerase II forbundet med DUSP1 genet legemet (Fig. 2C). Sammen utgjør disse resultatene indikerer at p38 MAPK og JNK signal medierer DUSP1 transkripsjonen aktivering av gemcitabin.
Avbrudd av DUSP1 negativ feedback loop kjemosensitiviteten til gemcitabin og cisplatin
For å undersøke effekten av stanse DUSP1 på MAPK aktiviteter og gemcitabin kjemosensitivitet, ASPC-en, BxPC-3, og Colo-357 celler ble stabilt transduced med lentivirus uttrykker shRNA mot DUSP1 eller ikke-måls rykke kontroll og deretter inkubert med ulike gemcitabin konsentrasjoner. I alle tre cellelinjene, DUSP1 knockdown med to shRNAs økte veksthemmende tiltak for gemcitabin. Således tie DUSP1 forskjøvet IC50 verdiene for gemcitabin i ASPC-1, BxPC-3 og COLO-357-celler fra 500 til 10 ng /ml, fra 10 til 5 ng /ml, og fra 5 til 2,5 ng /ml, respektivt (fig. 3A). Disse resultatene tyder på at DUSP1 knockdown forbedret gemcitabin kjemosensitivitet, og at sensibiliserende virkning ble mer markert i celler med høy chemoresistance.
ASPC-en, BxPC-3, og Colo-357 celler ble stabilt transduced med lentivirus uttrykker shRNA mot rykke kontroll eller DUSP1. (A) Cellene ble inkubert i 48 timer i fravær eller nærvær av varierende konsentrasjoner av gemcitabin, og MTT-analyser ble utført. Dataene er gjennomsnitt ± SEM fra 3 eksperimenter. * P 0,05; ** P 0,01, sammenlignet med kontrollen. (B) ASPC-1, BxPC-3, og COLO 357-celler ble inkubert i de angitte tidsrom med 100 ng /ml, 10 ng /ml og 5 ng /ml gemcitabin, henholdsvis, og analysert ved immunblotting.
Den anti-DUSP1 antistoff rutinemessig avdekket 2 tett-migrere band på vestlige blotter (fig. 2-3). Imidlertid DUSP1 knockdown med to svært spesifikke shRNAs målretting DUSP1 spesifikt stilnet ekspresjon av det nedre båndet (Fig. 3B), som indikerer at det øvre bånd var ikke-spesifikk. DUSP1 knockdown med de samme svært spesifikke shRNAs også forsterkes gemcitabin-indusert apoptose, som dokumentert av økte nivåer av kløyvde PARP og kløyvde caspase 3 (Fig. 3B). Høyere nivåer av gemcitabin-indusert fosfor-p38 MAPK og fosfor-JNK ble også bemerket i DUSP1 knockdown celler, sammenlignet med krafse kontroll, noe som tyder på at tie DUSP1 de-trykt p38 MAPK og JNK signalering, og dermed føre til økt apoptotisk celledød i respons til gemcitabin (fig. 3B).
i betraktning at gemcitabin kan brukes i forbindelse med cisplatin eller 5-fluorouracil å behandle lokalt fremskreden eller metastatisk PDAC [26], [27], ved søkte vi å fastslå om målretting DUSP1 ville ha lignende sensibiliserende effekter på andre kjemoterapeutika foruten gemcitabin. For dette formål ble BxPC-3 og COLO 357-celler som stabilt uttrykker shRNA mot DUSP1 eller krafse kontroll behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin. I begge BxPC-3 og COLO-357-celler, redusert DUSP1 knockdown av IC50 fra 2 til 0,5 ug /ml, og også forsterkes cisplatin-indusert apoptotisk celledød, noe som gjenspeiles ved økte nivåer av spaltede PARP og spaltet caspase 3 (fig. 4A, 4B). Høyere nivåer av cisplatin-indusert fosfo-p38 MAPK og fosfo-JNK ble også bemerket i celler med DUSP1 knockdown (Fig. 4B), og lignende resultater ble oppnådd med ASPC-1-celler (data ikke vist). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at avbryte negative tilbakemeldinger på p38 MAPK og JNK signalering ved å undertrykke DUSP1 kunne forbedre apoptose og forbedre kjemosensitivitet for kreft i bukspyttkjertelen til flere kjemoterapeutika.
BxPC-3 og Colo-357 cellene stabilt transduced med lentivirus uttrykker shRNA mot rykke kontroll eller DUSP1. (A) Cellene ble inkubert i 48 timer i fravær eller nærvær av varierende konsentrasjoner av gemcitabin, og MTT-analyser ble utført. Dataene er gjennomsnitt ± SEM fra 3 eksperimenter. * P 0,05; ** P 0,01, sammenlignet med kontrollen. (B) BxPC-3 og Colo-357 celler ble inkubert med 2 mg /ml cisplatin for de angitte tider, og immunoblotting ble gjennomført.
knockdown av DUSP4, Another Nuclear DUSP, unnlater å forbedre kjemosensitivitet
siden forsøkt å finne ut om forbedret kjemosensitivitet er unik for DUSP1 stanse eller et felles trekk ved målretting mot DUSP familiemedlemmer. Derfor valgte vi å knockdown DUSP4 /MKP-2, på grunn av sin likhet til DUSP1 i form av subcellulære lokalisering og underlaget preferanse [11]. ASPC-en og BxPC-3 celler ble stabilt transduced med lentivirus koding shRNA mot DUSP4 eller ikke-måls rykke kontroll. Vellykket stanse av DUSP4 ble bekreftet med immunoblotting (Fig. 5B). Imidlertid DUSP4 knockdown mislyktes i å påvirke MAPK-aktivering eller responsen til gemcitabin i enten cellelinje (Fig. 5A, 5B). Således er DUSP1 et potensielt terapeutisk mål for potensiering av stress-aktiverte MAPK signalering og styrke gemcitabin kjemosensitivitet, som ikke nødvendigvis er et felles trekk ved alle DUSP familiemedlemmer.
ASPC-1 og BxPC-3-celler ble stabilt transdusert med lentivirus uttrykker shRNA mot rykke kontroll eller MKP2. (A) Cellene ble inkubert i 48 timer i fravær eller nærvær av varierende konsentrasjoner av gemcitabin, og MTT-analyser ble utført. (B) ASPC-1 og BxPC-3-celler ble inkubert i de angitte tidsrom med 100 ng /ml og 10 ng /ml gemcitabin, henholdsvis, og immunoblotting ble utført. Dataene er midler ± SEM av 3 eksperimenter.
gemcitabin og DUSP1 knockdown Kombiner å forlenge overlevelsen, dempe Tumor Angiogenese og spredning, og forbedre apoptose
neste søkt å evaluere effekten til å hemme DUSP1 på gemcitabin kjemosensitivitet i en orthotopic musemodell. Å studere den terapeutiske potensialet for målretting DUSP1 i fullt etablerte pankreastumorer, vi stabilt omformet Colo-357 humane kreft i bukspyttkjertelen celler med lentivirus uttrykker doksycyklin-induserbar shRNA mot DUSP1 eller en ikke-måls rykke kontroll, før injisere cellene i bukspyttkjertelen av immunsvikt mus i en TET-OFF tilstand. To uker senere, celler som uttrykker doksycyklin-induserbar shRNA mot DUSP1 eller krafse kontroll dannet svulster av samme størrelse, som kan være lett palperes. Alle musene ble fotografert på dag 15 etter operasjonen, ved hjelp av et høyoppløselig ultralyd, og tumorvolumene ble beregnet på grunnlag av ervervet 3-D-bilder som bekrefter at begge grupper er dannet tumorer i like stort volum (fig. 6). Fra dag 18 etter operasjonen, ble doksycyklin kontinuerlig administrert i drikkevannet, og musene ble randomisert i 2 grupper for å motta kjøretøyet eller gemcitabin (50 mg /kg, intraperitoneal injeksjon, to ganger ukentlig). Gemcitabin alene eller DUSP1 stanse alene ikke klarte å forlenge dyr overlevelse (fig. 7A). Imidlertid sammenligning av shRNA-krafse /gemcitabin-gruppen og shRNA-DUSP1 /gemcitabin-gruppen viste at DUSP1 knockdown genereres en betydelig overlevelsesfordel i nærvær av gemcitabin (p = 0,037) (Fig. 7A). Økningen i overlevelse var enda større når man sammenligner den shRNA-DUSP1 /gemcitabin-gruppen med shRNA-scramble /kjøretøygruppe (p = 0,009), noe som tyder på at DUSP1 lyddemping forbedret gemcitabin følsomhet
in vivo plakater (Fig. 7A ).
Colo-357 celler ble stabilt transduced med lentivirus uttrykker Tet-induserbar kontroll shRNA (shScramble) eller DUSP1 målretting shRNA (shDUSP1). Celler ble injisert i pankreata av immundefekte mus, og 15 dager senere, tumorer ble fotografert ved hjelp av et Vevo2100 høy oppløsning ultralyd. (A-B) Representative ultralydbilder med høy oppløsning (A) og kvantifisering av tumorvolum ved hjelp av 3D mage skanner (B) viser at før Dox eller gemcitabin behandlinger, shScramble og shDUSP1 svulster (T, angitt med piler) var lik i størrelse . Data i (B) er gjennomsnitt ± SEM.
immunsvikt mus som bærer ortotopiske svulster avledet fra Colo-357 celler som stabilt uttrykker doksycyklin-induserbar shRNA mot rykke kontroll eller DUSP1 fikk doksycyklin i drikkevannet og behandlet med bærerkontroll (saltvann) eller gemcitabin (50 mg /kg, ip, to ganger ukentlig). (A) Kaplan-Meier overlevelse. * P 0,05, sammenlignet med krafse behandlet med gemcitabin;
## p 0,01, sammenlignet med krafse behandlet med saltvann. (B) Q-PCR måling av DUSP1 mRNA-nivåer. (C) TUNEL farging og immunhistokjemisk analyse av CD34, Ki67, og kløyvet caspase 3. Scale, 20 mikrometer. (D) Kvantifisering. Dataene er gjennomsnitt ± SEM fra 3 eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01, sammenlignet med krafse behandlet med saltvann
Etter avtale med
in vitro
funn, gemcitabin behandling økt DUSP1 mRNA nivåer i shRNA-krafse svulster. De fleste av de shRNA-DUSP1 svulster hadde relativt lave nivåer av DUSP1, mens en svulst viste høye DUSP1 nivåer, muligens på grunn av kortere doksycyklin eksponering eller forurensning med tilstøtende ikke-svulstvev når høsting av prøven. Disse resultatene tyder på at doksycyklin hell indusert shRNA uttrykk. Men på grunn av høy variabilitet blant hver mus, forskjellen i DUSP1 nivåer mellom ulike grupper var ikke statistisk signifikant (Fig. 7B).
For å evaluere effekten av DUSP1 taushet gemcitabin behandling på tumor angiogenese, spredning, og apoptose, tumorvev ble deretter analysert ved immunhistokjemisk farging for CD34 (angiogenese) og Ki67 (proliferasjon), samt av terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP Nick ende merking (TUNEL) og spaltet caspase 3 immunoreaktivitet, som begge er markører for apoptose. Gemcitabin svakt dempet CD34 og Ki67-signaler, mens DUSP1 knockdown hadde en markant inhiberende virkning på CD34-farging, og et mer moderat, men svært signifikant hemmende effekt på Ki67-farging (fig. 7C, 7D). DUSP1 lyddemping førte også til økt kløyvde caspase 3 immunoreaktivitets og Tunel signaler, sammenlignet med krafse kontroll svulster, noe som indikerer at det var en økning i apoptotisk celledød følgende DUSP1 knockdown. Økningen i caspase 3 cleavage og DNA-fragmentering var enda større når du kombinerer DUSP1 stanse med gemcitabin (Fig. 7C, 7D). Dermed rettet mot DUSP1
in vivo
førte til trykkes angiogenese og kreftcelle spredning, og forbedret gemcitabin-indusert apoptose.
Diskusjoner
JNK1, -2 og -3 er kodet av
MAPK8
,
MAPK9
og
MAPK10
, henholdsvis, og alternativ spleising gir opphav til minst ti isoformer [9]. I motsetning til p38 MAPK-α, -β, -γ og -δ er kodet av
MAPK14
,
MAPK11
,
MAPK12
, og
MAPK13
, henholdsvis, og det er to alternativt spleisede isoformer av
MAPK14 product: [9]. Globalt, JNK og p38 MAPK spenning aktiverte reaksjonsveier indusere apoptose i noen tilfeller, men forbedre overlevelse i andre, avhengig av celletype-spesifikke forskjeller, intensiteten og varigheten av signal-, og tilstedeværelse eller fravær av krysstale med andre signalveier [9].
i denne studien fant vi ut at gemcitabin aktivert JNK og p38 MAPK, og dermed indusere apoptose i grunnfondsbevis. Mens rollen av spesifikke isoformer ikke ble evaluert, gemcitabin-aktivert JNK og p38 MAPK signal også indusert DUSP1 transkripsjon, noe som gjenspeiles av økte DUSP1 mRNA nivåer og økt RNA polymerase II lasting ved DUSP1 genet kroppen. Videre shRNA-mediert hemming av DUSP1 forbedret gemcitabin-indusert JNK og p38 MAPK-aktivering og lysfølsomt PDAC celler til gemcitabin og cisplatin, som fører til redusert celledeling og økt PARP og caspase 3 cleavage. Disse resultater antyder at gemcitabin-mediert aktivering av JNK og p38 MAPK fører til oppregulering av DUSP1, som i sin tur bidrar til en negativ tilbakekoblingssløyfe som demper JNK og p38 MAPK aktivitet og derved interfererer med de fordelaktige virkninger av gemcitabin på stress-trasé og apoptose (fig. 8). Disse observasjonene øke muligheten for at DUSP1 kan være et potensielt terapeutisk mål for styrke PDAC følsomhet for flere kjemoterapeutiske midler. Videre DUSP1 målretting fører til økte nivåer av p-ERK1 og p-ERK2 [15], og ERK-aktivering i kreft i bukspyttkjertelen celler forbedrer gemcitabin chemoresistance [28]. Dermed gemcitabin-indusert økning i JNK og p38 MAPK aktiviteter er avgjørende for sine pro-apoptotiske handlinger.
gemcitabin aktiverer JNK og p38 MAPK (p38) signal-, som formidler apoptotisk celledød. Aktivert JNK og p38 MAPK deretter oppregulere DUSP1 transkripsjon, noe som negativt modulerer JNK og p38 MAPK signaleringsaktivitet og dempe gemcitabin-indusert celledød. Hemme DUSP1 i kombinasjon med gemcitabin behandling øker betydelig kjemosensitivitet av kreft i bukspyttkjertelen celler.
nedregulering av DUSP1 undertrykker uttrykk for angiogene faktorer, som SH2D2A og VEGF-C i ikke-småcellet lungekreft ( NSCLC) celler, og funksjonelle analyser har bekreftet rolle i å fremme DUSP1 tumor angiogenese [29]. Videre i menneskelige NSCLC prøvene, DUSP1 co-lokaliserer med CD31-positive vaskulære strukturer, og en nær sammenheng mellom økt VEGF-C og DUSP1 uttrykk har blitt vist [29]. Disse resultatene støtter ideen om at DUSP1 kan spille en viktig rolle i tumorangiogenese. Selv om PDAC er karakterisert ved markert desmoplasia og hypoperfusjon, oppviser det også en høy tilbøyelighet til å metastasere via hematogene eller lymfatisk rutene, selv når den primære tumoren er liten [30]. Videre PDAC utstillinger foci av mikro-angiogenese og overuttrykke flere pro-angiogene faktorer, og økt angiogenese, høye serumkonsentrasjoner VEGF-A nivåer, og økt VEGFR-2 uttrykk har blitt korrelert med en dårligere prognose i PDAC pasienter [30]. Sammen utgjør disse rapportene understreker hvor viktig avvik angiogenese i PDAC og implisere DUSP1 som bidrar til denne prosessen.
Ved hjelp av doksycyklin-induserbare knockdown av DUSP1 i etablerte ortotopiske pankreastumorer, i denne studien fant vi ut at å kombinere gemcitabin med DUSP1 inhibering forlenget overlevelse dyr og forsterket apoptotisk celledød, sammenlignet med gemcitabin alene. I tillegg DUSP1 knockdown markert svekket PCC spredning og tumor angiogenese. Vår bruk av immunmangelfull mus utelukker en vurdering av konsekvensen av DUSP1 inhibering på immunsystemet eller på makrofag-nummer og aktivering i bukspyttkjerteltumormassen. Gitt at DUSP1 er kjent for å modulere makrofag spredning og aktivisering [31], studier med syngene eller genmanipulerte musemodeller av PDAC vil være nødvendig for å løse dette aspektet av DUSP1 funksjon i PDAC.
Mekanismene som fører til økt DUSP1 uttrykk i PDAC er ikke kjent. Det har vist seg, kan imidlertid den hypoksi oppregulere DUSP1 transkripsjon [14], og PDAC er en meget desmoplastic tumor med en markert hypoksisk mikromiljøet [5] – [7]. Videre, i nærvær av oksidativt stress induserer E2F1 DUSP1 uttrykk [13], og E2F1 blir oppregulert i PDAC som en konsekvens av RB-dysfunksjon og overdreven aktivering PI3K [32], [33]. Tatt sammen med de foreliggende funn disse observasjonene tyder på at PDAC kan være «primet» for å fremvise økt DUSP1 aktivering i respons til gemcitabin, og tyder på at målretting DUSP1 i PDAC kunne forbedre de fordelaktige virkninger av gemcitabin ved å fremme apoptose og undertrykking av kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon og tumor angiogenese
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Indiana University (Permit Number: 10108).. Alle dyrestudier beskrevet ble utført i samsvar med aksepterte standarder for human dyr omsorg og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Cell Kultur
ASPC-en og BxPC-3 menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler var oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Colo-357 celler var en gave fra Dr. R. Metzger ved Duke University, og ble opprinnelig plassert i kultur av Morgan,
et al
. [34] fra en pasient med metastatisk PDAC. De har blitt brukt i stor utstrekning [15], [35], [36], og ble godkjent av kromosomal analyse. ASPC-1 og BxPC-3-celler ble dyrket i RPMI 1640, og COLO 357-celler ble dyrket i DMEM. Med mindre annet er angitt, ble media supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (komplett medium).
3- (4,5-dimetyltiazol-2- -yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse
MTT-analysen ble utført som beskrevet [35].
Immunoblotting
Immunoblotting ble utført som beskrevet tidligere [ ,,,0],35] med antistoffer mot følgende antigener: PARP, Caspase-3, kløyvde caspase-3 (Asp175), fosfor-p38 MAPK (Thr180 /Tyr182), p38 MAPK, fosfor-JNK (G9), og fosfor-c-Jun ( Ser63) fra Cell Signaling Technology, Danvers, MA; DUSP1 (C-19), MKP2 (S-18), JNK (FL) og ERK2 (C-14), fra Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA.
