Abstract
Pasienter med kreft i eggstokkene (OC) kan behandles med kirurgi, cellegift og /eller strålebehandling, selv om ingen av disse strategiene er svært effektive. Flere plantebaserte naturlige produkter /kosttilskudd, inkludert utdrag fra
Emblica
officin plakater (Amla), har vist potent anti-neoplastiske egenskaper. I denne studien fant vi ut at Amla ekstrakt (AE) har anti-proliferative effekter på OC celler både under
in vitro Hotell og
in vivo
forhold. Vi har også bestemt de anti-proliferative effekter av en av komponentene i AE, quercetin, på OC celler under
in vitro
forhold. AE fremkalte ikke apoptotisk celledød, men i betydelig grad øke uttrykket av autophagic proteiner beclin1 og LC3B-II under
in vitro
forhold. Quercetin også økt uttrykk av autophagic proteiner beclin1 og LC3B-II under
in vitro
forhold. AE også betydelig redusert uttrykk av flere angiogene gener, inkludert hypoksi-induserbar faktor 1α (HIF-1α) i OVCAR3 celler. AE handlet synergi med cisplatin for å redusere celleproliferasjon og øke uttrykk for autophagic proteiner beclin1 og LC3B-II under
in vitro
forhold. AE hadde også anti-proliferative effekter og indusert ekspresjon av autophagic proteiner beclin1 og LC3B-II i mus xenografttumorer. I tillegg AE redusert endotelcelle-antigen – CD31 positive blodårer og HIF-1α ekspresjon i mus xenograft tumorer. Sammen utgjør disse studiene indikerer at AE hemmer OC cellevekst både
in vitro Hotell og
in vivo
muligens via hemming av angiogenese og aktivering av autofagi i OC. Dermed kan AE være nyttig som et alternativ eller supplement terapeutisk tilnærming i å bidra til å bekjempe OC
Citation. De A, De A, Papasian C, Hentges S, Banerjee S, Haque jeg, et al. (2013)
Emblica
officin
Pakk induserer Autophagy og hemmer menneskelig Ovarian Cancer Cell Proliferation, angiogenese, Vekst av Mouse xenografttumorer. PLoS ONE åtte (8): e72748. doi: 10,1371 /journal.pone.0072748
Redaktør: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 13 mars 2013; Godkjent: 12 juli 2013; Publisert: 15 august 2013
Copyright: © 2013 De et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en UMKC utført fond og en VA Merit Award Grant (SKB, SB). Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller deltakelse av manuskriptet.
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft (OC) er den nest vanligste gynekologisk kreft og er den ledende årsak til. kreftdød blant kvinner i USA [1]. Hvert år blir ca 22 000 kvinner i USA er diagnostisert med OC, og 15.000 dødsfall skyldtes OC i 2011 alene [1]. OC er vanskelig å diagnostisere på et tidlig stadium (I /II), og er ofte ikke klinisk mistanke før det sprer seg og går videre til de senere stadier (III /IV). Derfor har OC en dårlig prognose, med en fem års overlevelse for alle stadier av ~ 47% [2]. For tiden kan OC behandles med kirurgi, kjemoterapi og stråling, med suboptimale resultater som vist med fem års overlevelse sitert ovenfor. Utviklingen av nye kreftmedisiner, eller kombinasjoner av legemidler for OC har ikke gitt betydelig grunn til å være optimistisk. Siden vanlige anti-kreft narkotika kan være svært giftig, er plante-avledet bioaktive forbindelser som undersøkes mer intensivt som alternative eller medhjelper terapi for ulike former for kreft [3]. Nye bevis tyder på at planteekstrakter har anti-tumor /anti-kreft /anti-proliferative virkninger på dyrkede humane tumorcellelinjer [4-7], og også ha en antiangiogen effekt på cancercellelinjer [8].
Amla (
emblica
officin
) er en fruited plante som har blitt anerkjent for sin medisinske verdi, og har vært brukt siden antikken i den indiske tradisjonelle systemet av medisin «Ayurveda» for å behandle flere sykdommer, inkludert kreft [9-11]. Frukten av amla planten inneholder 11 kjent medisinsk relevante komponenter som gallussyre, ellaginsyre, 1-O-galloyl-beta-D-glukose, 3,6-di-O-galloyl-D-glukose, chebulinic syre, quercetin , chebulagic syre, corilagin, 1,6-di-O-gallolyl beta-D-glukose, 3-ethylgallic syre, isostrictiniin og askorbinsyre [9]. Grenene av denne planten inneholder syv bioaktive forbindelser – geraniin, phyllanemblinins C og E, prodelphinidin B1, (2) -epigallocatechin 3-O-gallate, (S) -eriodictyol 7- [6-O- (E) -p-coumaroyl ] -bD-glucoside [12]. Fra denne samling av forbindelser, gallussyre, ellaginsyre, 1-O-galloyl-beta-D-glukose, chebulinic syre, quercetin, chebulagic syre, corilagin, askorbinsyre, og geraniin har vist sterke anti-kreftfremkallende egenskaper hver for seg, og disse kan bidra til å forklare den anti-kreft egenskaper av hel amla ekstrakt (AE) [9,13]. AE er blitt vist å hemme proliferasjon av en rekke kreftceller
in vitro
, blant OC-celler, og også har vist anti-proliferative effekter
in vivo product: [9-11]. Nylig triphala, en urtemedisin som inneholder AE, har også demonstrert anti-angiogenese egenskaper [8].
På grunn av den potensielle verdien av AE som en anti-kreft terapi, spesielt for OC, vi har undersøkt anti- proliferative og anti-tumorigen effekter av AE i eggstokkene cellelinjer
in vitro Hotell og i en mus xenograft modell. Vi har også undersøkt effekten av AE på tumorangiogenese i dyrkede celler og en mus xenograft modell. Vi har observert at AE ikke indusere apoptotisk celledød, men kunne i betydelig grad øke ekspresjonen av autophagic protein i vevskultur og mus xenograft modell. Vi har også observert at AE handlet synergi med cisplatin for å redusere celleproliferasjon og øke uttrykk for beclin1 og LC3B-II under
in vitro
forhold.
Materialer og metoder
Etikk Uttalelse
Alle dyrene ble vedlikeholdt i henhold til standard retningslinjer for American Association for Akkreditering av Laboratory Animal Care. Studien ble godkjent av Institutional
Animal Care og bruk komité i Kansas City VA Medical Center (Kansas City, MO).
Cell kultur og reagenser
OVCAR3, SW626 og normale humane placentale celler (HS 799 pl) ble oppnådd fra American Type Culture Collection. Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) og trypsin ble kjøpt fra Sigma, St. Louis, MO. OVCAR3 og SW626-celler ble opprettholdt i DMEM med 10% føtalt bovint serum (Hyclone Laboratories, Logan, UT) og antibiotika på
OC 37 i en 5% CO
2 miljø. Alle celler brukt i denne studien var innenfor 10 passasjer etter mottak eller gjenvinning (~ 2 og 1/2 måneder med dyrking). AE for behandling ble fremstilt fra kommersielt tilgjengelige tabletter (Himalaya, USA, Houston, TX, som inneholder 250 mg Amla frukt og 350 mg Amla stilk pulver). En stamløsning av AE ble fremstilt ved veiing av AMLA tablettene, sliping dem, og å oppløse pulveret i endotoksin fri sterilt vann ved 10 mg /ml. Oppløsningen ble filtrert gjennom et 0,02 um celluloseacetatmembran og brukes til å behandle kulturen ved forskjellige konsentrasjoner.
Behandling
10000 OVCAR3 eller SW626-celler ble sådd ut i individuelle brønner i 24-brønners plater i 1 ml medium inneholdende 10% føtalt bovint serum og inkubert ved
OC 37 i 24 timer før starten av forsøkene. Etter den innledende plating ble mediet erstattet med 1 ml DMEM inneholdende serum (10%) og AE (0-400 ug /ml, i triplikat) for ulike tidspunkter (6-96 timer) ved
OC 37.
in vitro
kontroll (0 ug /ml AE) mottok bærer (vann) ved et volum tilsvarende den høyeste konsentrasjon av AE anvendt. Vi behandlet også OVCAR3 celler med forskjellige doser av quercetin (5-100 mg /ml, i fire eksemplarer) for ulike tidspunkter (6-96 timer) på
OC 37.
in vitro
kontroll (0 ng /ml quercetin) fikk bilen (DMSO, 4 ul, noe som tilsvarer volumet for 100 mikrogram /ml quercetin)
Celleproliferering
Celleproliferasjon ble målt ved hjelp av [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid)] (MTT) assays som beskrevet tidligere [14] med modifikasjoner [15]. OVCAR3 og SW626-celler ble dyrket i 24-brønners plater inneholdende DMEM og 10% FBS. Etter behandling, ble MTT (0,1 mg /brønn) tilsettes til cellene, fulgt av inkubering i 4 timer ved 37
OC. De formazankrystaller ble dannet ble oppløseliggjort ved inkubering av cellene med 1 ml av isopropylalkohol som oppløste det blå formazon produktet som oppstod i løpet av inkubasjon med MTT. Den optiske tetthet ble målt ved 560 nM på et spektrofotometer. Antallet funksjonelt aktive celler (dvs. optisk tetthet verdier) ble beregnet for sammenligninger mellom kontroll og behandlede grupper.
DNA-fragmentering
DNA ble fremstilt fra behandlede og ubehandlede kulturer som tidligere beskrevet [16 ]. I korthet, etter behandling ble cellene lysert i 100 ul lyseringsbuffer (100 mM Tris, pH 8,0, 20 mM EDTA, 0,5% SDS) ble behandlet med 50 ug /ml DNase-fri RNase ved
OC 37 ° C i 30 min og 100 ug /ml proteinase K i 2 timer ved 50
OC. DNA ble deretter ekstrahert med fenol-kloroform og kloroform og utfelt i 3 volumdeler etanol. DNA (1 pg /felt) ble elektroforert på 1% agarosegeler. Molekylvekt standarder ble kjørt samtidig. Gelene ble farget med etidiumbromid og fotografert ved å bruke et Chemidox (BioRad, Hercules, CA).
RNA ekstraksjon
Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved anvendelse av Trizol OVCAR3 ekstraksjonsmetoden. mRNA kvantitet og kvalitet ble bestemt ved å måle absorbansen i Genesys 6 Skanning UV /VIS Scanning spektrofotometer og også ved hjelp av RNA Experion® chip (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA).
Gene Array
Differential uttrykk for angiogenese regulatoriske gener ble analysert ved hjelp Oligo GEArray gitt av produsenten (SA Bioscience Corporation, Frederick, MD, USA). I korthet 3μg total RNA ble revers transkribert til Biotin-16-dUTP-merkede cDNA-prober med den TrueLabeling-AMP-metoden ved bruk av 16 pl 2,5x RNA polymerase, 2 pl 10 mM biotinylert UTP, RNA Polymerase 2 pl. De SuperArray membraner (BHT-026) ble for-hybridisert ved
OC 60 ° C i 2 timer. Hybridisering av biotin-merkede cDNA-prober til membranene ble utført ved
OC 60 over natten med langsom omrøring. De hybridiserte Membranene ble vasket i saltoppløsning natriumcitrat-buffer (en gang i 2 x SSC, 1% SCS og én gang i 0,1 x SSC, 0,5% SDS). Membranene ble inkubert med alkalisk fosfatase-konjugert streptavidin, og deretter med den kjemiluminescerende substrat CDP-Star. Bilder av membranene ble anskaffet ved hjelp av Chemidoc XRS system (BioRad) og datasettene ble eksportert til GEArray Analyzer, programvaren utviklet av SA Bioscience og analysert. Den relative Ekspresjonsnivået av hvert gen ble bestemt ved å sammenligne signalstyrken for hvert gen i matrisen etter korreksjon for bakgrunns og normalisering.
In vivo tumorstudier
Åtte uker gamle nakne mus (nu /nu genotype, Harlan Laboratories (Madison, WI) ble opprettholdt med vann og mat
ad libitum
i et patogen fritt miljø med en 12 timers lys og 12 timer mørke-syklusen i en dyr vare anlegget på Kansas City VA Medical Center. Animal omsorg og eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til vedtatte retningslinjer for Animal Care og bruk komité Kansas City VA Medical Center. OVCAR3 celler (5×10
4) med Matrigel ble injisert subkutant i høyre bakre flanken hver mus (4-5 mus pr gruppe). tumor~~POS=TRUNC vekst~~POS=HEADCOMP ble overvåket etter 2
nd dag av injeksjonen og fortsatte inntil 24 dager. tumor lengde og bredde ble målt ved hjelp av en skyvelære, og tumorvolumet ble beregnet ved bruk av formelen :. tumorvolum = lengde x bredde x 0,5 bredde
Seks dager etter injeksjon ble musene tilført oralt med 10% sakkarose (kontroll) eller 10% sukrose med AE daglig (100 mg /kg kropps wt.). Dosen 100 mg /kg kroppsvekt ble valgt basert på en forstudie der denne dosen viste optimal effekt på hemming av tumorvekst. Etter 18 dager med AE behandling, ble musene avlivet og svulstene ble fjernet og fiksert i 4% bufret formaldehyd for videre studier.
Immunohistochemistry
Immunohistokjemi ble utført på 4% formalin fast parafin-embedded vevssnitt i henhold til våre tidligere metoder [17,18]. Kort sagt ble vevssnitt fiksert i 4% bufret formaldehyd og deparaffinized i xylen, rehydratisert i synkende konsentrasjoner av alkohol, vasket med PBS og blokkert med blokkeringsserum (Immpress-Vector Laboratories, Burlingame, CA) i 20 minutter. Seksjonene ble inkubert med beclin1, LC3B-II (Cell Signaling, Boston, MA), CD31, Ki67 (Abcam, Cambridge, MA) eller HIF-1α (Novus Biologicals, Littleton CO) antistoff (1: 500 for alle antistoffer) over natten i et fuktig kammer ved 4
OC. Den immunoreaktivitets ble oppdaget ved hjelp av sekundære antistoffer konjugert til streptavidin (Immpress-Vector Laboratories) og delene ble kontra med hematoksylin. Seksjonene ble fotografert med en Leica digital photomicroscope. For kvantifisering av microvessels, ble vevssnitt analysert ved 50X forstørrelse og CD31-positive fartøyer ble telt. Fire områder fra hver av 3 seksjoner per svulst ble analysert.
OVCAR3 celler ble fiksert i 4% bufret formaldehyd og vasket i PBS. Etter blokkering i blokkering av serum ble cellene inkubert med beclin1, LC3B-II eller HIF-1α (1: 200) antistoff over natten ved 4
OC. Cellene ble vasket og immunoreaktivitet ble påvist som beskrevet ovenfor. Antallet immunostained celler og totalt antall celler ble talt og prosentandelen av celler med immunolabeling ble beregnet.
Western-blot
Western blots ble utført som tidligere beskrevet [19]. I korthet, ble proteinet ekstrahert enten fra OVCAR3, SW626 celler eller fra svulster og konsentrasjonen av protein ble målt ved BCA-proteinanalyse-metoden (Pierce, Rockford, IL). Hver prøve (50 ug) ble kjørt på en SDS-natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel. Proteinet ble overført til en nitrocellulosemembran. Membranen ble inkubert med blokkerende serum (Thermoscientific, Pittsburgh, PA) i 1 time ved romtemperatur fulgt av inkubering over natten ved
OC med antistoff til Bax, BCL2, Caspase 3 4, spaltes caspase 3, caspase 7, beclin1 eller LC3B -II (1: 1000, Cell Signaling) eller HIF-1α (1: 1000, Abcam). Etter vasking med Tris-NaCl-Tween 20 buffer, ble membranen inkubert med sekundære antistoffer (1: 10000, Abcam) ved romtemperatur i 1 time. Immunoreaktivitets ble oppdaget ved hjelp av forbedret chemiluminescence (Thermoscientic).
Statistisk analyse
Analysene ble utført i tre eksemplarer og hvert forsøk ble gjentatt to ganger. Alle grafiske data vises som gjennomsnitt + SEM Betydning ble testet ved hjelp av uparet, to-tailed Student t-tester med ulik varians (Microsoft Excel, Redmond, Washington).
p
0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
AE hemmer OVCAR3 og SW626 celler spredning
For å finne ut om AE kan påvirke cellevekst, testet vi dens effekt på tre ulike cellelinjer : 1) en ovarial cancer celle (OVCAR3), 2) en primær adenokarsinom i tykktarmen spredning på eggstokk (SW626), 3) en normal menneskelig placenta-celler (HS 799). Normale placentale celler ble anvendt for å bestemme om AE har noen effekt på ikke-neoplastiske celler. I tillegg brukte vi SW626 celler for å bestemme om AE er i stand til å hemme svulster som hadde metastasized fra andre steder på eggstokkene, og for å bestemme hvorvidt effekten av AE på OVCAR3 vil bli duplisert med andre kreftceller. OVCAR3 celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner av AE (0-1000 ug /ml) i 24 timer og det relative antall av celler ble utledet ved hjelp av MTT-analyser. Lave konsentrasjoner (10-200 ug /ml) av AE ikke påvirker celleproliferasjon; imidlertid, celleproliferasjon ble betydelig inhibert ved AE konsentrasjoner i området fra 300-1000 ug /ml (figur 1A). Vi behandlet normale placenta-celler (HS 799 pl) med forskjellige doser (100-500 ug /ml) av AE i 48 timer for å bestemme om AE var generelt cytotoksisk, og fastslått at AE hadde hovedsakelig ingen virkning på celleoverlevelse ved noen av konsentrasjonene testet (figur 1B). Vi behandlet både OVCAR3 og SW626-celler i kultur med økende konsentrasjoner av AE i forskjellige tidsrom før gjennomføring MTT-analyser. Hurtig tap av celleproliferasjon oppstod med økende konsentrasjoner av AE i både OVCAR3 og SW626-celler (figur 1A, 1C, 1D). I begge cellelinjer, inhibering av celleproliferasjon indusert ved AE var avhengig av både konsentrasjonen og inkubasjonstiden (figur 1C, 1D). Den laveste konsentrasjon av AE testet (100 ug /ml) forårsaket signifikant inhibering (p = 0,001) av OVCAR3 celler ved 72 timer, og den høyeste dose (400 ug /ml) er en potent hemmet (p = 0,007) vekst OVCAR3 celler ved 12 time (figur 1C). I SW626-celler, AE-100 ug /ml forårsaket signifikant inhibering av 48 timer (p = 0,001), og ved den høyeste dosen veksten ble hemmet (p = 0,001) etter 6 timer (figur 1D)
A. Doseavhengig effekt av AE på spredning av OVCAR3 celler. B. doseavhengig effekt av AE på celledød i normale placenta celler (HS-799 pl). C-D. Tid og doseavhengige effekter av AE på spredning OVCAR3 (C) og SW626 (D) celler. E. doseavhengig effekt av quercetin på spredning av OVCAR3 celler. OVCAR3 og SW626-celler ble dyrket og dyrket i 2 dager i DMEM i nærvær av 10% serum som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Etter denne tiden ble kulturene matet med medium inneholdende 10% serum og forskjellige doser av AE i 24 timer, bortsett fra tidsavhengige studium. Dataene er middelverdien + S.E.M. fra 6 uavhengige observasjoner. *, P. 0,05, signifikant forskjellig fra bil-behandlet kontrollgruppe
quercetin hemmer celledeling i OVCAR3 celler
Etter å fastslå at AE dose- og tidsavhengig redusert celleproliferasjon i OVCAR3 celler, testet vi om behandling av OC-celler med ulike doser (0-100 ug /ml) av quercetin – en av komponentene i AE– kunne redusere celleproliferasjon i OVCAR3 celler. Den laveste konsentrasjon av quercetin testet (5 ug /ml) forårsaket signifikant inhibering (p = 0,01) av OVCAR3 celler ved 48 timer, og den høyeste dose (100 ug /ml) inhiberte (p = 0,005) vekst av OVCAR3 celler ved 24 timer (figur 1E).
AE endrer morfologi OVCAR3 og SW626 celler
Hemming av spredning kan endre størrelsen og morfologi av de enkelte cellene [20]. Derfor har vi nøye morfologi OVCAR3 og SW626 celler etter behandling med 0-300 mg /ml AE. Morfologien av OVCAR3-celler behandlet med 100 og 200 ug /ml AE var skjelnes fra ubehandlede celler etter 24 timer (figur 2 A-C), mens behandling med 300 ug /ml for 24 timers forårsaket fleste cellene til å bli rund ( Figur 2D). AE induserte også doseavhengige endringer i morfologien av SW626-celler etter 24 timer (figur 2E-H). Nærmere undersøkelser viste at behandling med 300 ug /ml i 24 timer AE indusert cytoplasmatiske vakuoler i både OVCAR3 og SW626-celler (fig 2J, 2N, 2L, 2P). Disse morfologiske forandringer tyder på at celledød kan ha oppstått fordi celledød er noen ganger ledsaget av vacuole formasjon [21]. Ytterligere eksperimenter ble utført ved anvendelse av 300 ug /ml konsentrasjon av AE.
A-D. Doseavhengig effekt av AE på morfologien og celletetthet på OVCAR3: A = Kontroll, B = 100 ug /ml AE, C = 200 ug /ml AE, D = 300 ug /ml AE. E-H. Doseavhengig effekt av AE på morfologien og celletetthet på SW626 celler. E = Control, F = 100 ug /ml AE, G = 200 ug /ml AE, H = 300 ug /ml AE. I-J, M-N. AE økt cytoplasmatiske vakuoler i OVCAR3. Jeg og M = Control, J og N = 300 ug /ml AE. K-L og O-P. AE økt cytoplasmatiske vakuoler i SW626. K og O = Control, L og P = 300 ug /ml AE. OVCAR3 og SW626-celler ble dyrket og dyrket i 2 dager i DMEM i nærvær av 10% serum som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Etter denne tiden ble kulturene tilført medium 10% serum og forskjellige doser av AE i 24 timer. Noen av vakuoler er indikert med piler (N og P). Bar = 50 mikrometer.
AE ikke føre til apoptotisk celledød i OVCAR3 og SW626 celler
I lys av de morfologiske endringene beskrevet ovenfor, noe som tyder på at behandling av OC cellelinjer med 300 ng /ml AE indusert celledød, ønsket vi å finne ut om AE behandling indusert apoptose av disse cellelinjene. Vi brukte to ulike tilnærminger for å utforske denne muligheten: 1) Undersøkelse av DNA for internucleosomal fragmentering, et kjennetegn på apoptotisk celledød, og; 2) Western blotting for spesifikke proteiner (f.eks Bax, BCL
2, caspase 3, spaltes caspase 3 og kaspase 7) som er involvert i den apoptotiske reaksjonsvei. For å bestemme om AE forårsaket DNA internucleosomal fragmentering, DNA fremstilt fra kontroll og AE-behandlede kulturer ble fraksjonert på 1% agarosegeler 24 og 96 timer etter tilsetning av AE (300 ug /ml). Selv om DNA degradering ble observert i disse preparater, var det ingen tilsynelatende DNA-fragmentering, selv etter 96 timers behandling (figur 3A-B), hvilket antyder at celledød ikke forekomme ved apoptose. For ytterligere å undersøke den potensielle rolle apoptotiske baner i døden av AE behandlede celler, Western blot for Bax, BCL
2, caspase 3, kløyvde caspase 3 og caspase 7 ble utført. I OVCAR3 celler, AE behandling redusert uttrykk for Bax, BCL
2 og kløyvde caspase 3 (figur 3C, 3E og 3I), og ikke endre uttrykket av caspase 3 eller caspase 7 proteiner (Figur 3G og 3K). I SW626 celler, gjorde AE behandling ikke endre uttrykket av Bax, BCL
2, caspase3, eller caspase7 (Tall 3D, 3F, 3H og 3L) og redusert uttrykk av spaltede caspase 3 (figur 3J). Kollektivt, resultatene støtter konklusjonen om at apopotic trasé ikke er aktivert i AE behandlet OC cellelinjer.
A-B. Representative fotografier av DNA fragmentering i celler OVCAR3 (A) og SW626-celler (B). OVCAR3 og SW626-celler ble behandlet med 300 pg /ml AE som beskrevet i Materialer og Metoder. Etter behandling, ble DNA ekstrahert og underkastet elektroforese på 1% agarosegel. Størrelsen på basepar av molekylvektmarkører (kolonne) er indikert ved siden av gelen. Tallet på høyre side angir lengden på nukleotider for flere av bandene. C24 = Kontroll 24 timer, C96 = Kontroll 96 time, T24 = AE 24 timers behandling, T96 = AE 96 timers behandling, + C = Positiv kontroll, S = DNA størrelse standard. C-L. Uttrykk for apoptotiske proteiner etter AE-behandling (300 ug /ml) i OVCAR3 og SW626-celler. Representative fotografier av Western blot av Bax (C, D), Bcl
2 (E, F), Caspase 3 (G, H), spaltet Caspase 3 (I, J), Caspase 7 (K, L) i OVCAR3 (C, E, G, i, K) og SW626 (D, F, H, J, L) celler etter AE behandling vises på toppen. β-actin ble oppdaget som en kontroll for hver blot. Histogrammet tilsvarer hvert bilde representerer forholdet av densitometrisk analyse av hvert bånd til den respektive β-aktin band. Kulturen ble behandlet med 0 eller 300 ug /ml AE i 24 time. Etter behandling, ble protein fra OVCAR3 og SW626-celler ble ekstrahert og 30 ug protein ble underkastet elektroforese på SDS-PAGE. Proteinet ble deretter overført til nitrocellulosemembran og immunoblottet mot apoptose-relaterte antistoffer – Bax, Bcl
2, Caspase 3, spaltes Caspase 3 eller caspase 7. Verdiene er middel + S.E.M. av 4 uavhengige forsøk. *, P 0,05, sammenlignet med kontrollgruppen
AE induserer autofagi i OVCAR3 og SW626 celler
Nylig
in vivo Hotell og
in vitro.
bevis tyder på at et antall av kreftmedisiner utøve sine effekter, i det minste delvis, gjennom sin virkning på autofagi [22,23]. Studiene ovenfor antydet at apopotic trasé ikke ble aktivert ved AE behandling, så vi valgte å avgjøre om autofagi ble aktivert i AE behandlede OC celler. Spesielt behandlet vi OVCAR3 og SW626 celler med AE for å undersøke virkningene på uttrykk for autophagic proteinantistof beclin1 og LC3B-II ved hjelp av immunocytokjemi og immunoblottingforsøk teknikker. Immunoreaktiviteten for både beclin1 og LC3B-II var til stede i ubehandlet OVCAR3 og SW626-celler (figur 4 A, B, E, F). Intensiteten av farging og antall immunopositive celler ble imidlertid økt med AE-behandling [Figur 4 A-H]. Western blot-analyse var i overensstemmelse med resultatene av farging, noe som demonstrerer at AE behandlingen økte ekspresjon av beclin1 og LC3B-II i både OVCAR3 og SW626-celler (figur 4 I-P). Disse data tyder på at autophagy aktiveres i AE behandlede celler. Vi studerte også uttrykk for autophagic proteiner beclin1 og LC3B-II etter quercetin behandling (5 mikrogram /ml for 48 timer) i OVCAR3 celler ved hjelp av immunoblotting. Ekspresjon av beclin1 og LC3B-II var betydelig høyere i quercetin behandlede celler enn kontroll (figur 4 Q-T).
Farging av beclin1 og LC3B-II i OVCAR3 og SW626 kontrollcellene, og etter å ha blitt behandlet med 300 ug /ml AE (A, B, E og F). Histogrammene viser prosentandelen av beclin1 (C og D) og LC3B-II (G og H) immunopositive celler i prosent av totale celler. OVCAR3 og SW626-celler ble dyrket og dyrket i 2 dager i DMEM, i nærvær av 10% serum som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Etter denne tiden ble kulturene matet med medium inneholdende 10% serum og AE i 24 timer. Celler ble fotografert ved 400 x forstørrelse. Ekspresjon av beclin1 i totalt protein av OVCAR3 (I) og SW626 (J) celler og ekspresjon av LC3B-II i totalt protein av OVCAR3 (M) og SW626 (N) celler etter å ha blitt behandlet med AE (300 ug /ml) i 24 t. Representant bilde av western blot for beclin1 og LC3B-II vises på toppen. β-actin ble oppdaget som kontroll for hver blot. Mean + S.E.M. densitometriske verdier av forholdet mellom beclin1 (K og L) og LC3B-II (O og P) med β-aktin er vist på undersiden av hver respektive gel. Q-T: quercetin behandling (5 ug /ml for 48 timer) induserer ekspresjon av beclin1 (Q, R) og LC3B-II (S, T) i OVCAR3 celler. Etter behandling, ble protein fra OVCAR3 og SW626-celler ble ekstrahert og 50 ug protein ble underkastet elektroforese på SDS-PAGE. Proteinet ble deretter overført til en nitrocellulosemembran og immunoblottet mot beclin1 og LC3B-II-antistoffer. Etter immundeteksjon, beclin1 og LC3B-II positive band ble målt densitometrically og normalisert med p-aktin verdier. Verdiene er middel + S.E.M. 6 uavhengige eksperimenter. *, P 0,05, sammenlignet med kontrollgruppen. Bar = 50 mikrometer.
AE hemmer angiogenese-relaterte gener i OVCAR3 celler
I lys av det faktum at et økende tumormasse må etablere en vaskulær forsyning, og de siste rapportene at angiogenese kan bli hemmet av urtemedisiner som inkluderte AE [8], vi ønsket å finne ut om AE kunne hemme angiogenese
in vitro
. Nærmere bestemt, studerte vi effektene av AE behandling for ekspresjon av gener i angiogene AE-behandlede (300 ug /ml) og ubehandlede OVCAR3 celler ved hjelp av Menneskelig angiogene OligoGE Array som detekterer 112 gener som er spesielt involvert i angiogenese (SA Bioscience Corporation). Forsøkene ble utført i tre uavhengige undersøkelser, og resultatene er vist i figur 5 A-D. Mange gener (grønn
*) ble uttrykt ved reduserte nivåer i AE-behandlede celler sammenlignet med ubehandlede kontroller (figur 5B). En clustergram som viser resultatene oppnådd i kontroll og AE-behandlede kulturer er vist i figur 5C. Uttrykket av COL4A3, CXCL6, ECGF1, EFNB2, FGF2, IL1β, PDGFB, TNFRSF12A og HIF-1α ble redusert til mindre enn 40% av kontrollnivåer (figur 5D), med HIF-1α blir hemmet i størst grad.
A. De representative fotografier av micro array fra kontroll og AE-behandlet kultur. Kulturen ble behandlet med 0 eller 300 ug /ml AE i 24 timer. Etter behandling, ble RNA isolert ved anvendelse av TRIzol-ekstraksjonsmetoden. De superarray Membranene ble hybridisert med biotin-merket cDNA, inkubert med alkalisk fosfatase-konjugert streptavidin, ble genekspresjonen detektert med den kjemiluminescerende substrat CDP-Star. B. Representant scatterplot av AE-behandlet vs kontroll cellekulturer. Mange gener (grønn
*) er under uttrykt i AE-behandlede gruppen. C. Venstre panel: Heat kartet (clustergram) av kontroll og AE-behandlede kulturer. Ni gener som er redusert med mer enn 70%, er angitt med pilene på høyre side av kartet varmen. Midtre panelet: En forstørret varmen kart som viser redusert uttrykk av HIF-1α i AE-behandlede gruppen. Høyre panel: Omfanget av genuttrykk. D. Grafisk fremstilling av den relative genuttrykket ved hjelp av global bakgrunn og GAPDH som referanse genet og konvertert til innfellbar endre verdier (AE versus kontroll).
AE hemmer uttrykk for HIF-1α in vitro
i de ovenfor angitte forsøk, viste vi at AE behandling undertrykket ekspresjon av mange gener assosiert med angiogenese. For å avgjøre om redusert genekspresjon samsvarer med redusert protein nivåer, vi spesielt undersøkt effekten av AE behandling på produksjon av HIF-1α protein i OVCAR3 celler ved hjelp av immunocytokjemi og Western blot. Både immunocytokjemi og Western blot resultatene viste signifikant redusert ekspresjon av HIF-1α i OVCAR3 cellekulturer (Figur 6 A-B), noe som ytterligere støtter konseptet at AE behandling hemmer angiogenese.
A. Mikroskopbilde som viser redusert uttrykk av HIF-1α immunostatining i OVCAR3 celler etter AE behandling. Histogrammet viser prosentandelen av HIF-1α immunopositive celler i forhold til totalt antall celler. OVCAR3-celler ble dyrket og dyrket og behandlet med 0 eller 300 ug /ml AE i 24 timer. Celler ble immunostained med HIF-1α antistoff og fotografert ved 400X forstørrelse. Bar = 50 mikrometer. Verdiene er middel + S.E.M. av 4 uavhengige forsøk. *, P 0,05, sammenlignet med kontrollgruppen. B. En representant bilde av Western blot for HIF-1α er vist på toppen. β-actin ble oppdaget som en kontroll for hver blot. Mean + S.E.M. densitometriske verdier av forholdet av HIF-1α og β-aktin er vist på bunnen av gelen. Etter immundeteksjon, ble volumet av HIF-1α positive bånd målt densitometrically og normalisert med p-aktin-verdier. Verdiene er middel + S.E.M. av 4 uavhengige forsøk. *, P 0,05, sammenlignet med kontrollgruppen.
