Abstract
Drug målretting er et aktivt forskningsområde og nanoskalerte stoffet leveringssystemer holde et stort potensial for behandling av neoplasmer. I denne studien har en roman cyklodekstrin (CD) -basert nanopartikkel medikamentleveringssystemet er montert og preget for behandling av folat reseptor-positiv [FR (+)] kreft. Vannløselige folsyre (FA) konjugert CD carriers (FACDs) ble vellykket syntetisert og deres strukturer ble bekreftet av 1D /2D kjernemagnetisk resonans (NMR), matrix-assistert laser desorpsjon ionisering time-of-flight massespektrometer (MALDI- TOF-MS), væskekromatografi med høy ytelse (HPLC), Fourier transform infrarød spektroskopi (FTIR) og sirkulær dikroisme. Medikamentkomplekser av adamatane (Ada) og cytotoksisk doxorubicin (Dox) med facd ble lett oppnådd ved blandet løsningsmiddel utfelling. Den gjennomsnittlige størrelsen på facd-Ada-Dox var 1,5-2,5 nm. Verts-gjest foreningen konstant
K
a var 1639 M
-1 som bestemmes av indusert sirkulærdikroismeanalyse og hydrophilicity av FACDs ble kraftig forbedret i forhold til umodifisert CD. Cellulært opptak og FR bindende konkurransedyktige eksperimenter demonstrerte en effektiv og fortrinnsvis målrettet levering av Dox i FR-positive tumorceller og en vedvarende medikamentavgivelsesprofil ble sett
in vitro
. Levering av Dox i SV (+) kreftceller
via
endocytose ble observert av konfokalmikroskopi og narkotika opptak av målrettede nanopartikler var åtte ganger større enn for ikke-målrettede medikamentkomplekser. Våre docking resultater tyder på at FA, facd og facd-Ada-Dox kunne binde menneskelig pinnsvin samspill protein som inneholder en FR domene. Muse cardiomyocytes samt fibroblast behandlet med facd-Ada-Dox hadde signifikant lavere nivåer av reaktive oksygenforbindelser, med økt innhold av glutation og glutation-peroksydase-aktivitet, noe som indikerer en redusert potensiale for Dox-kardiotoksisitet. Disse resultatene indikerer at den målrettede medikamentkomplekset har høy medikamentkrets og forlenget medikamentavgivelsesegenskaper med god biokompatibilitet og fysiologiske stabilitet. Romanen FA-konjugert β-CD basert medikamentkomplekset kan være lovende som en anti-tumor behandling for SV (+) kreft
Citation. Yin JJ, Sharma S, Shumyak SP, Wang ZX, Zhou ZW, Zhang Y, et al. (2013) Syntese og biologisk evaluering av Novel Folic Acid Receptor-målrettet, β-syklodekstrin baserte legemiddel Komplekser for kreftbehandling. PLoS ONE 8 (5): e62289. doi: 10,1371 /journal.pone.0062289
Redaktør: Caterina Cinti, Institutt for klinisk fysiologi, c /o Toscana biovitenskap Foundation, Italia
mottatt: 06.12.2012; Godkjent: 19 mars 2013; Publisert: 02.05.2013
Copyright: © 2013 Yin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dr JJY støttes av en postdoktor stipend fra College of Pharmacy, University of South Florida, 12901 Bruce B Downs Blvd., Tampa, Florida. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en ledende morder av mennesker over hele verden, og står for 7,6 millioner dødsfall (rundt 13% av alle dødsfall) i 2008 [1]. Overall, anslagsvis 12,7 millioner nye krefttilfeller og 7,6 millioner kreftdødsfall skjedde i 2008, med 56% av nye krefttilfeller og 63% av kreftdødsfall som forekommer i de mindre utviklede regioner i verden [2]. De mest vanlige kreftformer diagnostisert på verdensbasis er lunge (1,61 millioner, 12,7% av det totale), bryst (1,38 millioner, 10,9%) og kolorektal kreft (1,23 millioner, 9,7%). Novel, trygge og effektive behandlinger er klart og sterkt behov for å begrense disse høye dødelighetsstatistikk. De fire store moduler for kreftbehandling omfatter kirurgi, stråling, kjemoterapi og immunterapi [3]. Imidlertid er disse behandlinger er bare vellykket når kreften oppdages på et tidlig stadium, eller er begrenset til visse typer kreft (for eksempel leukemi). På grunn av den manglende evne til å oppdage kreft i et tidlig stadium, de fleste pasienter som er tilstede i avansert stadium med utstrakt lokal infiltrasjon og metastasering. For avanserte tumorer, spesielt de tumorer utviklet seg fra epitelvev som for eksempel lunge, tykktarm, bryst, prostata og bukspyttkjertel, disse behandlinger er mindre vellykket. Kjemoterapi representerer en av de viktigste midler for kreftbehandling, som tar sikte på å drepe tumorceller, eller for å hemme proliferasjonen og samtidig bevare de normale celler i kroppen [3]. Kjemoterapeutiske midler har generelt en snever sikkerhetsmargin, og anvendes i kombinasjon vanligvis gitt ved en maksimal tolerert dose for å oppnå maksimal kreftcelledreping [4]. De dreper tumorceller ved direkte cytotoksisitet, eller aktivering av vertsimmunrespons, hemme spredning prosesser av tumorceller, og indusering av apoptose [5]. Men de fleste pasientene ikke svare på disse stoffene og de ofte opplever alvorlige bivirkninger som alvorlig diaré og tap av hår. Den primære årsak til dette er fordi medikamentet dreper både normale og tumorceller på grunn av lav medikament selektivitet og legemiddelnivåer i løpet av tumorceller er for lave. Drug motstand og dosebegrensende toksisitet er de store problemene for å lykkes med kreft kjemoterapi [6]. I det siste tiåret har nano-skalert, målrettet levering av legemidler mye oppmerksomhet som et middel for å forbedre den helbredende effekten av eksisterende kjemoterapeutika samtidig redusere sine skadevirkninger [7], [8]. Nye dramatiske utviklingen i nanoteknologi har skapt et mylder av kreft nano narkotika; Men de fleste aktuelle nano-medikamentsystemer bommer i lettere rensing, reproduserbarhet og batch-til-batch konsistens [9], [10]. Utarbeidelse og karakterisering av nano-medikamentelle formuleringer spesielt for vandige medikamentkomplekser er fortsatt en stor utfordring.
antracyklinglykosid antibiotika, doxorubicin (Dox), er en potent, bredspektret anticancer middel som virker ved interkalere innen DNA og inhibering av DNA-syntese [11]. Dox blir ofte brukt til å behandle noen leukemi og Hodgkins lymfom, så vel som kreft i blære, bryst, mage, lunge, eggstokker, skjoldbruskkjertelen, og sarkom bløtvev. Ved de vanlige kjemoterapeutiske doser, er Dox kardiotoksisk, og det kan også øke risikoen for leukemi, spesielt når den er gitt ved høye doser eller sammen med visse andre kjemoterapeutiske midler eller strålebehandling [11] -. [16]
Målet med denne rapporten er å presentere en metode for å syntetisere en ny og effektiv narkotika komplisert for målrettet levering av legemidler (figur 1). Ved å kombinere målsøkende molekyler, legemiddelbærere og cytotoksiske midler til en kompleks skal garantere stabiliteten av konjugatet i sirkulasjon og forsikre skifrighet for å frigjøre legemidlet. Den β-CD ble vektorisert med folsyre (FA) for å målrette folatreseptorer (FR) på tumorcelleoverflaten. Dox-inneholdende FR-målretting p-CD ble syntetisert ved en flertrinnsreaksjon hvori a- og y-amid-monomerer, så vel som di-CD substituert FA bæreren var renset og fullstendig karakterisert av et panel av spektrale teknikker.
in vitro
legemiddelfrigjøringsprofilen ble bestemt ved dialyse og fluorescens måling, og målrettede stoff bindende
in vitro
ble kvantifisert ved flowcytometri og konfokalmikroskopi. Den cytotoksisitet av de ulike medikamentkomplekser ble målt og biomarkører knyttet til fritt DOX-kardiotoksisitet ble også undersøkt på cellenivå.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
β-syklodekstrin hydrat og cerim (IV) sulfat tetrahydrat ble kjøpt fra Acros Organics (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Ammoniummolybdat (para) tetrahydrate ble kjøpt fra Alfa Aesar Inc. (Ward Hill, MA).
p
Toluensulfonylklorid,
N
,
N
«dicyclohexyl-karbodiimid (DCC), folinsyre (FA),
N
hydroksysuccinimid (NHS), doxorubicin-hydroklorid, 1-adamantankarbonylklorid, ammoniumbikarbonat, natriumazid, trifenylfosfin, 2 «, 7′-dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA), 5, 5»-ditiobis (2-nitrobenzosyre) (DTNB), redusert glutation (GSH), hydrogenperoksyd, kalium-hydroksid, natriumhydroksid, fosforsyre, ammoniakk hydroksyd, ninhydrin, saltsyre, jod, svovelsyre, eddiksyre, deuteriumoksyd, kloroform-d, dimetylsulfoksyd-d
6, og CM sephadex C
25 ble alle kjøpt fra Sigma-Aldrich Chemicals Co. (St. Louis, MO). Paraformaldehyde ble hentet fra EMD Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ). Den bicinchoninic syre (BCA) assay kit ble kjøpt fra Pierce (Rockford, IL). CM-H
2DCFDA ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). Pro-prep (TM) Protein utvinning kit ble kjøpt fra intron Bioteknologi Inc. (Kyungki-Do, Korea). Den glutationperoksidase (GPX) analysesett ble oppnådd fra BioVision Inc. (Milpitas, CA). Spectra /Por dialysemembran med en molekylvektsperre på 3000 Da ble kjøpt fra Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Alle løsemidler for kromatografisk isolering var av analytisk kvalitet. HPLC-grad aceton, butanol, acetonitril (ACN), etylacetat (EtOAc), heksan, metanol, 1-propanol (1-PA), 2-propanol, diklormetan (DCM), pyridin, dimetylformamid (DMF), dimetylsulfoksyd ( DMSO) og tynnsjiktskromatografi plater (1000 um og 200 um) ble kjøpt fra Fisher Scientific Co. (Fair Lawn, NJ). Varmeinaktivert føtalt bovint serum, føtalt bovint serum, og nyfødt kalveserum ble kjøpt fra Hyclone Laboratories Inc. (Logan, UT). FR og β-actin antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). HRP mus anti-kanin-IgG-monoklonalt antistoff ble kjøpt fra Prosci Inc. (San Diego, CA). Pierce ECL western blotting substrat ble kjøpt fra Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA).
Celler og cellekultur
JEG-3 og JAR (begge avledet fra human placenta choriocarcinom), HT -29 (human koloncancer), MCF-7 (human brystcancer), H9C2 (2-1)-celler (mus kardiomyocytter) og 3T3 (mus fibroblast) cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) . JEG-3-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med 10% nyfødt kalveserum; JAR og MCF-7 celler ble dyrket i RPMI-1640 med 10% serum fra nyfødt kalv; HT-29 celler ble dyrket i McCoys 5A med 10% nyfødt kalveserum; og 3T3-celler ble dyrket i DMEM med 10% føtalt kalveserum. Alle cellelinjer ble inkubert i 5% CO
2 og 90 til 100% relativ fuktighet ved 37 ° C. Medium fornyelsen ble utført 2-3 ganger per uke, og cellene ble dyrket da de oppnådde 80-90% samløpet. For lysbilde forberedelse, 2 × 10
4-celler ble sådd ut på 0,7 cm x 0,7 cm Nunc merkevare kammer lysbilder fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Celler ble vasket tre ganger i fosfat-bufret saltvann (PBS) og overlagt med Vectashield kjede monteringsmedium inneholdende 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) anskaffet fra Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA).
Western blot Assay
protein~~POS=TRUNC innholdet~~POS=HEADCOMP ble bestemt ved anvendelse av BCA-metoden etter protein ekstraksjon fra cellene. Ekspresjonsnivået av FR i JAR, HT-29, MCF-7 og 3T3-cellelinjer ble bestemt ved Western blot analyse. Kort sagt ble cellemonolagene vasket med PBS og deretter lysatene ble kokt i 10 minutter og en prøve ble anvendt for å evaluere proteininnholdet ved BCA-analyse. En porsjon av totalt protein (0,2 mg) ble analysert ved hjelp av 12% natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). Etter elektroblotting av geler på polyvinylidendifluorid (PVDF) ark (Millipore, Bedford, MA), ble filtrene blokkert ved romtemperatur med Tris-bufret saltvann Tween-20 (TBST) buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 % Tween 20, og 150 mM NaCl) inneholdende 10% ikke-fettholdig tørrmelk og deretter inkubert i TBST-buffer over natten ved 4 ° C med en 1:200 fortynning av FR-antistoff og 1:10,000 fortynning for β-aktin-antistoff. Etter vasking med TBST-buffer, ble blottene inkubert i 1 time ved romtemperatur med muse-anti-kanin-IgG-monoklonalt antistoff fortynnet 1:3,000 i TBST-buffer og deretter avdekket ved forbedret kjemiluminescens (ECL).
Kjemisk syntese av Folsyre Acid Receptor-målrettet, β-syklodekstrin baserte legemiddel Komplekser
For å syntetisere mono-6-deoksy-6 – (
p
-tolylsulfonyl) -β-syklodekstrin (Ts-CD), en oppløsning av
p
toluensulfonylklorid (846,3 mg, 4,44 mmol) i 5 ml ACN ble tilsatt til 80 ml vandig oppløsning av β-CD (5,0 g, 4,44 mmol) og NaOH (434,8 mg, 10,8 mmol) dråpevis i løpet av 15 min. Etter omrøring i 4 timer ved 0 ° C i N
2 atmosfære, ble løsningen nøytralisert ved tilsetning av 0,6 ml 2,0 N vandig saltsyre, og produktet ble omkrystallisert ved 4 ° C over natten, og deretter vasket med aceton. Ts-CD ble oppnådd i et utbytte på 84,6% (figur 2 og figurene S1 S8) i 11,4% utbytte (lysegult pulver), samt spormengde av di-mono-6-deoksy-6 – ((2
S
) -2- [(4 – {[(2-amino-4-hydroxypteridin-6-yl) metyl] amino} fenyl) formamido] pentandisyre) -β-cyklodekstrin (FA-di-CD) 3,4 mg (figur S9) i 7,1% yield (figur 2).
dannelsen av gjest-vert inklusjonskomplekser mellom Ada-Dox og folsyre-konjugert cyklodekstriner ble utarbeidet av co-nedbør og tørkemetode med 01:01 støkiometri. FACDs (1 ekv) ble oppløst i vann, og DMSO-oppløsning av Ada-Dox (1 ekv) ble tilsatt til cyklodekstrin-løsning og deretter omrørt over natten ved 4 ° C etterfulgt av partiell fordampning. Bunnfallet ble samlet ved filtrering.
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) og Matrix-Assisted Laser desorpsjon ionisering Time-of-Flight Mass Spectrometer (MALDI-TOF-MS)
Høy oppløsning
1H NMR-spektra ble registrert på et digitalt NMR Spectrospin Bruker Avance 600 MHz og 800 MHz (Bruker Co. BioSpin, The Woodlands, TX). Frigjøringskinetikken for medikamentene ble målt ved anvendelse av et Perkin-Elmer Lambda 2 UV /vis dobbeltstråle-spektrofotometer. Fluorescens mikroskopi bilder ble oppnådd med Applied Precision Deltavision System (Issaquah, WA) er utstyrt med et Olympus invertert mikroskop IX 70 (Tokyo, Japan). Bildet arbeidsstasjon inkluderer SoftWoRx programvare for digital image oppkjøpet, deconvolution, og optisk snitting.
Masse spektra ble oppnådd ved en Bruker Daltronics Autoflex MALDI-TOF (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA), med α-cyano -4-hydroxycinnamic syre (CHCA) som matriks (10,0 mg /ml, fra Thermo Scientific Pierce). Dataanalyse ble utført med mMass programmet.
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
HPLC analyser ble utført på en Agilent 1260 Infinity HPLC system (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA ) som inkluderte G1312C løsemiddel leverings binære pumper, en G1379B avgasser, en G1329B auto-sampler, en G4212B fotodiodeseriedetektor, en G1321B fluorescens detektor, og ChemStation driftsprogramvare (Åp B. 04. 03). HPLC var utstyrt med et Agilent Eclipse Plus C
18-kolonne med en partikkelstørrelse på 3,5 um og kolonne størrelse på 100 mm x 4,6 mm, som ble plassert i en kolonne ovn (G1316A) under en konstant temperatur ved 25 ° C . Den mobile fase bestod av acetonitril og vann (Gradient). kolonne strømningshastighet den ble innstilt på 1,0 ml /min, mens HPLC-trykket ble regulert mellom 260-290 bar.
HPLC-UV /evaporativ lysspredningsdetektor (ELSD) og HPLC-DAD /fluorescens separasjon betingelsene var som følger: elueringsmiddel A, vann; elueringsmiddel B, acetonitril; gradient, 0-6 min (10-15% B), 6-50 min (15-40% B), 50-60 min (40-80% B), og deretter ekvilibrert med 10% B i 8 min ved en strømningshastighet på 1,0 ml /min. ELSD ble satt til en kjernetemperatur på 70 ° C, en gevinst på 7 og forstøvergassen nitrogen justert til 2,5 bar.
Fourier Transform infrarødt spektroskopi (FTIR)
Instrumentet som brukes for FTIR analyse var et Perkin-Elmer 1725 serie FTIR-spektrometer (Perkin-Elmer Co., Norwalk, CT) utstyrt med et romtemperatur deuterert triglycine sulfat detektor og styres av et Perkin-Elmer 7300 PC. Programvaren som brukes for å samle FTIR data var Spectrum versjon 5.3.1.
sirkulærdikroismeanalyse
sirkulærdikroismeanalyse spektra ble registrert ved 25 ° C i en Aviv modell 215 sirkulærdikroismeanalyse spektrometer (Aviv Biomedicals Inc., Lakewood, NJ) ved hjelp av en 0,1 cm celle for tre skanninger med 0,1 nm båndbredde. Konsentrasjonen av medikamentene var 50 uM i DMF, med mindre annet er angitt. Synergy H4 hybrid multi-modus mikroplateleser ble kjøpt fra BioTek Instruments Inc. (Winooski, VT).
transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og Atomic Force Mikroskopi (AFM)
Den morfologi og størrelsen av facd-Ada-Dox supramolecules ble evaluert ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og atomkraftmikroskopi (AFM). En vandig løsning av facd-Ada-Dox ble direkte dryppet på en 300-mesh kobbergitter og tørket i en vakuumovn ved 35 ° C i 4 timer, deretter bilder ble observert med TEM (JEM 100CX, JEOL Ltd., Tokyo, Japan) med en akselererende spenning på 160 kV. For AFM bilder ble prøven oppløst i dobbelt deionisert vann (1,0 mg /ml), ble en alikvot av løsningen (5,0 ul) prikket inn på et ferskt spaltet glimmer overflate og oppvarmet ved 37 ° C i 3 timer. Imaging ble utført på en Multimode Nanoscope AFM i hanke modus med væske celle, J skanner og 200 mikrometer bommene med en nm Si
3N
4 tips.
3- (4, 5- dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse
JAR, HT-29 og 3T3-celler ble sådd i 96-brønns vevskulturplater og holdt over natten i DMEM-medium. Cellene ble deretter behandlet med Dox, Ada-Dox, facd-Ada-Dox, eller NFACD-Ada-Dox ved forskjellige konsentrasjoner og inkubert i 24 timer ved 37 ° C. Absorbansen ble målt etter tilsetning av MTT. MTT reduseres med mitokondrielle dehydrogenases i levende celler til en blå-mageta farget formazan bunnfall. Absorbansen av oppløst formazan i det synlige området korrelerer med antallet intakte aktive celler. Cytotoksisiteten ble evaluert med henvisning til IC
50 verdi som er definert som den konsentrasjon som er nødvendig for en 50% reduksjon i overlevelse på grunnlag av overlevelseskurver. IC
50 verdiene ble beregnet ut fra dose-responskurver (dvs. celleoverlevelse brøkdel
vs
. Medikamentkonsentrasjon) oppnådd i multi-replikeres eksperimenter.
Drug Slipp analysen
in vitro
frigjøringsprofiler og kinetikk for narkotika facd-Ada-Dox og prodrug Ada-Dox ble bestemt ved en dialysemetode. I korthet ble 3 ml vandig medikament ble tilsatt til 1 ml PBS (pH 7,4, 0,01 M). Blandingen ble suspendert i en dialysepose (molekylvekt cut-off: 3000 Dal) og dialysert mot 10 ml PBS inneholdende 50% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C under forsiktig rysting i tre dager. En 20 ul aliquot av prøven ble fjernet fra inkuberingsmediet ved angitte tidspunkter og lagret frosset til analyse. Den frigjorte Ada-Dox ble kvantifisert ved mikroplateleser ved λ
Ex
= 490 nm og λ
Em
= 600 nm. En kalibreringskurve ble fremstilt ved forskjellige konsentrasjoner av fri Ada-Dox.
flowcytometrisystemer
flowcytometrisk analyse ble utført på en FACS (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) ved å telle 10000 hendelser. For å evaluere apoptose av celler behandlet med forskjellige medikamenter ved ekvivalente konsentrasjoner, ble Dox, Ada-Dox, facd-Ada-Dox og NFACD-Ada-Dox ved en sluttkonsentrasjon på 5,0 uM tilsatt til de fremstilte 35 mm petriskåler inneholdende 2 × 10
5 HT-29, MCF-7 eller JAR celler i 3,0 ml kulturmedium. Cellene ble inkubert i 2 timer for å tillate opptak av narkotika. Før analyse ble cellene grundig vasket med PBS tre ganger, trypsinisert og resuspendert i mediet etter inkubering. De oppsamlede celler ble på nytt dispergert i 500 ul frisk PBS og farget med 20 ul DAPI på 1,0 pM for flowcytometrisk analyse. Fluorescens Dox relaterte molekylet ble målt med λ
EX
på 490 nm og λ
EM
ved 600 nm. De ubehandlede celler inkubert med DMEM alene (inneholdende 10% FBS, supplert med 1% penicillin) ble anvendt som kontroller.
Folat Reseptor-Binding konkurranseanalyse
I den medikamentopptak konkurranseanalyse , JAR-celler (FR positiv) ble sådd ut på 35 mm petri-skåler inneholdende 5 x 10
5-celler og inkubert ved 37 ° C med facd-Ada-DOX ved 2 uM i 5 timer i nærvær av FA ved 5, 10 eller 50 mikrometer. Deretter ble cellene vasket med PBS tre ganger, trypsinisert og resuspendert i PBS. De innsamlede celler ble re-spredt og fluorescensstyrkene ble bestemt av strømningscytometer.
Confocal Laser Scanning Mikros
Confocal bildene ble tatt opp med en PerkinElmer Ultra ERS spinne disk confocal mikroskop (PerkinElmer Inc. , Waltham, MA). JAR eller JEG-3-celler ble sådd på dekkglass i to-brønners plater, og dyrket over natten. Cellene ble deretter inkubert med eller uten 5,0 mM medikamenter i 2 timer. Cellene ble vasket med PBS tre ganger for å fjerne ubundet narkotika og løst i 2 ml av 4% paraformade ved romtemperatur i 15 min. Fikserte celler ble vasket tre ganger og deretter montert med medium inneholdende DAPI (1,5 ug /ml). Lysbilder ble kurert over natten i mørket. For å studere opptak av legemidler over 2 timer i celler behandlet med ulike medikamentkomplekser ble cellene eksponert for legemidler med forskjellige inkubasjonstider (15 min tilvekst). Bildene ble samlet inn og analysert.
Molekylær Docking av bindingen av FA og dens Konjugater Human Hedgehog Samhandle Protein (HHIP)
Dessverre, det krystallstrukturer av menneskers og dyrs RCF /SLC19A1, FR /FRα /FLOR1, FRβ /FLOR2, FRγ /FLOR3, FRδ /FLOR4 og PCFT /SLC46A1 har ikke blitt løst så langt. Ingen strukturer av bakterier og gjær homologer er blitt rapportert, og dermed er det lite sannsynlig å bygge opp en homologi modell. Vi gjennomførte foreløpige docking studie av FA og dets konjugater til HIPP som inneholder en FRα domenet ble undersøkt ved hjelp av Discovery Studio 3.1 (Accelrys Software Inc., San Diego, CA) som beskrevet av oss tidligere [17], [18]. Flere funksjonelle moduler i Discovery Studio 2.1 ble brukt, inkludert Diverse Konformasjon Generation, Beregn molekylære egenskaper, Opprett Multippel lineær regresjon modell, og CDOCKER. Programmet ble kjørt bruker en Dell optiplex755 server og Chemoffice2002 (CambridgeSoft, Cambridge, MA) ble brukt for sammensatte strukturelle raffinement. Krystallstrukturen av HHIP ble valgt fra Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/pdb/) med PDB ID 2WFT [19] som ble funnet å inneholde en FRα domenet når vi søkte på Pcam 26,0 database (https://pfam.sanger.ac.uk/). Den Pfam databasen er en stor samling av protein familier, hver representert ved flersekvenssammenstillinger og skjulte Markovmodeller. De molekylære dynamikk (MD) simulert gløding prosess utført ved hjelp av en stiv protein og fleksibel ligand. De ligand-FRα interaksjoner ble beregnet fra enten GRID jeg, GRID II, eller hele kraftfeltet. En endelig minimalisering ende trinn ble påført på hver av liganden er tilkoblings utgjør. Under ligand forberedelse ble duplikat struktur slettet. Alternativene for ionisering endring, tautomer eller isomer generasjon, Lipinski filter og 3D generator ble alle satt true [20]. Etter raffinert med CHARMM ble forbindelsene forankret til den mulige bindingssetet av proteinet. Forankrings ble gjennomført med hensyn til elektrostatisk energi og van der Waals (vdw) kraft, som ble myknet på ulike nivåer i løpet av dokking prosessen, men dette oppmykning fjernes for den endelige minimering [21] .For hver definerte vdw eller elektrostatisk sonde , samspillet med alle protein atomene ble lagret ved disse gitterpunkter. For ligand-atomer som ligger mellom gitterpunktene, ble en tri-lineær interpolasjon benyttes for å approksimere energier. En harmonisk potensial med kraften konstant på 300 kcal /mol ble påført på utsiden av rutenettet grensen.
Fastsettelse av Cellular reaktive oksygen arter (ROS) Nivåer
De intracellulære ROS-nivåer i mus H9C2 (2 -1) celler ble kvantifisert ved hjelp av CM-H
2DCFDA som sonden for ROS produksjon [22]. CM-H
2DCFDA er et klormetylderivat av H
2DCFDA, som er nyttig som en indikator for ROS i celler. H9C2 (2-1) celler ble sådd på en tallerken ved en tetthet på 3 x 10
6-celler per brønn og dyrket i 5% CO
2 ved 37 ° C i 24 timer. Cellene ble behandlet med Dox, Ada-Dox, facd-Ada-Dox, eller NFACD-Ada-Dox, og deretter skylt med PBS. Etterpå ble fluorescensintensiteten målt. Medikamentkonsentrasjonen var 2,0 pM i H9C2 (2-1) celler. Kontrollcellene ble behandlet med kjøretøyet DMSO til en sluttkonsentrasjon på 0,05% (v /v).
Intracellulær ROS-nivåer i mus 3T3-celler ble kvantifisert ved hjelp av dichlorofluorescein analyse [23]. 3T3-celler ble utsådd på en 96-brønns plate ved en densitet på 10
5 celler per brønn og dyrket i 5% CO
2 ved 37 ° C i 24 timer. Cellene ble behandlet med Dox, Ada-Dox, eller facd-Ada-Dox ved 5,0 uM, og cellene ble deretter skylt med PBS, hvorpå 75 ul PBS og 25 ul oppløsning av 2 «, 7»-dichlorfluorescein-diacetat (DFCH-DA) ved en endelig konsentrasjon på 62,5 uM i PBS-buffer ble tilsatt til hver brønn. Fluorescensen fra hver brønn ble målt ved 35 ° C umiddelbart etter inkorporering av reagenset og hvert 5. minutt i 1 time med 1 sek integrasjonstiden, ved hjelp av 485 og 535 nm eksitasjon og emisjonsbølgelengder. Registrering av fluorescens-intensitet med tiden ble brukt som en indeks for de enkelte intracellulære nivåer av ROS i 3T3-celler. Responsen av metoden ble kontrollert ved hjelp av en H
2o
2 kurve. Fem uavhengige eksperimenter ble utført per behandling.
Måling av glutationperoksidase (gpx) Aktivitet og GSH innhold
Proteininnholdet ble bestemt ved hjelp av BCA-metoden etter protein utvinning fra cellene. Virksomheten i GPX og innholdet av GSH ble skalert til proteininnhold for å korrigere for forskjeller i biomasse av de ulike homogenates. Nivåene av GSH i cellene ble bestemt i henhold til metoden ifølge Beutler
et al
. [24] basert på dannelse av 2-nitro-5-tiobenzoic syre fra DTNB i nærvær av GSH. I korte trekk, ble 25 ul av trikloreddiksyre (15%) tilsatt til 50 ul av homogenatet, etterfulgt av sentrifugering ved 13 000
g
i 5 min ved 4 ° C. En supernatant aliquot (50 ul) ble blandet med 50 ul av 3,4 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) oppløst i PBS, 1 ml PBS, og 250 pl DTNB i PBS (20 mg /ml). Absorbansen ble målt ved 412 nm etter 15 minutter og sammenlignet med en standardkurve av GSH (0,01-0,5 mM). GPX-aktivitet ble målt basert på oksydasjon av GSH ved GPX koblet til forsvinningen av redusert nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat (NADPH) av glutation reduktase.
Statistical Analysis
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Sammenligningen av verdiene for flere behandlingsgruppene ble utført ved en- eller to-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Bonferroni multiple sammenligningstest ved
P
0,05. Forskjeller mellom to gruppene ble analysert ved hjelp av uparet Student
t
-test. En
P
verdien av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Syntese av FACDs og facd-Ada-Dox og deres strukturelle Bestemmelse av Spectral Techniques
.
den syntetiske prosedyre for FR målretting β-CD basert adamantane-Dox supramolecule er avbildet i figur 2. for å konstruere supremolecule ble rettet mot narkotika bærere forberedt først. Mono-6-amino-6-deoksy-CD (NH
2-CD) ble syntetisert som utgangsmateriale i henhold til fremgangsmåten ifølge Petter
et al
. [25] med noen modifikasjoner. b.
