Abstract
N-myc nedstrøms-regulert gen 2 (
NDRG2
) er en kandidat tumor suppressor genet, som spiller en viktig rolle i å kontrollere tumorvekst. Hensikten med denne studien var å undersøke uttrykk for
NDRG2
genet i blærekreft (BC) vev og flere blærekreftcellelinjer, og til å søke sin kliniske og patologisk betydning. Ninety-sju blære carcinoma og 15 seksjoner normal blærevevet ble analysert retrospektivt med immunhistokjemi. Den menneskelige blærekreft cellelinje T24 var infisert med LEN-
NDRG2
eller LEN-LacZ. Effekten av
NDRG2
overekspresjon på T24 celler og T24 nakne mus xenotransplantater ble målt via cellevekstkurver, tumorvekstkurver, flowcytometrisk analyse, western blot og Transwell analysen.
NDRG2
ble sterkt uttrykt i normal blærevevet, men fraværende eller sjelden uttrykt i cacinomatous vev (χ
2 = 8,761, p 0,01).
NDRG2
nivå var negativt korrelert med tumor klasse og patologisk stadium (r = -0,248, p 0,05), samt økt c-myc nivå (r = -0,454, p 0,001). Uttrykket av
NDRG2
var lav i de tre BC cellelinjer. T24 celler infisert med LEN-
NDRG2
viste hemming av spredning både
in vitro Hotell og
in vivo
, og
NDRG2
overekspresjon kan hemme tumorvekst og invasjon
in vitro
Citation. Li R, Yu C, Jiang F, Gao L, Li J, Wang Y, et al. (2013) Overuttrykte N-myc Stream-regulert Gene 2 (NDRG2) Regulerer spredning og invasjon av blærekreft Cells
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 8 (10): e76689. doi: 10,1371 /journal.pone.0076689
Redaktør: Raffaele A Calogero, Universitetet i Torino, Italia
mottatt: May 27, 2013; Godkjent: 26 august 2013; Publisert: 16 oktober 2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen arbeidet ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (31070681). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
forekomsten av blærekreft er økende. Anslagsvis 386,300 nye tilfeller og 150,200 dødsfall fra blærekreft skjedde i 2008 på verdensbasis [1]. Hos menn er blærekreft den fjerde vanligste kreftformen først etter prostata, lunge og kolorektal kreft, sto for 7% av alle krefttilfeller i USA [2]. I mer enn 75% av tilfellene, er diagnosen foretatt på et tidlig stadium av sykdommen (trinn Ta og T1). Til tross for å ha fått tilstrekkelig behandling, fem års total overlevelsesrate for patologisk T2 sykdom er 52-77%, T3 sykdom 40-64%, og T4 eller lymfeknute-positiv sykdom 26-44% [3]. Det finnes tall terapeutiske intervensjoner for å behandle denne sykdommen; har imidlertid den totale overlevelsen ikke blitt bedre i løpet av de siste tjue årene. Derfor, for å etablere en ny modus for behandling ved hjelp antioncogene middel til å forbedre overlevelsen av pasienter er svært ønskelig.
N-myc nedstrøms regulere gen 2 (
NDRG2
) tilhører NDRG familie, som inkluderer fire medlemmer:
NDRG1, NDRG2, NDRG3 Hotell og
NDRG4
. Sekvensen homologi i menneske
NDRG
familien er 57-65% og
NDRG
familie har blitt undersøkt i noen av menneskelig kreft og nevrologiske sykdommer [4]. Som et gen for å regulere nedstrøms Myc,
NDRG2
uttrykk har blitt bekreftet å være redusert i mange typer karsinom, inkludert skjoldbruskkreft, leverkreft, meningeom, bukspyttkjertelkreft og prostatakreft [5-11]. Disse studiene tyder på at
NDRG2
kan spille en viktig rolle i å kontrollere sykelighet av karsinomer.
NDRG2
har blitt bekreftet å være involvert i cellevekst og differensiering, i mellomtiden,
NDRG2
uttrykk i høy klasse hjernesvulst har vist seg å assosiere med overlevelse [12,13].
(A) uttrykket nivåer av
NDRG2
protein nedgang mens graden av malignitet av blære carcinoma øker (x400) (1). Normal blæren vev; (2) Blære papilloma (T0-Ta); (3) Høy-nivå blærekreft (T2-T4). (B) Et uttrykk nivåer av c-myc protein øker mens graden av malignitet av blære karsinom øker (x400) (4). Normal blæren vev; (5) Blære papilloma (T0-Ta); (6) Høy-nivå blærekreft (T2-T4). De delene av (B) (4-6) stammer fra de samme parafinblokker som henholdsvis (A) (1-3).
Selv om flere studier har undersøkt funksjonen til
NDRG2
i vanlige svulster, har det ikke vært funksjonell karakterisering av potensielle rolle
NDRG2
genet i blærekreft. Derfor er målet med denne studien var å undersøke hvilken rolle
NDRG2
i human blærekreft. Først undersøkte vi uttrykket av
NDRG2
i menneskelige blære carcinoma vev og i forhold til normal blære vev ved immunkjemi. Vi har oppdaget at ekspresjonsnivået av
NDRG2
i BC-vev var lavere enn i normalt vev. Deretter brukte vi blære kreft cellelinjer som modeller for å evaluere effekten av
NDRG2
på tumorvekst, differensiering og invasjon
in vitro Hotell og
in vivo
. Våre resultater tyder på at
NDRG2
har et potensial antioncogenic rolle i blærekreft.
Materialer og metoder
kliniske prøver
Formalin-fiksert og parafin-embedded blokker av blære carcinoma vev ble tilfeldig samlet inn fra 112 pasienter og kontroller (gjennomsnittsalder 63,4 år, varierer fra 21 til 81 år) fra Institutt for urologisk kirurgi, Xijing Hospital, FMMU (Xi’an, Kina) mellom 2008 og 2011.These prøvene består 15 normale blæren vev, 20 blære papilloma (T0-Ta), 38 lavt nivå blærekreft (TIS-T1) og 39 høyt nivå blærekreft prøver (T2-T4). Skriftlig samtykke ble innhentet fra hvert fag. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Xijing Hospital, Xi’an.
(A) Real-time PCR-analyse av
NDRG2
mRNA uttrykk. (B) Expression nivå av
NDRG2
protein som analysert ved western blot. Alle analysene ble gjentatt uavhengig av hverandre i minst tre ganger. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD (** p 0,001) ..
Immunohistochemistry (SP: streptavidin-perosidase)
Mus anti-human
NDRG2
monoklonalt antistoff og c-myc monoklonalt antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Company (Santa Cruz, USA.). Den immunhistokjemi kit ble kjøpt fra BOOSTER Company (Wuhan, Kina). Den immunhistokjemi farging ble utført i henhold til produsentens anvisninger. Følgende forberedelser ble gjort fra hver vevsblokk. Et lysbilde farget med HE (den patologiske scenen ble sjekket av patologer), en sklie inkubert med anti
NDRG2
antistoff, et lysbilde inkubert med c-myc antistoffet
for nøyaktig å bestemme den positivt uttrykk og for å minimalisere den falske-positive rate, anvendte vi to arbitory semikvantitativ poengsystem for å evaluere graden og intensiteten av fargingen med tre patologer uavhengig av hverandre. Poengene ble definert som følger: (1) graden av farging score: 0 poeng for farging mindre enn 5%, 1 poeng for farging 6% til 25%, 2 punkt for farging 26% til 50%, 3 poeng for farging 51 % til 75%, og 4 poeng for farging 75% (2). Intensiteten av flekker score: 0 poeng for negativ farging, 1 poeng for svakt positiv farging, 2 poeng for moderat farging og 3 poeng for sterk farging (tan). For hver prøve, resultatet stammer fra de to scoring systemer ble multiplisert. Resultatene av bestemmelse ble delt inn i fire nivåer: negativ (0 til 1, -), svakt positiv (2 til 4, +) positiv (5 til 8, + +), sterk positiv (9 til 12, + + +) . Imaging ble utført ved lysmikroskopi (Olympus, Nagano, Japan) og beregnet med statistisk analyse.
Cell Culture
Vi valgte humane T24, 5637 og BIU-87 cellelinjer som skal brukes i pågående etterforskningen. Disse cellelinjene er tidligere bekreftet de aktuelle cellelinjene for forskning av blærekreft. Som vanlig kontroll, vi valgte human blære celle (SV-HUC-1). Alle cellelinjer ble kjøpt fra Cell Bank, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina. Cellene ble dyrket i RPMI1640 (Gibco) supplementert med 10% føtalt bovint serum (Sijiqing Hang, Kina). Alle cellelinjene ble dyrket i sterile betingelser ved 37 ° C og 5% CO
2.
(A) Påvisning av lentiviral infeksjon effektivitet, og fasekontrast (venstre) eller GFP (høyre) bilder var erholdt fire dager etter infeksjon. (B) Real-time PCR-analyse av
NDRG2
mRNA uttrykk i T24 celler. (C) Western blot analyse av
NDRG2
protein uttrykk. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD (** p 0,01) ..
Sanntids Kvantitativ PCR
Den totale RNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp TRIzol reagens (Takara Bio, Japan) og revers transkribert ved hjelp av M-MLV revers transkriptase (Fermentas) i henhold til produsentens anvisninger. Primerne som ble brukt var som følger: GAPDH, 5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3 «og 5′-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3»;
NDRG2
, 5′-GCCCAGCGATCCTTACCTACC-3 «og 5′-GGCTGCCCAATCCATCCAACC-3». Forsterkningen program besto av polymerase-aktivering ved 95 ° C i 30 sekunder og 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, annealing og ekstensjon ved 59 ° C i 30 sekunder. De relative uttrykk nivåer ble normalisert ved hjelp av sammenlignende terskel syklus (2
-ΔΔCt). Real-time PCR utføres ved hjelp CFX96 Touch PCR system (Bio-Rad). Alle ovennevnte forsøk ble gjentatt minst tre ganger.
Western blotting-analyse
Alle cellene ble samlet opp i eksponensiell fase, og deretter det totale protein ble ekstrahert med lyseringsbuffer inneholdende 1% Tween 20, og endelig kvantifisert med BCA-analyse. Lik mengde av proteiner 20 ug ble utsatt for 10% konsentrasjon SDS-PAGE. Proteinene adskilt med SDS-PAGE innenfor gels ble overført på nitrocellulose (NC) membraner (Amersham, St. Giles, UK). Deretter ble NC membranene blokkert med 5% ikke-fettmelk i 1 time ved romtemperatur og deretter inkubert med muse-anti-human
NDRG2
antistoff (1: 800) (Santa Cruz, USA) over natten ved 4 ° C. GAPDH protein påvisning ble anvendt som en intern kontroll. Etter vasking tre ganger, de overførte blottene inneholdende
NDRG2
bånd ble visualisert med pepperrot-peroksidase (HRP) -konjugert anti-mus eller anti-kanin-sekundært antistoff (fortynning 1: 2000, Santa Cruz) i 2 timer ved romtemperatur. De forbedrede Chemiluminescence (ECL) system deteksjonsløsninger (Pierce, NJ) ble deretter påført, og kvantifisert ved Kodak Digital Science ID software (Kodak, New York).
lentivirusinfeksjon
For å produsere lentivirus, 293T celler ble ko-transfektert med plen-GFP-
NDRG2
eller plen-GFP-lacZ, som ble forsterket i
E. coli
DH5, renset ved hjelp av en Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA), og transfektert i 70% sammenflytende 293T celler ved hjelp lipofektamin 2000 (Invitrogen). Lentiviral partiklene ble høstet fra supernatanten 72 timer etter transfeksjon og renset ved ultrasentrifugering. Disse partikler ble heretter referert til som LEN-
NDRG2
, og LEN-lacZ (negativ kontroll). Stabilt infiserte T24 celler ble valgt ved hjelp av blasticidin, ved å telle grønt fluorescerende protein (GFP) -positive celler i henhold til fluorescens mikroskopi (Olympus, Japan) påført på den minimale konsentrasjon av blasticidin, etter en seriell titrering, som kreves for å drepe uinfiserte T24 celler. Cellelinjen ble delt inn i følgende tre eksperimentelle grupper: 1)
NDRG2
gruppe (LEN-
NDRG2
-infected celler), 2) lacZ gruppe (LEN-lacZ-infiserte celler), og 3) CON gruppe (ikke-infiserte celler). Både Real-time PCR og Western blot bekreftet at vi lykkes smittet T24 celler med lentiviral og overekspresjon av
NDRG2
ordentlig etter smitte. Vi har også fastslått den differensielle ekspresjonen av proteiner som korrelerte med cellesyklustrinn, apoptose og cellemigrering og invasjon (cellesyklus protein: cyclinD1, CDK4, celle apoptose protein: p21, cellemigrering og invasjon protein: MMP-2 og MMP-9) .
hemming av cellevekst tester
in vitro
Denne testen inngår MTT analyser, kolonidannelse analyser og flowcytometrisk analyse (FCA) (BD Biosciences, NJ). Hver analyse ble påført på hver av de tre gruppene (blank kontroll; LEN-LacZ, den negative kontroll, og LEN-
NDRG2
, forsøksgruppen). Eksperimentene ble gjentatt fem ganger (1). MTT-analyse: Alle cellene, inkludert de som er infisert, ble dyrket i eksponensiell fase og frittliggende ved trypsinbehandling. Levedyktige celler (2000 celler /ml) ble inokulert i 96-brønners plater, og hver gruppe hadde seks reduplicative brønner. Ved forskjellige tidspunkter, ble MTT-reagens tilsatt 20 ul /brønn (5 mg /ml) og inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 150 ul dimetylsulfoksid (DMSO), etterfulgt av risting i 10 min. Absorbans (A) verdiene ble målt med et enzym autokinetic skalering meter (Bio-Rad, USA) ved 490 nm bølgelengde. Cell vekstkurver deretter ble deretter trukket basert på gjennomsnittlig A-verdier (2). Kolonidannelse analyse: Cellene ble sådd ut i seks-vel-plater (200 celler /brønn) (i tre duplikate brønner) og dyrket ved 37 ° C i 5% CO
2. Etter to uker ble cellene fiksert med metanol i 20 minutter og deretter farget med Giemsa i 20 min. DDH
2O ble anvendt for å vaske cellene tre ganger for å oppnå en ren bakgrunn. Antallet kolonier og celletallet i hver koloni ble tellet og statistisk analysert (3). FCA: T24-celler (1 x 10
6 celler /brønn) ble sådd ut i seks-brønners kulturskåler med lentivirus infisert LEN-
NDRG2
. Tre grupper av celler ble oppsamlet etter 48 timer og 72 timer henholdsvis, og til slutt sentrifugert og fiksert i 95% etanol. Etter inkubering over natten ved 4 ° C, ble cellene farget med 0,5% propidiumiodide (10 ul) i nærvær av 0,01% RNAse A og 0,1% Triton X-100, deretter ble målt med et strømningscytometer.
(A og b) kolonidannelse assay. Oppregulering av
NDRG2
hemmer kolonidannelse. (C) Et cellevekstkurver av T24-celler ved MTT-metoden. Alle analysene ble gjentatt uavhengig av hverandre i minst tre ganger. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD (* = p 0,001).
Migrasjon og Invasion Analyser
Invasion analysen med en Matrigel belagt membran og migrasjon analysen uten Matrigel membranen ble utført ved hjelp av en 24-brønns Transwell innsatser (8 pm pore filtre, BD Biosciences, Bedford, MA), som ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Den eksponensielle faseceller ble høstet og resuspendert (2 x 10
5 celler /ml) i serumfritt medium, deretter sådd og resuspendert i 200 ul kulturmedium i det øvre kammeret. Deretter ble kulturmedium med 20% FBS plassert i bunnen brønnen. Den Transwell ble inkubert ved 37 ° C og 5% CO
2 atmosfære over natten. De T24 cellene ble tillatt å migrere gjennom en porøs til bunnen av membranen. Etter inkubering ble cellene på undersiden av membranen fiksert med metanol i 5 minutter og deretter farget med Kristallviolet. Antallet av invaderende celler eller migrerende celler ble bestemt ved mikroskop ved en 400x forstørrelse på hver membran og beregnet det midlere antall celler per felt. Alle analysene ble gjentas minst tre ganger uavhengig av hverandre.
Vekst Hemming Analyser
i Vivo
Seks uker gamle BALB /c nakne mus ble kjøpt fra Shanghai Experimental Animal Center, Shanghai, Kina. Den LEN-
NDRG2
gruppe og LEN-lacZ-gruppe-celler ble høstet og resuspendert med 1 x PBS og konsentrasjonen ble justert til 5 x 10
7 per ml, 200 ul celle-løsning (1 x 10
7 celler) ble injisert subkutant i venstre flankene av nakne mus. Musene ble tilfeldig delt inn i to grupper: LEN-
NDRG2 Hotell og LEN-LacZ (n = 5 per gruppe). Når gjennomsnittet størrelsen inokulert svulster nådde til 300 mm
3 (som beregnes ved ligningen: V [mm
3] = ab
2/2)
in vivo
, musene ble avlivet ved cervikal dislokasjon og tumorprøver ble oppsamlet, fotografert og målt med hensyn til deres volum og vekt. Musene ble anatomi for å undersøke hvorvidt det var metastasering til et annet organ, og lymfeknute. Ekspresjonen av
NDRG2
protein i de inokulerte svulster i nakne mus ble påvist ved western blot. Andre markører for proteinekspresjon ble også målt, inkludert cellesyklus-protein: cyclinD1, CDK4; celle apoptose protein: p21; celle migrasjon og invasjon protein. MMP-2, MMP-9
(A) T24cells infisert med LEN-
NDRG2
lentivirus var mer åpenbart arrestert i G0 /G1cycle. (B) Prosenter av apoptotiske celler i LEN-
NDRG2
grupper var større enn i de to andre gruppene (1-3). 48 timer etter infeksjonen (4-6); 72 timer etter infeksjonen; (1 og 4) blank kontroll (PBS); (2 og 5) LEN-LacZ; (3 og 6) LEN-
NDRG2
. Alle analysene ble gjentatt uavhengig av hverandre i minst tre ganger. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD
Gruppe NDRG2. (-)
NDRG2 (+)
X
2
verdi
p verdi
Normal tissue312Bladder carcinoma59388.761. 0.01Table 1. Expression of NDRG2 i normale blæren vev og blære carcinoma vev
CSV Last ned CSV
Statistical Analysis
statistiske analysene ble utført ved hjelp SPSS17.0 programvare (SPSS selskap, IN). Alle data er vist som gjennomsnitt ± standard feil som stammer fra minst tre uavhengige eksperimenter. For immunhistokjemi, forskjeller mellom gruppene ble validert ved hjelp Chi-kvadrat tester og Pearson korrelasjon. Variansanalyse (ANOVA), Student-Newman-Keuls (SNK) tester og ikke-parametrisk test ble utført for å finne ut om det var forskjeller mellom resultatene av analysene
in vitro Hotell og
in vivo
analyser. En
P
-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Hyppigheten av positivt uttrykk for
NDRG2
i blære carcinoma vev var 39.17 % (38/97), som var lavere enn i normalt vev blære (80%, 12/15), (χ
2 = 8,761,
P
0,01) (tabell 1).
NDRG2
uttrykk, både frekvens og nivå, ble ikke korrelert med kjønn eller alder, men er omvendt korrelert med patologisk trinn (r = -0,248,
P
0,05) (tabell 2) . Immunhistokjemi viste at
NDRG2
protein positive var flekker i cytoplasma av normale vev og blære carcinoma (figur 1A). Uttrykket nivåer av
NDRG2
i blære carcinoma ble omvendt korrelert med c-myc i blære carcinoma (r = -0,454,
P
0,001). (Figur 1B)
(A) effekten av
NDRG2
overekspresjon på G1 cellesyklus og apoptose regulatorer som analyseres ved western blot. (B) Relativ kvantifisering av protein ekspresjon, normalisert til GAPDH-nivåer. Figuren viser tendensen for hver gruppe som angitt. Alle analysene ble gjentatt uavhengig av hverandre i minst tre ganger. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD (** p 0,01) ..
Clinicopathological
Expression nivå NDRG2
r-verdi
p-verdi
funksjoner –
+
++
+++
Kjønn Mann 401173Female 1912500.320.759Age ≤60years231061 60years 361362- 0.0490.637Grade Papilloma10442Low22961High271020-0.2480.014Table 2. Forholdet mellom ekspresjonen av NDRG2 og blærekarsinom egenskaper.
data er presentert som n (antall prøver). Statistisk signifikans ble evaluert med Pearson korrelasjonskoeffisient test. CSV Last ned CSV
Både western blot og Real-time PCR viste at alle tre BC cellelinjer hadde lavere uttrykk nivåer av
NDRG2
protein og mRNA enn den normale menneskelige blæreceller (SV-HUC-1). Blant de tre BC cellelinjer, T24 celler viste de laveste uttrykket nivåer (figur 2A, B).
(A) invasjon analyse av T24 celler behandlet med LEN-
NDRG2
. Invasjonen evne ble beregnet ved hjelp av Transwell belagt med Matrigel. Den invasivitet av LEN-
NDRG2
gruppe celler var betydelig lavere enn i de to andre gruppene. ** P 0,001. (B) Migrasjon analyse av T24 celler behandlet med LEN-
NDRG2
. Migrasjonen evne ble beregnet ved hjelp av Transwell ubestrøket med Matrigel. Migrasjonen evne LEN-
NDRG2
gruppe celler var betydelig lavere enn i de to andre gruppene. ** P 0,001. (C og D) Ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 ble målt etter T24-celler ble infisert med LEN-
NDRG2
. LEN-
NDRG2
gruppen redusert MMP-2 og MMP-9 uttrykk i forhold til de andre gruppene (** p 0.01).
Group
G0/G1
G2/M
S
Apoptosis
Control48h62.42±2.053.55±0.5534.03±1.655.53±0.6272h69.84±2.602.79±0.4427.73±0.905.57±0.59LEN-LacZ 48h48h64.24±1.923.56±0.5632.21±0.666.49±1.2572h69.63±2.403.08±0.4027.29±0.616.52±1.17LEN-NDRG2 48h48h71.40 ± 0.378.50 ± 0.4720.10 ± 0.3010.25 ± 2.4372h77.61 ± 0.997.05 ± 0.1515.34 ± 0.1712.88 ± 3.01Table 3. Andelen Cell syklus fase og celle apoptose indusert av LEN- NDRG2 på T24 celler.
CSV ned CSV
(A) LEN-
NDRG2
undertrykte veksten av svulster i forhold til LEN-LacZ. i tillegg til unsuppressed tumorvekst, LEN-LacZ gruppen var funnet å ha lymfeknutemetastaser. (B) tumor vekstkurver. (C) prosenter av tumormasser til muse massene i ulike grupper. (D) masser av svulster i to grupper. de kurver og histogrammer ble trukket basert på gjennomsnittsverdier ( . n = 5) i to grupper resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD (*, ** p . 0,001)
det ble vist ved fluorescens mikroskopi at effektiviteten av infeksjonen var høy vesen mer enn 95% (figur 3A). real-time PCR-analyse viste at mRNA uttrykk nivåer av
NDRG2
i LEN-
NDRG2
gruppe var betydelig høyere enn i LEN-lacZ (negativ gruppe) og CON grupper (
P
0,05) (figur 3B). Western blot analyse viste at
NDRG2
protein nivå i LEN-
NDRG2
gruppen var høyere enn i LEN-lacZ og CON grupper (Figur 3C). Den LEN-
NDRG2
også forårsaket overekspresjon av
NDRG2
i T24 celler. Cellevekstkurver og kolonidannelse viste at overekspresjon av
NDRG2
kunne undertrykke veksten av T24-celler mer enn den i de to andre gruppene. I cellevekstkurver analyser, inhibering begynte på den tredje dagen og ble mer tydelig deretter (F≥44.58,
P
0,01) (figur 4). FCA viste at T24 cellene med LEN-
NDRG2
kunne øke andelen av celler i G
0 /G
1 sammenlignet med de LEN-lacZ-grupper og negativ kontroll, noe som indikerer at ovexpression av
NDRG2
hadde gjort T24 celler til å arrestere i G1 syklus (48 h: F = 41.92,
P
0,01; 72 h: F = 24.11,
P
0,01). (Figur 5, Tabell 3.) western blot viste at overekspresjon av
NDRG2
downregulated CDK4 og cyclinD1, mens oppregulere p21 i T24 celler (figur 6a, b).
(A) effekten av
NDRG2
overekspresjon på cellesyklus, apoptose og metastase regulatorer som analyseres ved western blot. (B) Relativ kvantifisering av protein ekspresjon, normalisert til GAPDH-nivåer. Western blot ble analysert med Kodak Digital Science endimensjonal programvare. Figuren viser tendensen for hver gruppe som angitt. Alle analysene ble gjentatt uavhengig av hverandre i minst tre ganger. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD (* p 0,01).
Transwell migrasjons analyser og Matrigel-belagte Transwell invasjons ble utført med T24-celler. De representative mikrobilder ble tatt fra den nedre overflate av transwell filteret, og cellene som migrerte eller invaderte ble farget med Kristallviolet. Som vist i figur 7A, invasiv potensial, som bestemmes ved cellenes evne til å invadere en Matrigel barriere, ble også betydelig undertrykt i
NDRG2
-overexpressing celler (
P
0,01 ). Videre tvunget uttrykk for
NDRG2
i T24 celler undertrykte betydelig migrasjon gjennom transwell (P 0,01). (Figur 7B)
I vestlige blot analyser, sammenlignet med LEN-lacZ gruppe og tomme kontroller, gruppen av LEN-
NDRG2
kan undertrykke MMP-2, MMP-9 protein uttrykk nivå i T24 celle (figur 7C, D). MMP-2 og MMP-9 ble sterkt uttrykt i blærekreft metastaser, slik at
NDRG2
sannsynlig hemmet metastasering av blærekreft ved å regulere uttrykket av MMP-2 og MMP-9.
tumorvekstkurver ble trukket ved å måle størrelsen av svulster. Alle de nakne mus overlevde etter injeksjoner med lentivirus. Den T24 celler ble injisert 2 uker senere, svulstens volum av to grupper begynte å se annerledes ut. Fra tre uker, forskjellen i tumorvolum begynte å vise statistisk signifikant (F≥31.65, s 0,001) (figur 8B). Sammenlignet med LEN-lacZ gruppe, svulsten vekt ved LEN-
NDRG2
var betydelig lettere (F≥39.82, p 0,001) (figur 8D). Forholdet mellom tumorvekt til mus vekten indikerte at den fysiske tilstand av musene i LEN-
NDRG2
gruppe var mye bedre enn den til mus i LEN-LacZ gruppe (F = 39.81, p 0,001) (figur 8C), noe som indikerer at overekspresjon av
NDRG2
kunne undertrykke veksten av tumorer. Ved anatomizing musene, ble ipsilaterale lymfeknutemetastaser vist i LEN-LacZ-gruppe, men ingen andre organer var involvert; Men i LEN-
NDRG2
gruppe ikke noe metastatisk lesjon ble funnet (figur 8A). Western blot viste at
NDRG2
protein ble oppregulert i svulster LEN-
NDRG2
gruppe, og at overekspresjon av
NDRG2
downregulated cyclinD1, CDK4, MMP-2, MMP-9; og oppregulert p21
in vivo plakater (figur 9A, B).
Diskusjoner
Om lag 75% av alle blærekreftpasienter gjentas i løpet av de første 5 årene [14], dette høy grad av tilbakefall av blærekreft og dens betydning metastatisk potensial har gjort pasientenes omsorg og prognose challenge. Derfor, for å øke tidlig diagnose hastighet og også for å etablere nye terapeutiske tilnærminger er sterkt behov gjennom forskning av blærekreft.
NDRG2
er kandidat tumor suppressor genet, og en rekke studier har bekreftet at det spiller en viktig rolle i celleproliferasjon, apoptose og metastase [15,16]. Våre resultater i denne studien innhentet fra blærekreft støtte disse tidlige funnene.
Vi viste at
NDRG2
spiller en viktig rolle i blærekreft som er lik sin rolle i andre ondartede svulster. Immunhistokjemi Resultatene viste at den positive ekspresjonsnivået av
NDRG2
i blærekarsinom vev var signifikant lavere enn i normalt vev blære. Uttrykket nivåer av
NDRG2
redusert som graden av blære carcinoma malignitet økt. Vi fant også at uttrykket av
NDRG2
ble omvendt korrelert med c-myc, lik som sett i andre tumorceller. I mellomtiden har
NDRG2
uttrykk nivåer i blærekreft cellelinjer (T24, 5637 og BIU-87) var lavere enn normal blærecellelinje (SV-HUC-1).
lentiviruses har vært vist seg å være egnet for genterapi, fordi de kan stabil integreres i vertsgenomet for å tilveiebringe langtids ekspresjon av målgen, i tillegg har lentiviruses blitt bekreftet å være progressivt sikker ved utvikling av dels plasmid systemer for vektor produksjon for å forhindre generering av replikering-kompetent virus [17].
Undersøkelser utført av Liu et al. indikerte at
NDRG2
var et nytt mål gen som er regulert av p53 og
NDRG2
mRNA og proteinnivåer kan være oppregulert i en p53-avhengig måte. Og de videre rapportert at stanse av
NDRG2
demper p53-mediert apoptose [18]. I mellomtiden ble det rapportert at
NDRG2
kan opp-regulerer uttrykket av p53 i brystkreftceller [19]. Disse dataene sterkt antydet at
NDRG2
var en viktig faktor i å regulere tumor celle apoptose. I mellomtiden ble CDC20 regulert av p53 til å hemme de maligne kreftceller vokser [20]. Cyclin D1 spiller en viktig rolle i cellesyklusen, bindes til cyklin-avhengige kinaser (CDK4 /6), og fremmer fosforylering av RB1, orchestra progresjon gjennom G1-restriksjonspunktet [21].
NDRG2
kan regulere ekspresjonen av proteiner (P21, cyclinD1 og CDK4) i blærecancerceller ved oppregulering av p53. Vi brukte lentivirus-mediert
NDRG2
overekspresjon strategi for å hindre spredning av T24 celler, for å fremme deres apoptose både
in vitro Hotell og
in vivo
; denne mekanismen har blitt demostracted ved å regulere uttrykket av proteiner p21, cyclinD1 og CDK4, som er viktige i celle apoptose og sykle.
Nylig, flere rapporter tyder på at
NDRG2
kan spille en viktig rolle i hemming av tumormetastase. Det er rapportert at
NDRG2
kunne antagonisere transformerende vekst factorβ1-mediert tumorcelle invasjon ved spesifikt å nedregulere ekspresjonen av matriks-metalloproteinase 2 og laminin 332 sti-komponenter, med samtidig undertrykkelse av Rho GTPase aktivitet i hepatocellulært karsinom [22 ]. MMP-2 og MMP-9 var høye uttrykk i muskel-invasiv blærekreft og metastatisk blærekreft [21,23]. I denne studien, western blot analysen viste at LEN-
NDRG2
i T24 celler var assosiert med signifikant reduksjon i MMP-9 uttrykk og noe redusert MMP-2 uttrykk som tyder på at
NDRG2
-overexpression kan regulere ekspresjonen av MMP-2 og MMP-9 og hemmer invasjon evnen til metastatiske blærekreftceller. Denne konklusjonen ble støttet av både
in vivo Hotell og
in vitro
analyser. Vi har mistanke om at uttrykket av
NDRG2
betydelig undertrykker MMP-2 og MMP-9 ved å regulere NF-kB signalering i blæren kreftceller [24].
I konklusjonen, har vi demonstrerte antioncogenic rollen
NDRG2
i utvikling og invasjon av blærekreft. Siden
NDRG2
er innblandet i mange aspekter av tumorprogresjon, inkludert cellevekst, cellesyklusregulering, invasjon og migrasjon, representerer det et lovende terapeutisk mål for blærekreft. Men flere undersøkelser fortsatt behov for å klargjøre ytterligere mekanismen av
NDRG2
. Forskning i denne retningen vil til slutt gi nye metoder for tidlig diagnose, roman terapi og postoperativ monitor i blærekreft.
