Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er en dødelig sykdom, og derfor effektiv behandling og /eller forebyggende strategier er sterkt behov. Målene med denne studien var å undersøke de molekylære mekanismer som embelin hemmet human bukspyttkjertelkreft cellevekst
in vitro
, og xenografter i Balb C nakne mus, og bukspyttkjertelkreft cellevekst isolert fra Kras
G12D transgen mus. XTT-analyser ble utført for å måle cellenes levedyktighet. ASPC-1-celler ble injisert subkutant i Balb c nakne mus og behandlet med embelin. Celleproliferasjon og apoptose ble målt ved Ki67 og TUNEL-farging, respektivt. Ekspresjonen av Akt, og Sonic pinnsvin (Shh) og deres mål genprodukter ble målt ved immunohistokjemi og Western blot-analyse. Effektene av embelin på kreft i bukspyttkjertelen celler isolert fra 10-måneder gamle Kras
G12D mus ble også undersøkt. Embelin hemmet celleviabilitet i bukspyttkjertelkreft ASPC-en, PANC-en, MIA PACA-2 og Hs 766T cellelinjer, og disse hemmende effekter ble blokkert enten ved konstitutivt aktiv Akt eller Shh protein. Embelin-behandlede mus viste signifikant hemming i tumorvekst som ble assosiert med redusert ekspresjon av markører for celle-proliferasjon (Ki67, PCNA og Bcl-2) og cellesyklus (cyklin D1, CDK2 og CDK6), og induksjon av apoptose (aktivering av caspase-3 og spaltning av PARP, og økt ekspresjon av Bax). I tillegg embelin hemmet ekspresjon av markører for angiogenese (COX-2, VEGF, VEGFR, og IL-8), og metastase (MMP-2 og MMP-9) i tumorvev. Antitumor aktivitet embelin var forbundet med hemming av Akt og Shh trasé i xenografter, og kreft i bukspyttkjertelen celler isolert fra Kras
G12D mus. Videre embelin også hemmet epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) med opp regulerende E-cadherin og hemme uttrykket av sneglen, Slug, og ZEB1. Disse data tyder på at embelin kan hemme kreft i bukspyttkjertelen vekst, angiogenese og metastase ved å undertrykke Akt og Shh trasé, og kan utvikles for behandling og /eller forebygging av kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Huang M, Tang SN, Upadhyay G, Marsh JL, Jackman CP, Shankar S, et al. (2014) Embelin undertrykker veksten av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen xenografter, og kreft i bukspyttkjertelen celler isolert fra Kras
G12D Mus ved å hemme Akt og Sonic Hedgehog Pathways. PLoS ONE 9 (4): e92161. doi: 10,1371 /journal.pone.0092161
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: May 11, 2013; Godkjent: 19 februar 2014; Publisert: 02.04.2014
Copyright: © 2014 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av svært aggressive ondartede sykdommer over hele verden . Den samlede 5 års overlevelse av denne dødelige sykdom er mindre enn 5% [1]. På grunn av sine invasive og metastatiske egenskaper, og lt; 10% av pasientene er kvalifisert for kirurgi ved diagnosetidspunktet. Den dårlig prognose av sykdommen er relatert med sen presentasjon, aggressiv lokal invasjon, og tidlig metastasering. Konvensjonell kjemoterapi og strålebehandling er generelt ineffektiv, og fremveksten av resistens er vanlig [2], [3]. Gemcitabin er et potent anticancer medikament godkjent for behandling av kreft i bukspyttkjertelen, men responsraten er svært dårlig. De store mangler av dagens gemcitabin terapi er den raske metabolsk inaktivering og smalt terapeutisk vindu. FOLFOX kjemoterapi (folinsyre, 5-flurouracil og oksaliplatin) blir ofte brukt for behandling av kreft i bukspyttkjertelen med begrenset suksess. Flere faktorer er assosiert med øket risiko for kreft i bukspyttkjertelen, og disse inkluderer diabetes, kronisk pankreatitt, før gastrisk kirurgi, røyking, stråling, og spesifikke gen polymorfier [4], [5]. Arve og flere ervervet genmutasjoner (f.eks Kras) er vanlig i pankreastumorer [6]. Mutasjoner i cyclin-avhengig kinase inhibitor p16, har tumor suppressor genet
p53, etter og SMAD4 også blitt identifisert [7], [8]. Derfor forstå patogenesen av preinvasive scenen, og utvikle effektive strategier for å forebygge og /eller behandle kreft i bukspyttkjertelen er av avgjørende betydning.
Embelin, avledet fra frukten av
Embelia Ribes
Bur anlegg (fredløsfamilien), har blitt vist å ha anticanceraktivitet [9]. Selv om det opprinnelig ble oppdaget som en XIAP inhibitor [10], og det inhiberer også cellemigrering, og invasjon og induserer apoptose [11]. Det har blitt vist å indusere apoptose i bukspyttkjertelen, tykktarm, prostata og lunge kreftceller, og kronisk leukemi og multiple myelomceller [12], [13]. Det kan også modulere tumor-immun mikromiljøet i Kras
G12D mus [14]. Videre har STAT3 pathway blitt vist å regulere anti-inflammatorisk og anti-kreft aktivitet embelin [15]. Det forbedrer apoptosiske effekter TRAIL [16]. På tross av disse funnene, de molekylære mekanismer som embelin hemmer tumorvekst, angiogenese og metastase er ikke godt forstått.
PI3K /Akt signalveien spiller betydelig rolle i celle spredning og overlevelse, og det er ofte og abnormt aktivert i senere stadier av bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) [17]. PTEN betinget knockout mus med aktivert Kras
G12D viste betydelig akselerert utvikling av acinar-til-ductal metaplasi (ADM), ondartede bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi (mPanIN), og PDAC innen 12 måneder [18]. Viktigst, alle mus med Kras
G12D aktivering og PTEN homozygot delesjon døde av kreft etter 21 dager. Denne studien bekreftet rolle for PTEN, og den resulterende feilregulering av PI3K /AKT signale aksen i PDAC initiering og progresjon. Tilsvarende har vi nylig påvist at resveratrol kan hemme bukspyttkjertelen kreftutvikling i Kras
G12D mus [19]. Her søkte vi å undersøke anti-proliferative effekter av embelin på kreft i bukspyttkjertelen celler isolert fra Kras
G12D mus.
Sonic pinnsvin (Shh) er medlem av the Hedgehog (Hh) familie av utskilt signale proteiner med ulike funksjoner under virveldyr utvikling og i vev homeostase [20]. Upassende aktivitet på Hh signalveien har vært knyttet til krefttyper som oppstår sporadisk eller hos genetisk disponerte individer [21]. Bindingen av Shh å Lappet (ptch) reseptorer fører til tap av ptch aktivitet og påfølgende fosforylering og posttranskripsjonelt stabilisering av glattet (Smo) [22]. Gli familie av transkripsjonsfaktorer regulerer flere gener som paly roller i cellesyklus, spredning, migrasjon og apoptose [23]. Interessant, regulerer Gli sitt eget uttrykk og andre medlemmer av Shh sti som Lappet en og Lappet 2 og kreft i bukspyttkjertelen celler isolert fra Kras
G12D mus. Aktivering av Shh via Smo kan skje enten ved Hh protein stimulering eller gjennom tap av ptch aktivitet [23]. Shh pathway stimulerer cellevekst i autokrint og parakrint måte [24]. Vi har nylig vist at en rekke kjemopreventive midler og anticancer midler kan hemme kreft i bukspyttkjertelen celle og kreft stamcellevekst in vitro og in vivo [19], [25] – [31]. Inhiberingen av Shh sti alene eller i kombinasjon med andre, kan være effektiv for behandling og /eller forhindring av kreft i bukspyttkjertelen.
Hensikten med denne studien var å undersøke de molekylære mekanismer som embelin hemmer tumor-vekst, angiogenese og metastasering av kreft i bukspyttkjertelen celler xenopodet i Balb C nakne mus. I tillegg er de molekylære mekanismer som embelin hemmet veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler isolert fra Kras
G12D mus ble også undersøkt. Våre data viste at embelin hemmet kreft i bukspyttkjertelen cellevekst
in vitro, etter ASPC-en xenograft tumorvekst
in vivo Hotell og kreft i bukspyttkjertelen celler isolert fra Kras
G12D mus ved å undertrykke Akt og Shh signalveier. I konklusjonen, kan det bli utviklet for forebygging og /eller behandling av bukspyttkjertelkreft.
Resultater
Embelin Hemmer celleviabilitet i bukspyttkjertelkreft cellelinjer
Vi først undersøkte anti-proliferative effekter av embelin på fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer ASPC-1, Panc-1, MIA PACA-2 og Hs 766T med XTT analysen. Disse cellelinjer ble behandlet med embelin (0-15 uM) i 48 timer, og cellenes levedyktighet ble utført ved XTT-analyser. Som vist på fig. 1A og B, embelin hemmet celleviabilitet i alle cellelinjer. Vi neste undersøkte involvering av caspase i denne prosessen ved hjelp av en pan caspase inhibitor z-VAD-FMK. Selv om Z-VAD-inhibitor alene var ineffektiv til å inhibere celle-levedyktighet, det blokkerte signifikant anti-proliferative effekter av embelin på ASPC-1 og PANC-1-cellelinjer (fig. 1 C og D). Disse dataene antyder at caspase (e) aktivering kan være nødvendig for å hemme cellevekst av embelin.
(A og B), kreft i bukspyttkjertelen ASPC-en, PANC-en, MIA PACA-2 og Hs 766T cellelinjer ble behandlet med embelin (0-15 uM) i 48 timer. Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble XTT-analyser utført for å måle cellenes levedyktighet. (C og D), Effekter av pan kaspaseinhibitor på anti-proliferative effekter av embelin. Pankreatisk kreft ASPC-1 og PANC-1-celler ble preinkubert Z-VAD-FMK (10 uM) i 2 timer og behandlet med forskjellige doser av embelin (0-15 uM) i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av XTT-assay. Data representerer gjennomsnittet ± S.D. a, b, c, d og e = signifikant forskjellig fra respektive kontroll, P . 0,05
konstitutivt aktiv Akt eller Shh Protein hemmer Anti-proliferative Effekter av Embelin
Akt har vist seg å regulere Shh sti ved fosforylering Gli. Vi neste undersøkt om aktivering av Akt og Shh trasé blokkerer anti-proliferative effekter av embelin ved hjelp konstitutivt aktiv Akt og Shh protein, henholdsvis. Konstitutivt aktiv Akt (CA-Akt) har tidligere blitt beskrevet [28]. Forskjellige doser av embelin (0-15 pM) hemmet cellelevedyktighet ASPC-1 og PANC-1-celler transfektert med tom vektor (Fig. 1A og B). Videre er konstitutivt aktiv Akt (CA-Akt) inhiberte signifikant anti-proliferative effekter av embelin i begge cellelinjene. Disse data tyder på at embelin kan hemme kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon ved å undertrykke Akt sti.
Vi neste undersøkt om Shh sti formidler anti-proliferative effekter av embelin. Bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble inkubert med Shh protein for å aktivere Gli. Som vist på fig. 2 C og D, forskjellige doser av embelin (0-15 pM) hemmet cellelevedyktighet ASPC-1 og PANC-1-cellelinjer. I motsetning Shh proteinet inhiberte signifikant anti-proliferative effekter av embelin i disse to bukspyttkjertelcancercellelinjer. Disse data tyder på at embelin kan hemme bukspyttkjertelkreft celleformering ved å undertrykke Hysj bane.
(A og B), Inhibering av anti-proliferative effekter av embelin etter konstitutivt aktiv Akt. Pankreatisk kreft ASPC-1 og PANC-1 celler ble transient transfektert med enten tom vektor eller konstitutivt aktiv Akt (CA-Akt), og behandlet med forskjellige doser av embelin (0-15 uM) i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av XTT-assay. (C og D), Inhibering av anti-proliferative effekter av embelin ved Shh protein. Bukspyttkjertelkreft ASPC-1 og PANC-1-celler ble forbehandlet med Shh protein (2 uM) i 2 timer og behandlet med forskjellige doser av embelin (0-15 uM) i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av XTT-assay. Data representerer gjennomsnittet ± S.D. a, aa, b, c, d og e = signifikant forskjellig fra hverandre, P . 0,05
Embelin hemmer veksten av ASPC-1 xenografter i Balb C Nude Mice
for å undersøke tumorigent potensialet embelin, vi først undersøkte effekten av embelin på vekst av ASPC-1 xenopodet svulster i Balb C nakne mus. ASPC-1-celler ble injisert subkutant inn i flankene av Balb C nakne mus. Etter svulstdannelse, ble musene behandlet med embelin (0 eller 40 mg /kg kroppsvekt) gjennom sonde (mandag til fredag, én gang daglig) i 6 uker. Som vist på fig. 1A, embelin hemmet ASPC-1 bukspyttkjerteltumorvekst i Balb C nakne mus. Videre embelin hadde ingen effekt på kroppsvekten av ASPC-en tumorbærende mus, selv om mus fikk vekt under behandlingen (fig. 3B). Det er viktig å merke seg at vi ikke observere noen toksisitet i leveren, milten og tarmen hos mus behandlet med embelin, noe som tyder på det er et trygt naturlig produkt.
ASPC-1 celler (2 × 10
6-celler blandet med Matrigel, 50:50 forhold) ble subkutant implantert inn i flankene av Balb C nakne mus. Tumor bærende mus ble behandlet med embelin (0 eller 40 mg /kg kroppsvekt) gjennom sonde (mandag til fredag, én gang daglig) i 6 uker. Tumorvolum (A) og kroppsvekt av mus (B) ble registrert hver uke. Data representerer gjennomsnittet ± S.D. * = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05
Embelin Hemmer Tumor Cell Proliferation, og induserer apoptose gjennom aktivering av caspase-3 og Spalting av Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)
ved siden undersøkte effekten av embelin på celleformering i tumorvev avledet fra kontroll og embelin-behandlede mus under anvendelse av anti-PCNA eller anti-Ki67-antistoff (fig. 4). PCNA og Ki67 er markører for celleproliferasjon. Embelin hemmet celleproliferasjon i tumorvev oppnådd fra ASPC-1-xenografter sammenlignet med kontroll mus, målt ved immunhistokjemi (IHC) og Western blot (WB) analyse.
(A) Ekspresjon av PCNA, Ki67, caspase-3, og PARP i tumorvev. Immunhistokjemi ble utført for å måle ekspresjonen av PCNA, Ki67, aktiv caspase-3 og PARP i tumorvev isolert fra kontroll og embelin-behandlede mus. (B), Kvantifisering av Tunel positive celler. Apoptose ble målt ved TUNEL assay. Data representerer gjennomsnittet ± S.D. * = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (C), Effekter av embelin på markører for celleproliferasjon og apoptose. Western blot-analyse ble utført for å måle ekspresjonen av PCNA, Ki67, caspase-3 og PARP i tumorvev. Den β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
caspaseaktivering og spaltning av dets substrat PARP er hall merker for apoptose [32]. Vi neste undersøkt om embelin indusert tumorcelle apoptose gjennom aktivering av caspase-3 og spalting av PARP. Caspase-3 aktivering ble målt ved IHC og Western blot-analyse ved å bruke anti-aktiv caspase-3-antistoff (Fig. 4A og B). Embelin indusert caspase-3-aktivering. PARP er et substrat av caspase-3 [32]. Embelin behandling resulterte i spalting av PARP. Aktivering av caspase-3 av embelin korrelert med spalting av PARP i tumorvev. Samlet er disse data tyder på at embelin hemmet celledeling og apoptose i bukspyttkjertelen tumorvev gjennom hemming av PCNA, Ki67, og aktivering av caspase-3 og spalting av PARP.
Embelin Regulerer BCL-2 familiemedlemmer og Cell Cycle Proteiner, og hemmer Akt Activation i tumorvev
medlemmene av Bcl-2 familien kan enten fremme eller hemme apoptose [33], [34]. Vekststans av cellesyklus inhibitorer kan føre til induksjon av apoptose [35]. Vi målte således virkningene av embelin på ekspresjonen av cellesyklusproteiner (syklin D1, CDK-2, og CDK-6), og Bcl-2-familiemedlemmer (Bcl-2, og Bax) i tumorvev ved hjelp av Western blot-analyse og immunhistokjemi. Som vist på fig. 5, embelin hemmet ekspresjon av cellesyklusrelaterte proteiner syklin D1-, CDK-2 og CDK-6 i ASPC-1 xenopodet tumorer sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe. Videre embelin behandling av ASPC-1 xenopodet mus resulterte i inhibering av anti-apoptotiske protein Bcl-2 og induksjon av pro-apoptotiske protein Bax i tumorer sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe. Disse data tyder på at embelin kan regulere bukspyttkjertelkreft tumorvekst ved å forårsake cellesyklus-stans og indusering av apoptose.
(A) Ekspresjon av Bcl-2, Bax, Cyclin D1, CDK2, CDK6 og fosfo-Akt. Immunhistokjemi ble utført som beskrevet i materialer og metoder. (B), ble Western blot-analyse utført for å måle ekspresjonen av Bcl-2, Bax, Cyclin D1, CDK-2, CDK-6, p-AKT (Ser473), og AKT. Den β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
PI3K /Akt signalveien regulerer cellesyklusprogresjon og tumorgenese, og er konstitutivt aktiv i bukspyttkjertel [36]. Cytostatika som hemmer PI3K /Akt sti kan utvikles for behandling av kreft i bukspyttkjertelen. Vi måler derfor ekspresjon av fosfo-Akt i tumorvev (fig. 5). Embelin hemmet ekspresjon av pakt i tumorvev isolert fra ASPC-1-xenografter sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe. Samlet er disse data tyder på at embelin hemmer PI3K /Akt sti i ASPC-1 xenopodet svulster, og hemming av Akt sti kan indusere cellesyklus arrest, undertrykke tumor celleproliferasjon og kreft i bukspyttkjertelen vekst.
Embelin hemmer Angiogenese
veksten av faste tumorer er avhengig av angiogenese for tilførselen av næringsstoffer, vekstfaktorer og oksygen [37]. Vaskulær endotelial vekstfaktor er et utskilt vekstfaktor avgjørende for angiogenese. VEGF funksjoner i både fysiologisk og patologisk angiogenese, særlig i metastase, noe som gjør det til et attraktivt terapeutisk mål. Vi søkte derfor å måle effekten av embelin på angiogenese ved å måle uttrykket av VEGF og VEGFR i ASPC-1 xenopodet svulster. Som vist på fig. 6, behandling av tumorbærende mus med embelin resulterte i signifikant inhibering i VEGF og VEGFR-ekspresjon i tumorvev sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe.
(A), Immunhistokjemi ble utført for å undersøke ekspresjon av VEGF, VEGFR, Cox -2, og IL-8 i tumorvev isolert fra kontroll og embelin-behandlede mus. (B), ble Western blot-analyse utført for å måle ekspresjonen av VEGF, VEGFR, COX-2, og IL-8. Den β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C), Immunhistokjemi ble utført for å undersøke ekspresjon av E-cadherin, sneglen, Slug, ZEB1, MMP-2 og MMP-9 i tumorvev isolert fra kontroll og embelin-behandlede mus. (D), ble Western blot-analyse utført for å måle ekspresjonen av E-cadherin, sneglen, Slug, ZEB1, MMP-2 og MMP-9. Den β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
syklooksygenase-2 (COX-2) overekspresjon fremmer inflammasjon, endotelial celleproliferasjon, metastase og tumorigenesis [38]. Vi har derfor undersøkt om embelin hemmer uttrykk for COX-2 i ASPC-1 xenopodet svulster. Som shwon i fig. 6, embelin hemmet ekspresjon av COX-2 i tumorvevet isolert fra ASPC-1-xenografter sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe. Disse data tyder på at embelin kan undertrykke betennelse og bukspyttkjerteltumorvekst ved å undertrykke COX-2.
Cytokiner har vært innblandet i initiering, progresjon, og metastasering av solide svulster og angiogenese [39]. Vi har nylig rapportert dereguleringen av cytokin ekspresjon og /eller signalering i bukspyttkjertelkreft [14], [25], [31]. IL-8 /IL-8-reseptor-aksen spiller en avgjørende rolle i metastase og tumorvekst, og også modulere tumormikro [39]. Vi målte således ekspresjon av IL-8 i tumorvev isolert fra kontroll og embelin-behandlede xenotransplantater. Behandling av ASPC-1 xenopodet mus med embelin resulterte i suppresjon av IL-8 sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe (fig. 6A og B). Disse dataene antyder at hemming av IL-8 /IL-8 reseptor akse kan være betydelig i å hemme kreft i bukspyttkjertelen vekst ved embelin.
Embelin hemmer Markers av epithelial-til-mesenchymale Transition (EMT) i ASPC-1 xenografter
epithelial-til-mesenchymale overgang og dens motsatte prosessen, mesenchymale-til epitel overgang (MET), spiller viktige roller i embryogenesen stemness, kreft progresjon, metastaser og chemoresistance. Flere signalveier og regulatoriske transkripsjons nettverk kan regulere EMT [40]. Et kjennetegn på EMT er nedregulering av den celleadhesjonsmolekyl E-cadherin, og oppregulering av mesenchymale markeringen N-cadherin. En rekke av transkripsjonsfaktorer inkludert sink finger snegle homologer (snegle) og basis helix-loop-helix faktorer som Twist, ZEB-1, og ZEB2, som alle kommuniserer med E-kasseelementet i det proksimale området av E-cadherin promoter. Under EMT, de MMP fordøye den ekstracellulære matrise og basalmembran og dermed gir cellene til å invadere og metastaserer [41]. Vi målte derfor effekten av embelin på uttrykk for E-cadherin, Snail, Slug, ZEB1, MMP-2 og MMP-9 i tumorvev. Behandling av ASPC-1 xenopodet mus med embelin indusert ekspresjon av E-cadherin og inhiberte ekspresjon av MMP-2, MMP-9, sneglen, Slug, og Zeb-1 i tumorvev sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe (fig. 6 C og D). Våre data viser at embelin kan hemme /bakover bukspyttkjerteltumormetastase ved å fremkalle uttrykket av E-cadherin og hemmer dens tilhørende transkripsjonsfaktorer (Snail, Slug, og ZEB1) og MMP (MMP-2 og MMP-9). Totalt sett, våre data viser at embelin kan en potensiell hemmer av tidlig metastasering.
Embelin Hemmer Sonic Hedgehog Pathways, og opp-regulerer TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5
Shh pathway fremmer celle invasjon, migrering, metastase og tumorvekst ved å påvirke et komplekst signaleringsnett i bukspyttkjertelkreft [20], [42]. Inhibering av Shh bane har vist seg å undertrykke tumorvekst og metastase. Vi har derfor søkt å undersøke effekten av embelin på Shh sti ved å måle uttrykket av transkripsjon faktorer Gli1 og Gli2. Gli1 regulerer sitt eget uttrykk. Behandling av ASPC-1 xenopodet mus med embelin hemmet ekspresjon av Gli1 og Gli2 sammenlignet med ubehandlet kontroll (Fig. 7 A og B). Disse data tyder på at embelin kan hemme ASPC-en tumorvekst ved å undertrykke Hysj bane.
(A), Immunhistokjemi ble utført for å måle ekspresjonen av Gli1, Gli2, DR4 og DR5 i tumorvev isolert fra kontroll og embelin behandlede mus. (B), ble Western blot-analyse utført for å måle ekspresjonen av Gli1, Gli2, DR4 og DR5. Den β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting
Vi har vist at aktiveringen av TRAIL-reseptor død veien induserer apoptose i kreftceller [43] -. [45]. Siden TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 blir indusert ved hemmingen av Gli aktivitet [29] kan shh-inhibitorer kan kombineres med liganden TRAIL for å indusere apoptose. Vi undersøkte derfor effekten av embelin på uttrykk for TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 i tumorvev isolert fra ASPC-1 xenografter (Fig. 7 A og B). Behandling av ASPC-en svulst bærende mus med embelin oppregulert uttrykk for TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 i tumorvev sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe. Disse data tyder på at embelin kan kombineres med døden reseptorligander (TRAIL eller agonistiske antistoffer) for behandling av bukspyttkjertelkreft.
Embelin hemmer veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler isolert fra Kras
G12D Mus
Kras mutasjoner er funnet i ca 95% av menneskelige bukspyttkjertelen duktale adenokarsinomer [6]. Vi undersøkte derfor effekten av embelin på vekstegenskaper og signalveier i muse bukspyttkjertelen kreftceller isolert fra 10-måneder gamle Kras
G12D mus. Kreft i bukspyttkjertelen celler ble isolert fra mus og
in vitro
studier ble utført for å undersøke de biologiske effektene av embelin. Embelin hemmet celleviabilitet og kolonidannelse i mus kreft i bukspyttkjertelen celler (Fig. 8A). For å bekrefte rolle Shh, og Akt trasé på anti-proliferative effekter av embelin, målte vi uttrykket av komponenter av disse banene. Embelin hemmet uttrykk for Gli1 og Gli2 og deres nedstrøms mål Cyclin D1 i muse kreft i bukspyttkjertelen celler (Fig. 8B). Videre embelin hemmet ekspresjon av fosfo-Akt, en kinase høyaktiv i bukspyttkjertelkreft (Fig. 8C). Disse data tyder på at embelin kan hemme mus kreft i bukspyttkjertelen vekst ved å undertrykke Shh og Akt signalveier.
(A), Kreft i bukspyttkjertelen celle ble isolert fra 10-måneder gamle Kras
G12D mus. Celler ble behandlet med embelin (0-5 uM) for å måle cellenes levedyktighet og kolonidannelse ved 2 og 21 dager, henholdsvis. * = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (B), ble mus bukspyttkjertelcancerceller isolert fra 10 måneder gamle Kras
G12D mus og behandlet med eller uten embelin (3 uM) i 36 timer. Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble crud protein ekstrahert. Western blot analyse ble utført for å måle uttrykket av Gli1 og Gli2. Den β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C), ble mus bukspyttkjertelcancerceller isolert fra 10 måneder gamle Kras
G12D mus og behandlet med eller uten embelin (3 uM) i 36 timer. Western blot-analyse ble utført for å måle ekspresjonen av phopho-Akt (pakt) og Akt. Den β-actin ble brukt som en lasting kontroll.
Diskusjoner
Kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest aggressive og ødeleggende maligniteter. Vi har vist, for første gang, at embelin hemmet levedyktighet av bukspyttkjertelkreft cellelinjer
in vitro Hotell og ASPC-en xenopodet tumorvekst som var forbundet med undertrykkelse av Akt og SHH veier. Videre embelin hemmet veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler isolert fra Kras
G12D mus gjennom undertrykkelse av Akt og SHH veier. Disse banene har vist seg å spille en stor rolle i bukspyttkjertelen kreftutvikling. Embelin hemmet tumorcelle-proliferasjon, og cellesyklus, og induserte apoptose. Embelin også hemmet markører for angiogenese og metastasering. Interessant, behandling av ASPC-1 xenopodet mus med embelin resulterte i opp-regulering av død reseptoren DR4 og DR5, kunne noe som tyder på at kombinasjonen av embelin med TRAIL-agonister være et levedyktig strategi for å behandle human kreft i bukspyttkjertelen.
PI3K /Akt signalveien regulerer celleproliferasjon og overlevelse, og er ofte og abnormt aktivert i PDAC. I vår studie, embelin hemmet fosforylering /aktivering av Akt i humane og mus kreft i bukspyttkjertelen celler og vev. Aktivering av Kras resulterer i fosforylering og aktivering av Akt kinase. Siden embelin indusert apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler som Kras mutasjon ved å undertrykke Akt vei, noe som tyder på sine kliniske fordeler mot menneskelig kreft i bukspyttkjertelen hvor Kras er mest mutert. I en fersk undersøkelse, den heterozygot tap av PTEN i Kras
G12D mutant mus akselerert utvikling av acinar-til-ductal metaplasi (ADM), mPanIN, og PDAC innen ett år [18]. Denne studien antyder sterkt rollen PTEN /PI3K /Akt og Kras signalveier i både kreft i bukspyttkjertelen initiering og progresjon.
Shh er unormalt uttrykt i bukspyttkjertelen adenokarsinom og dets forstadier (Panin). Pankreata av PDX-Hysj mus (der Shh er feilekspriraert i bukspyttkjertelen endoderm) utvikler unormal rørformede strukturer, Panin-1 og -2 [46]. Videre disse Panins lesjoner også inneholder mutasjoner i K-ras og økt ekspresjon av HER-2 /neu, som er genetiske mutasjoner som finnes tidlig i utviklingen av human kreft i bukspyttkjertelen. Vi har nylig vist at komponentene i Shh reaksjonsveien er sterkt uttrykt i humane bukspyttkjertel cancer stamceller og bukspyttkjertelcancercellelinjer, og flere kjemopreventive midler hemmet kreft i bukspyttkjertelen vekst [19], [26], [27], [47]. Tilsvarende i denne studien, embelin hemmet ASPC-en tumorvekst og mus PDAC cellevekst ved å undertrykke Hysj veien. I en annen studie ble det vist at inhibering av Hh veien redusert celleproliferasjon og apoptose via hemming av PI3K /Akt spredningsveier og kreft stamceller [48]. Videre har vi vist at inhibering av Shh signalveien i betydelig grad hemmet EMT ved å undertrykke aktivering av transkripsjonsfaktorer snegle og Slug, som ble korrelert med vesentlig redusert kreft i bukspyttkjertelen stamcelle invasjon [26], [27], [47], [ ,,,0],49], [50], som tyder på at Shh signalveien er involvert i tidlig metastaser. Samlet disse data tyder på at inhibering av Shh bane kan være en potensiell molekylære mål for nye terapeutiske strategier for human kreft i bukspyttkjertelen.
Samle bevis antyder en viktig rolle for COX-2 i patogenesen av et bredt spekter av malignitet. COX-2 er oppregulert i bukspyttkjertelen PDAC [38]. COX-2 sletting i Pdx1 + bukspyttkjertelen stamceller forsinker betydelig utvikling av PDAC i mus med K-ras-aktivering og PTEN haploinsufficiency. Omvendt, fremmer COX-2 overekspresjon tidlig debut og progresjon av PDAC i K-ras musemodell. Tap av PTEN-funksjonen er en kritisk faktor for å bestemme dødelig angrep PDAC og total overlevelse. Mekanistisk, COX-2 overekspresjon øker p-Akt nivået i forstadier av Pdx1 (+); K-ras (G12D) (/+); PTEN (lox) (/+) mus i fravær av PTEN LOH. I motsetning til dette, COX-2 delesjon i den samme innstilling avtar p-Akt nivåer og forsinkelser kreft progresjon. Denne studien antyder en viktig celle egenverdi rolle for COX-2 i startfasen og progresjon gjennom aktivering av PI3K /Akt veien. I fravær av indre COX-2, utvikler PDAC eventuelt med redusert FKBP5 og øket GRP78 ekspresjon, to alternative reaksjonsveier som fører til aktivering Akt [38]. Derfor kan samtidig hemming av både COX-2 og Akt representerer en ny strategi for behandling av kreft i bukspyttkjertelen.
Tumorceller som gjennomgår EMT er også kjent for å øke utskillelsen av spesifikke faktorer, inkludert cytokiner, kjemokiner og vekst faktorer, som kan spille en viktig rolle i tumorprogresjon [39], [51]. I den foreliggende undersøkelse, embelin inhiberte ekspresjon av IL-8 i ASPC-1 tumorvev. Således kan IL-8 signale blokade av embelin tilveiebringe et middel for å inhibere eller reversere EMT. Videre hemming av sneglen, Slug og ZEB-1 uttrykk og oppregulering av E-cadherin av embelin kunne regulere bukspyttkjertelkreft progresjon gjennom sin innflytelse på reversering av EMT. Følgelig, er inhibering av ekspresjon eller funksjon av EMT-induserende transkripsjonsfaktorer i bukspyttkjertelkreft forventet å føre til nye terapeutiske strategier.
kreftcellemetastase er en trinnvis prosess som omfatter løsgjøring av celler fra den primære tumor
