Abstract
I løpet av kreft progresjon, oppstår konkrete genomiske avvik som kan bestemme omfanget av sykdommen og kan brukes som prediktive eller prognostiske markører. Påvisning av spesifikke gen-amplifikasjoner eller delesjoner i én blodbårne eller disseminert tumorceller som kan gi opphav til utvikling av metastaser er av stor klinisk interesse, men teknisk utfordrende. I denne studien presenterer vi en fremgangsmåte for kvantitativ høy oppløsning genomisk analyse av enkeltceller. Celler ble isolert under permanent mikroskopisk kontroll etterfulgt av hi-fi hele genomet forsterkning og påfølgende analyser av fin flislegging matrise-CGH og qPCR. Analysen ble påført på enkeltbrystcancerceller for å analysere den kromosomale regionen sentrert av den terapeutiske relevante
EGFR
genet. Denne metoden gir presis kvantitativ analyse av kopinummervariasjoner i encellete diagnostikk
Citation. Hannemann J, Meyer-Staeckling S, Kemming D, Alpers jeg, Joosse SA, Pospisil H, et al. (2011) Kvantitativ høy oppløsning Genomisk Analyse av enkeltkreftceller. PLoS ONE 6 (11): e26362. doi: 10,1371 /journal.pone.0026362
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 17 august 2011; Godkjent: 25 september 2011; Publisert: 30.11.2011
Copyright: © 2011 Hannemann et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Bundesministerium Fur Bildung und Forschung (BMBF FKZ: 01ES0724, https://www.bmbf.de/de/1398.php). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
I løpet av kreft dannelse og progresjon, celle populasjoner med forskjellige genetiske avvik oppstår som representerer unike kliniske enheter som bærer spesifikke terapeutiske mål [1], [2]. Et fremtredende eksempel er genet geometriske sted for den epidermale vekstfaktor-reseptor (
EGFR
), som er en nøkkelspiller i tumorbiologi og et viktig mål for individuell behandling av kreft. DNA kopiere numre for enkelt locus betydelig bestemme fenotype av kreftceller og er indikatorer for pasientens respons på kjemoterapi eller strålebehandling [3]. Antistoffer og lavmolekylære inhibitorer har blitt utviklet for å svekke EGFR-tyrosinkinase-aktivitet i ulike tumortyper [1] – [3]
fleste tumorer kan bli fullstendig fjernet ved operasjon, og er derfor utilgjengelig for gjentatt sampling for å overvåke enten behandling. respons eller behandlingsinduserte endringer i genomiske avvik eller sykdomsprogresjon, henholdsvis. Nylig, kan disse viktige prosessene vurderes ved påvisning av blodbåren kreftceller eller spres tumorceller (DTC) i benmarg, så fremtredende homing orgel og store området av utilslørt metastaser hos kreftpasienter. Den molekylære analyser av disse cellene kan avsløre unike informasjonen for å skreddersy terapier hindre metastatisk progresjon [4], [5].
Derfor har vi utviklet en metode for en pålitelig høy oppløsning kvantitativ genetisk analyse av isolerte enkelttumorceller på eksempel på
EGFR
genet. Etter anrikning ble cellene isolert ved mikromanipulasjon og påfølgende lineære hele genomet amplifikasjon ble utført. Evaluering av denne prosedyren har blitt gjort av fine fliser matrise-CGH og kvantitativ PCR for å fastslå nøyaktig amplitude og utvidelse av
EGFR
amplicon i enkelttumorceller.
Resultater
Mikromanipulasjon og hele genomet forsterkning av enkeltceller
den menneskelige mammary adenokarsinom cellelinje MDA-MB-468 ble valgt som passende modell for metode evaluering, siden det havner en
EGFR
forsterkning og viser sterk EGFR overekspresjon samt viser et stemness /forpliktet stamcelle fenotype [6], [7]. Men graden av forsterkning varierer mellom cellene. For hele genomet forsterkning (WGA), ble ikke-faste eller litt faste celler hentet fra glassoverflaten ved hjelp av en micromanipulator utstyrt med en kapillær designet til våre spesifikke krav. Celler ble overført i en vandig rundt på en C
18-silan-belagt glass pinne bærer en flekk av tørket fullstendig cellelyse buffer (se online metoder). Cellelysatet på glass pinnen ble direkte overført til en reaksjonsrøret som allerede er fremstilt med prøvebuffer for WGA for å unngå ethvert tap av genomisk materiale. Fremgangsmåten er basert på fler forskyvning amplifikasjon ved anvendelse av tilfeldige heksamerer og korrektur DNA-polymerase Phi29 for å sikre lineær amplifikasjon [8]. En enkelt celle som trekkes ut ved 2,04 til 2,96 ug PCR-forøkbare DNA (gjennomsnitt: 2,42 ug, SD 0,26), som er overlegne i forhold til resultatene som tidligere er beskrevet [9]
overføringseffektivitet av mikromanipulasjon og gjengivelse av WGA. av en enkelt celle inkludert
EGFR
locus på ca 4,5 MB ble validert med mikro PCR. Mikro loci har blitt tilpasset fra Tidow et al. [10] og detaljert informasjon er gitt som tilleggsinformasjon (tabell S1, S2). Alle mikro loci kunne verifiseres.
beskrivelse av EGFR amplicon i enkeltceller med fin flislegging rekke CGH
For å kontrollere for lineær forsterkning av DNA-sekvenser av WGA og undersøke strukturen i
EGFR
fragment, analyserte vi regionen husing
EGFR
gen av en høyoppløselig to farger fine fliser matrise-CGH (Roche NimbleGen Inc., Madison, WI, USA). De spesialdesignede oligonukleotid arrays med 15 bp median probe avstand dekke en genomisk sekvens på omtrent 4,7 MBP på kromosom 7p11.2, inkludert
EGFR
genet i seg selv, og to referanse regionene på kromosom 2 og kromosom 10 av ca. 200 kbp lengde hver [11]. Generelt har disse referanseområdene viser bare mindre genomiske avvik. En korrelasjon plott som sammenligner signalintensitetene mellom hybridisering av det amplifiserte DNA oppnådd fra en enkelt celle i forhold til genomisk DNA oppnådd fra 500 celler indikerer påliteligheten av preparatet, pre-forsterkertrinn og matrise hybridisering (figur 1c).
a: Array-CGH plott av genomisk DNA fra forskjellige brystkreft cellelinjer med forskjellige
EGFR
genet kopiantall. b: Array-CGH plott av WGA forsterket DNA fra 500 MDA-MB-468 eller enkelt MDA-MB-468 celler (kjøpes på ATCC), henholdsvis. Den delen av
EGFR
genet er avbildet i grønt. c: Korrelasjon plott av signalintensitetene fylte etter hybridisering å sammenligne signalene fra DNA fra en enkelt MDA-MB-468 celle til de signaler som oppnås fra DNA isolert fra 500 MDA-MB-468-celler. Spots avbildet i gult representerer signalene utenfor fragment regionen, mens flekker angitt av den blå fargen representerer de signaler som oppnås ved amplicon region på kromosom 7.
Data analyser av cellelinjer frakte
EGFR
amplifikasjoner (MDA-MB-468, A431, og BT20) viste et fragment på kromosom 7 som består av en hoveddel som inneholder hele
EGFR
genet. Det sentrale element er utvidet i retning telomeric med en skarp kant ved den ende (figur 1 a, b), noe som indikerte at amplikonet initieres ved en distinkt DNA-sekvens. Fra enkelt celle analyse av MDA-MB-468-celler som viser forskjellig
EGFR
kopitall, ble de nøyaktige grensene amplikon beregnet ved glatting funksjon av den Quantsmooth algoritmen [12]. En ytterligere utvidelse av amplikonet ble funnet i MDA-MB-468-celler med det høyeste antall kopier gevinst (32 eksemplarer), som viser en ytterligere sekvens forlengelse på centromeric området (figur 1b). Dataene ble validert av kvantitativ SYBR-grønn PCR bruker line1 repeterende sekvenser som en iboende konstant kopi kontroll [13] (tabell S3 og S4). Denne tilnærmingen muliggjør reproduserbar absolutt kvantifisering DNA i en enkelt celle, som ikke er blitt rapportert så langt.
Beskrivelse av EGFR-amplikon i enkle celler ved qPCR
Vårt neste mål var å utvikle en pålitelig analyse som kan bistå terapi beslutninger i klinisk rutine. Resultatene av fine fliser matrise-CGH har vist at de forsterkede regionene forskjellig lengde avhengig av graden av amplifikasjon av hele regionen (figur 1), men i alle tilfeller,
EGFR
genet i seg selv er inkludert. Basert på kopitall nivåer fastsatt av fine fliser rekke analyse, standardisert vi absolutt qPCR målinger for
EGFR
eksoner 4, 7, 9, 15 og 21 og den ikke-kodende 5′-sekvens av amplicon i posisjon 54.485.000 i en SYBR grønn analyse for å nøyaktig beskrive
EGFR
presiseringer i en enkelt celle (tabell S5). PCR effektivitet varierte mellom 98,07% og 99,02% (gjennomsnitt: 98,78%, SD 0,36). Alle analyser viste konsistente resultater som vist i figur 2a. I klinisk rutinemessig, hvor en enkel og robust assay er ønskelig, til reduksjon av disse PCR-reaksjonene ekson 7 og 9, og ved den 5′-ende-sekvensen er tilstrekkelig
a:. Kvantitativ PCR-analyser for forskjellig
EGFR
eksoner i MDA-MB-468 kloner b: kalibrerings~~POS=TRUNC kurver av qPCR analyser for LINE-en kontroll og
EGFR
eksoner 7 og 9, som viser at forsterkning effektiviteten av kontrollen som vel som prøve-DNA er like. c, d: Resultater av qPCR-analyse av exon 7 og 9 i enkle tumorceller fra kreftpasienter. c: boksplott av qPCR målinger av 10 ikke-tumorøse celler fra 3 forskjellige pasienter. Medianen av verdiene målt i ikke-tumorceller er omtrent 0,9 (horisontal linje i boksene). -Verdier over 95% tillitsgrensene 1,377 og 1,679 anses å være vinning av exon 7 og 9, respektivt. De enkle sorte prikkene representerer verdiene målt i tumorceller fra pasientprøver, i henhold til tabellen gitt i d.
Genomisk heterogenitet i blodbårne kreftceller og DTC populasjoner fra enkeltpasienter
for å undersøke, om dette integrert tilnærming utviklet og optimalisert ved hjelp av MDA-MB-468 celler, som modellen er også egnet for analyser av pasientprøver, testet vi blodprøver og beinmargsprøver av pasienter med metastatisk brystkreft. Celler ble fremstilt som tidligere beskrevet [5], [14]. Cytokeratin og EpCAM-antistoffer blir brukt som markører for påvisning av blod-bårne eller disseminert kreftceller [5]. Vi har isolert flere enkeltceller, farget med antistoffet A45B /B3, fra forskjellige pasientprøver ved mikromanipulasjon og utført WGA som beskrevet ovenfor. WGA ga i 1,96 til 2,84 ug DNA (gjennomsnitt: 2,36 ug, SD 0,25), som kan sammenlignes med avkastningen innhentet fra enkelt dyrkede celler. WGA ble kontrollert ved anvendelse av LINE1 DNA [13], noe som ga et gjennomsnitt på 330 ng (intervall 3 ng-621 ng, SD 211) amplifikasjonsprodukt og tillot nøyaktig beregning av PCR-forøkbare DNA i hver prøve. Fra hver pasientprøve, analyserte vi fire celler av qPCR for eksoner 7 og 9 (figur 2) og 5′-ende-sekvens (data ikke vist). Verdiene av
EGFR
målinger i ikke-kreftceller har en median på ca 0,9 i begge qPCR analyser, noe som forventes å reflektere normal kopi nummer av 2 (boksplott av figur 2c). Sammenlignet med disse verdier, en tredjedel av cellene viste en høy
EGFR
amplifisering av i det minste fem ganger (p 0,0001), og ca 25% av prøvene viste en forsterkning mellom 2- og 3-fold (p 0,001). De detaljerte resultater for de enkelte celler er vist i figur 2c og 2d. En prøve viste ikke konsistent mellom målingene i eksoner 7 og 9. For denne prøven, utførte vi ytterligere qPCR målinger på eksoner 4, 15 og 21, som alle viser en vanlig kopitallet for den respektive locus. Ingen enkelttumorcelle presentert med en «normal» genkopitallet. Kreftceller uten forsterkning av EGFR-genet viste lav kopitallverdier ( 0,7). Disse verdiene er heller forventet å være forårsaket av variasjon i WGA fremgangsmåte enn ved tekniske gjenstander av qPCR, ettersom den beregnede start mengde DNA fra de fleste prøver påført på qPCR reaksjonen ( 40 s) er tilstrekkelig for pålitelige målinger og er i størrelsesorden av kalibreringskurvene som er vist for LINE1 indre kontroll (figur 2d).
diskusjon
Formålet med studien var å utvikle en protokoll som tillater kvantitativ analyse av genomisk enkelt tumorceller. Primære tumorceller av epitelial opprinnelse er heterogene. Det er blitt spekulert i at kun en liten andel av disse cellene vise spesifikke «stamcelle – som» funksjoner, og kan gi opphav til metastaser (oversikt i [15]). Disse cellene kan være kjennetegnet ved bestemte genomiske avvik som vil gi dem med vekst fordeler og en mer aggressiv fenotype. Dette synet støttes av data fra EGFR-hemmer studier som sådan, EGFR-mutert adenokarsinom representerer et unikt klinisk enhet nødvendig molekylær diagnostikk for terapi veiledning [1]. Videre generering av terapi-resistente cellekloner ytterligere EGFR mutasjoner eller amplifikasjoner under behandling, så vel som overekspresjon og amplifikasjon av EGFR regulerende gener, f.eks ERFI1, har allerede blitt rapportert [2], [16] Derfor, den genomiske undersøkelse av enkelttumorceller som enten befinner seg i blodet eller i benmargen kan bidra til å forbedre prediktive molekylær diagnostikk. Særlig brystkreft, synes EGFR signale å bli oppregulert i basal-lignende tumorer (trippel-negativer), spesielt i celler med stamcelle lignende funksjoner [6], [7], [17], [18]. Foreløpige eksperimentelle data finnes det benetits fra EGFR-målrettet terapi av cetuximab eller laptinib er knyttet til EGFR forsterkingsnivået [6].
Flere forskningsgrupper har undersøkt muligheten for å analysere en enslig tumorcelle på det molekylære nivå [19] , [20]. Det har vist seg at genomet brede påvisning av avvik ved anvendelse av BAC-matriser er mulig i leukocytter og cellelinjeceller [21]. Videre studier av Stoecklein et al indikerte en divergens mellom primær og systemisk sykdom [19] i esophageal kreftpasienter, som påfallende viser behovet for analyse av enkelt spres tumorceller.
I vår studie, vi valgte MDA-MB-468 cellelinje-modell for å utvikle protokollen på grunn av forskjellige stabile EGFR forsterkningsnivåer i forskjellige kloner av denne cellelinje. Ved denne, disse cellene eller annen måte etterligner den heterogene
in vivo
situasjon og tjene som et godt balansert kontroll for bestemmelse av genet kopinivåer. Vi kan vise at det amplifiserte DNA oppnådd fra en enkelt celle er av tilstrekkelig kvalitet til å bli brukt i en høy oppløsning fin-flislegging rekke analyse. Profiler av enkeltceller vise mer bakgrunn, men sammenlignet med profiler fra genomisk DNA fra cellepopulasjonen de samme fragment grenser klart kan identifiseres. Genome bredt arrayCGH analyse gir en god oversikt om genom brede avvik innenfor en enkelt celle, men kvantifisering av de genomiske endringene er begrenset. En qPCR tilnærming kan ikke brukes til å screene for nye avvik, men gjør oss i stand til å kvantifisere kjente, potensielt klinisk relevant forsterkning og slettinger. Ved bruk av qPCR teknikk, kan forskjeller i genkopitallet være klart skjelnes samt på nivået av genomisk DNA fra en pool av celler som på det amplifiserte DNA oppnådd fra en enkelt celle. Vi kunne vise at celler hentet fra en individuell pasient er heterogene om deres EGFR-genet forsterkning. Analysen av bare en eller to celler per blodprøve kan derfor føre til resultater som ikke gjenspeiler den sanne klinisk situasjon. Analyse av så mange celler som mulig er viktig å identifisere de celler som ikke kan angripes av en bestemt behandling på grunn av heterogeniteten av cellepopulasjonen. Dette funnet, hvis bekreftet i en større kohort av prøvene, kan gi ny innsikt i biologien til metastase og kan bidra til å forklare svikt av målrettede terapier i en signifikant andel av pasienter.
Anvendelse av en kvantitativ PCR-analyse viser en robust og kostnadseffektiv metode som kan etableres under rutinemessige forhold. Sammenlignet med anvendelse av fine-flislegging-mikromatriser, som er mer kostnadskrevende og mindre robust når det gjelder tolkningen av dataene, kan denne metoder potensielt brukes i klinisk rutinemessig for den molekylære undersøkelse av enkeltceller. Denne metoden for første gang viser en grei metode for å kvantifisere DNA-mengde av en spesifikk genomisk region fra en enkelt celle.
Etter dette presenterer vi en pålitelig metode for absolutt kvantitativ bestemmelse av genkopier i enkelt cancer celler isolert fra perifert blod eller benmarg fra kreftpasienter. Denne metoden kan ikke være begrenset til å undersøke biologi spre kreftceller, men kan også bli et nytt verktøy for vurdering av encellete genomikk med bred anvendelse i mange områder av eksperimentell forskning. Videre kan fremtidige kliniske applikasjoner tenkes. Utover den undersøkelse av
EGFR
genet, vår metode kan tilpasses til å vurdere andre molekylære mål (f.eks HER2 [21]), og for å analysere kreftceller i andre cytologiske prøver, hvor den lave prosentandelen av tumorceller grenser de genomiske analyser av dagens metoder.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Fra pasienter som har gitt blodprøver, skriftlig informert samtykke er innhentet. Fra beinprøver marg samlet inn etter obduksjon, ble skriftlig godkjennelse gitt av familiemedlemmer. Bruk av medisinske poster, ble blod og benmarg godkjent av etisk komité av Medical Board Hamburg (referansenummeret # 190504).
Cellelinjer og dyrking
brystkreftcellelinjer MDA -MB-468, BT-20, og MCF-7, så vel som den karsinomcellelinje A431 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i DMEM med 5% varme-inaktivert føtalt kalveserum ved 5% CO
2. Cellene ble dyrket til 70% til 80% konfluens før innhøsting og transport til lysbilder for enkelt celle plukking.
Immunocytochemistry
celler ble inkubert i 45 minutter med det primære antistoffet A45B /B3 (Micromet, Munchen, Tyskland) etterfulgt av et vasketrinn og en 30 minutters inkubering med et kanin-anti-mus-antistoff brodannende (Z0259, Dako, Glostrup, Danmark). Detection er utført med monoklonalt muse APAAP kompleks (Dako, Glostrup, Danmark) og BCIP /NBT som kromogen substrat i henhold til produsentens protokoll (BioRad, Hercules, CA, USA).
Pasientprøver
pasient~~POS=TRUNC materialet~~POS=HEADCOMP ble hentet fra University Medical Center Hamburg-Eppendorf i Tyskland. Archival beinmargsprøver på cytospins ble brukt. Fra pasienter som har gitt blodprøver har blitt innhentet skriftlig informert samtykke. Disse prøvene ble tatt fra pasienter som gjennomgår obduksjon og som familiemedlemmene hadde gitt skriftlig samtykke til å ta benmargsprøver for forskningsformål. Denne prosedyren har blitt godkjent av den lokale etiske komiteen. Fra pasienter som har gitt blodprøver har blitt innhentet skriftlig informert samtykke.
berikelse prosedyre for blodbårne kreftceller og DTC
Benmarg prøver og perifere blodprøver har blitt behandlet av en Ficoll- densitetsgradient for å berike mononukleære celler og muligens epitelceller tumorceller som tidligere beskrevet [12]. Kort tid, ble benmargsprøver hentet fra øvre hoftekam av nål aspirasjon og lagret i heparin-behandlet rør. Mononukleære celler, inkludert tumorceller ble separert ved Ficoll-Hypaque-gradientsentrifugering tetthet med en tetthet på 1,077 g /ml. 7 × 10
5 celler ble cytospun på glassplater, tørket ved romtemperatur og lagret ved -80 ° C.
Overføring av enkeltceller
1. Silanisering av glassbrikker.
Glass pinner med en diameter på 1,9-2,3 mm ble skylt i en time ved 85 ° C i en løsning av 10% neodisher Laboclean FT (Dr. Weigert, Hamburg, Tyskland). HPLC-rent vann ble benyttet for alle fortynning og vasketrinn. Etter tørking ble pinner svaiet i H
2SO
4 (98%, Merck, Darmstadt, Tyskland) i en time ved romtemperatur og skylles i vann. Pinner ble tillatt å tørke i 15 minutter ved 110 ° C og deretter svaiet i 0,5% octadecyltrichlorsilane i oktan fraksjon (Fluka, Erlangen, Tyskland) i to timer. Etter inkubering i 96% etanol i en time, ble rester av etanol og silan fjernet ved skylling med vann grundig og kraftig. Sticks kan lagres tørt og mørkt i opptil åtte uker.
2. Lyseringsbuffer.
lyseringsbuffer er sammensatt av 0,25% N-lauroylsarkosin, 2 M guanidiniumtiocyanat, 0,01 M natriumcitrat pH 7,0, og 1% dimetylsulfoksyd i HPLC-rent vann. Bufferen ble sterilisert ved filtrering gjennom et 0,2 um filter PES (VWR, Darmstadt, Tyskland) og lagret ved -20 ° C inntil bruk.
3. Stick preparat.
Før bruk, ble DTT tilsatt til lysis buffer til en sluttkonsentrasjon på 60 mM. Den komplette lyseringsbuffer ble fortynnet 1:10 med HPLC-rent vann. Til den ene ende av hver pinne glass, ble 0,2 pl med fullstendig lysis buffer påført og tillatt å tørke ved værelsetemperatur inntil fullstendig tørrhet. De resterende salter nå utgjør den såkalte «Lysospot».
4. Enkelt celle plukking
Deretter ble cellene samlet ved bruk av en micromanipulator. Den microinjector Celltram Vario og micromanipulator TransferMan NKII (Eppendorf Instruments, Hamburg, Tyskland) ble utstyrt med en spesialdesignet, fleksibel kapillær customTip typen III med en indre diameter på 40 mikrometer og en skrå ende (45 °), utviklet i nært samarbeid med Eppendorf Instruments. Cellene ble overført fra glass skyve under visuell kontroll av en kjernefysisk fluorescerende DAPI flekker for å sikre at hele kjerner ble tatt til fange. For å hindre tap av materiale under overføring og cellelyse ble cellene plassert direkte ut av kapillært på silan-belagt glass pinne bærer Lysospot. På grunn av den silan-belegg, vil DNA-binding til glasset forhindres. Videre er salter av Lysospot konsentrert til et svært lite område på grunn av endringer i overflatespenning på grunn av belegget. Den komplette Lysospot blir aktivert ved oppløsning på grunn av den omgivende vandige under overføringen av den manipulerte celle. Den celle-inneholdende glass stokk ble overført til en 200 pl PCR-reaksjon inneholdende 9 pl prøvebuffer av den Genomiphi V2 forsterkersett (GE Healthcare Europa, Freiburg, Tyskland), og overført til -80 ° C i 15 minutter. Etter tining, ble 0,1 mL protease-oppløsning (Qiagen, Hilden, Tyskland) tilsatt, etterfulgt av en inkubasjon trinn på 15 minutter ved 50 ° C for protein fordøyelse og en ytterligere inkubasjon trinn på 15 minutter ved 75 ° C for enzym deaktivering.
Whole Genome Amplification
Hele genomet forsterkning ble utført med Genomiphi V2 kit (GE Healthcare Europe, Freiburg, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll med følgende modifikasjoner: glasset stick forblir i reaksjonsrøret under forsterkning. Amplifikasjonsreaksjonen ble tillatt å løpe i 150 minutter ved 30 ° C i et totalvolum på 20 ul. WGA produktet ble ryddet opp med NucleoSEQ spin kolonner (MACHEREY-NAGEL, Düren, Tyskland) og DNA-konsentrasjoner ble målt ved Nanodrop1000 (Peqlab, Erlangen, Tyskland).
mikro Detection
allel status av de polymorfe gjentakelser ble undersøkt ved hjelp av PCR-amplifikasjon etterfulgt av separering på enten en 2% agarosegel eller kapillær elektroforese. Reaksjonene ble utført i et totalt volum på 10 pl under de betingelser som er gitt nedenfor (Tabell S1) på en Mastercycler gradient (Eppendorf Instruments, Hamburg, Tyskland). Glødetemperaturen ble justert i henhold til primerne som anvendes som vist i Tabell S2. Separasjonen ble utført ved hjelp av en fire-farge laser-indusert fluorescens kapillær elektroforese system (AbiPrism 3130, Applied Biosystems, Wilmington, GE, USA) utnytte Genescan Standard ROX-500 for fragment lengde evaluering. Evalueringen ble utført ved hjelp Genemapper v2.03 evalueringsprogramvaren (Applied Biosystems, Wilmington, DE, USA).
Fin teglstein Array Analyse
Den fine fliser matrisen er designet av NimbleGen (Roche NimbleGen Inc. , Madison, WI) som beskrevet tidligere [22] i henhold til våre tilpassede parametere (Tabell S6). Baser som er en del av repeterende elementer har blitt fjernet fra å bli vurdert for probe design. Videre ble de merkede prober ikke lov til å inneholde tvetydige nukleotid-koder. Andre kriterier: glødetemperatur på 76 ° C, sonde lengde mellom 50-75 bp, ble sonden lov til å bare matche én gang i hele genomet ifølge Human Genome montering mars 2006 (hg18), http: //genome.ucsc. edu (tabell S6), og probene ideelt sett i gang med en forskyvning på 15 bp. Med disse spesifikasjonene, kan om lag 395.000 sonder bli oppdaget på en rekke. Grensene til amplikonene for de forskjellige MDA-MB-468-cellekloner ble beregnet ved hjelp av utjevnings funksjon av den Quantsmooth algoritmen [12] og validert etterpå ved kvantitativ real-time PCR. For dette formålet, var et samlet beløp på 53 SYBR grønn analyser designet flankerer den beregnede start- og endepunkter dele de samme spesifikasjonene. Analysene ble utviklet for å amplifisere snevre genomiske sekvenser av 50-150 bp i lengde for å sikre spesifikk kvantifisering. Kromosom 2 og kromosom 10 ble anvendt som en stabil referanse regioner ifølge Naylor
et al.
[11]. Om nødvendig, ble det beregnet start- og endepunkter korrigert basert på rekken CGH tomten og qPCR resultatene.
Kvantitativ RT-PCR
Kvantifisering av gjennomsnittlig genkopitallet av
EGFR
ble utført med spesifikke primere rettet mot enkeltsekvenser 50-150 bps innenfor ulike eksoner av
EGFR
genet som gitt i tabell S3. PCR-reaksjoner ble utført på en Mastercycler epgradientS Realplex4 under de betingelser som er gitt i tabell S4in et totalvolum på 15 ul. Hver prøve ble målt in triplo. En separat kalibreringskurve ble generert for hver som si i hvert forsøk ved bruk av leukocytt-DNA fra den samme pasient som strekker seg 10 til 0,15 ng pr reaksjon. DNA-konsentrasjonen ble normalisert med henvisning til den konstante kopitallet henvisning LINE1 [13]. Melting analyser ble utført etter hvert løp for å verifisere entall produkt forsterkning.
EGFR
gen kopiantall er bestemt ved å beregne forholdet mellom DNA beløpet i
EGFR
region dividert med den DNA mengde i referanse regionen. En normal, diploid genkopitallet ideell reflektert av en (2n /2n), tre kopier av
EGFR
gen forventes rundt 1,5 (3n /2n). For å beregne den cut-off for å kalle en prøve oppnådd, ble 95% konfidensgrenser av referanseverdiene som brukes (). Alle målinger over den øvre grensen ble ansett som et
EGFR
genkopitallet gevinst.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
PCR-protokollen for mikro PCR.
doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s001 product: (PDF)
Tabell S2.
Oversikt over sekvensene av mikro primere.
doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s002 product: (PDF)
tabell S3.
PCR primerpar for qPCR av
EGFR
genet.
doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s003 product: (PDF)
Tabell S4.
PCR protokoll for
EGFR
-qPCR.
doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s004 product: (PDF)
Tabell S5.
PCR primerpar på kromosom 7.
doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s005 product: (PDF)
Tabell S6.
contigs for matrisen design.
doi:. 10,1371 /journal.pone.0026362.s006 product: (PDF)
Takk
Vi takker A. Bauche og O. Mauermann for utmerket teknisk assistanse
