Abstract
Pasienter med fremskreden prostatakreft nesten alltid utvikle osseous metastaser. Selv om mange studier indikerer at aktiveringen av NF-kB signalering synes å være korrelert med fremskreden kreft og fremmer tumormetastase ved å påvirke tumorcellemigrering og angiogenese, påvirkning av endrede NF-kB signalisering i prostatakreftceller innenfor Boney metastatiske lesjoner er ikke klart forstått. Mens C4-2B og PC3 prostatakreftceller vokser godt i benet, LNCaP-celler er vanskelig å vokse i murine ben følgende intraskeletal injeksjon. Våre studier viser at sammenlignet med LNCaP, er betydelig høyere i C4-2B og PC3 NF-kB aktivitet, og at aktiveringen av NF-kB signalisering i prostatakreftceller resulterte i økt ekspresjon av osteoclast-induserende gener PTHrP og RANKL. Videre kondisjonert medium avledet fra NF-kB aktivert LNCaP celler induserer osteoclast differensiering. I tillegg inaktivering av NF-kB signalering i prostatakreftceller inhiberte tumordannelse i benet, både i osteolytisk PC3 og osteoblastiske /osteoklastisk blandet C4-2B celler; mens aktivering av NF-kB signalisering i LNCaP-celler fremmes tumor etablering og proliferasjon i benet. Aktivering av NF-kB i LNCaP-celler resulterte i dannelse av en osteoblastisk /osteoklastisk blandet tumor med økt osteoklaster som omgir den nye dannede ben, i likhet med metastaser som vanligvis ses hos pasienter med prostatakreft. Disse resultatene indikerer at osteoklastisk reaksjon er nødvendig, selv i de osteoblastiske kreft celler og aktivering av NF-kB signalering i prostatakreftceller øker osteoclastogenesis med opp-regulering osteoclastogenic gener, for derved å bidra til beinmetastatisk dannelse
Citation.: Jin R, Sterling JA, Edwards JR, DeGraff DJ, Lee C, Park SI, et al. (2013) Aktivering av NF-kappa B signale fremmer vekst av prostata kreft celler i Bone. PLoS ONE 8 (4): e60983. doi: 10,1371 /journal.pone.0060983
Redaktør: Qiming Jane Wang, University of Pittsburgh School of Medicine, USA
mottatt: 16 august 2012; Godkjent: 05.03.2013; Publisert: 05.04.2013
Copyright: © 2013 Jin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet til RJ av Department of Defense (DOD) Prostate Cancer Research Program (PCRP) (W81XWH-10-1-0236); til JAS av TMEN (5U54 CA 126 505), Vanderbilt-universitetet Bone Senter PPG (5P01 CA40035) og Department of Veterans Affairs Career Development Award; til RJM av National Cancer Institute (4R01 CA076142-14) og Frances Preston Laboratories i T.J. Martell Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nesten alle pasienter med avansert prostatakreft (PCA) utvikle osseus metastasering. Utviklingen av tumorvekst i benet er den mest kritiske komplikasjon av avansert PCa, som ofte resulterer i betydelige sykelighet og dødelighet [1]. I motsetning til andre typer kreft, er en innledende metastatisk innskudd på PCA celler nesten strengt begrenset til bein og er ofte det eneste stedet av distal spredning selv i sene stadier av sykdommen [2]. Når prostata kreftceller gå inn i skjelettet, en destruktiv syklus av brutto skjelettskader og tumorvekst oppstår, noe som medførte at kurativ behandling er ikke lenger mulig og palliativ behandling blir det eneste alternativet. Median tid mellom diagnosen av en klinisk tydelig skjelettmetastaser og død er ca 3-5 år [3]. Derfor forstå mekanismen ved hvilken PCA-cellene trives i benet miljøet og utvikling av effektiv metode (r) for å forebygge eller behandle PCa benmetastase er kritisk for å øke overlevelsen av avanserte PCA-pasienter.
I motsetning til andre faste tumorer som er assosiert med osteolytiske benmetastaser, er PCa benmetastase forbundet med osteoblastiske metastase. Imidlertid er vellykket kolonisering av benet ved PCA-celler krever både osteolytisk og osteoblastiske prosesser. Dette skjer blant annet fordi PCA-celler er i stand til å produsere vekstfaktorer som kan påvirke både osteoblaster og osteoklaster, hvilket resulterer i osteoblastisk bendannelse og overdreven benresorpsjon [1], [4]. Mens rollen til osteoblaster i PCa benmetastase er vel anerkjent, flere funn foreslår sterkt en viktig rolle for osteoklastfunksjonen i den vellykkede dannelse av PCA benmetastaser [5] – [10]. For eksempel når PCA celler utgangspunktet kolonisere et bein, de trodde først indusere osteoclastogenesis [11], og påfølgende benresorpsjon. Histomorphometric bevis indikerer at osteoblastiske metastaser dannes i trabekulært ben i områder av foregående osteoklastresorpsjonstest og slik resorpsjon er nødvendig for etterfølgende osteoblastisk bendannelse [12]. Disse funnene tyder på at PCa induserer bein deponering gjennom en generell økning i beinremodeling. I tillegg bidrar osteoklastisk benresorpsjon til flertallet av skjelettfølgetilstander, eller skjelettrelaterte hendelser (SRE, for eksempel brudd og smerter), hos pasienter med skjelettmetastaser. Videre osteoklastisk benresorpsjon også bidrar til etableringen av tumorer i skjelettet. Derfor er osteoclastogenesis indusert ved PCA-celler foreslått å være et tidlig begivenhet av benmetastase og er en nødvendig forutsetning for innledende PCa ben kolonisering. Selv om begrepet osteoklastprotonpumpen aktivering som en underliggende del av PCa vekst i bein er allerede godt anerkjent, de mekanistiske detaljer der PCA cellene øker osteoclast aktivering og deretter overtale metastaser til skjelettet miljø er fortsatt uklart.
Det er nå en utbredt oppfatning at den molekylære triaden – receptor Activator av NF-kB ligand (RANKL), dens reseptor RANK, og den endogene løselig RANKL inhibitor, osteoprotegerin (OPG) – spille viktige og direkte rolle i dannelsen, funksjon og overlevelse av osteoklaster. Mange studier har indikert at RANKL /RANK /OPG er viktige regulatorer av beinmetabolisme både i normale og patologiske tilstander, inkludert PCA benmetastaser [13], [14]. Et annet viktig genet, parathyroid hormon-relatert protein (PTHrP), er kjent for å være involvert i osteoclast differensiering. PTHrP fremstilles av nesten alle tumorer som metastaserer til benet, og en rekke studier har vist en sammenheng mellom PTHrP ekspresjon og skjelett lokalisering av tumorer. PTHrP har fremtredende effekter i benet via dets interaksjon med PTH-1-reseptoren på osteoblastiske celler. Gjennom indirekte midler, støtter PTHrP osteoclastogenesis med opp regulerende RANKL i osteoblaster [15]. PCA-celler er blitt vist å uttrykke en rekke faktorer som regulerer osteoclastogenesis, inkludert PTHrP, makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF), medlemmer av den transformerende vekstfaktor β (TGF-B) superfamilien, og urokinase-type plasminogen aktivator (uPA- plasmin), som resulterer i aktivering av matriks-metalloproteinaser (MMP, spesielt MMP-2 og MMP-9), så vel som interleukin-1 (IL-1) og interleukin-6 (IL-6) [16]. Imidlertid identifikasjon av den kritiske mekanisme (r) eller den primære reaksjonsveien (e) som er ansvarlig for den første ekspresjon av osteoclastogenic gen (er) og overdreven resorpsjon resulterer i markedsføringen av PCa benmetastase fortsatt ukjent.
Det er allment akseptert at RANKL /RANK /OPG er viktige regulatorer av beinmetabolisme og PTHrP er en av de viktigste nøkkel regulatorer i osteoclast og osteoblastdifferensiering. Derfor, i denne studien har vi fokusert på å forstå hvordan RANKL og PTHrP er regulert i PCA celler ved NF-kB. NF-kB proteiner er en viktig klasse av transkripsjons regulatorer ved PCA. Rikelig data støtter en viktig rolle for NF-kB signalveien ved regulering av initiering og progresjon av kreft hos mennesker [17] – [20]. Den over-ekspresjon av NF-kB i kjernen av PCA-celler synes å være korrelert med PCa chemoresistance, avansert stadium, PSA tilbakefall og metastatisk spredning [21] – [27]. Flere studier har publisert bevis som indikerer at NF-kB veien er en bidragsyter til visceral eller «myk tissue» metastase i PCa [18], [19], [28], [29]. Tidligere har vi rapportert at aktivering av NF-kB signale fremmer kastrering-resistente vekst av PCa [30]. I denne studien undersøkte vi rollen til NF-kB signalisering i koloniseringen av PCA-celler i benet miljø og rollen til denne mekanismen spiller i skjelett ødeleggelse assosiert med PCa benmetastase. Vi rapporterer at aktiveringen av NF-kB signale øker ekspresjon av gener osteoclastogenic i PCA-celler, som er tilstrekkelig for kreftceller til å feste seg og vokse i benet miljø og forbedre lesjonsdannelse. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten som aktivering av NF-kB signalisering i PCA celler øker osteoclastogenesis med opp regulerende osteoclastogenic gener, og dermed bidra til benmetastaser formasjon. Vår studie viser at targeting nedregulering av NF-kB kan ha en stor innvirkning på å redusere smertefulle beinmetastaser i avanserte PCA pasienter.
Materialer og metoder
Cell kultur og materialer
Den menneskelige prostata carcinom cellelinjer LNCaP og PC-3 ble oppnådd fra ATCC (Manassas, Virginia). C4-2B celler var gaver av Dr. Leland Chung (Cedars Sinai Medical Center, Los Angeles, California) [31]. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i luft. Cellelinjer ble rutinemessig dyrket i RPMI 1640 (Gibco-BRL) medium inneholdende 5% føtalt kalveserum (FBS) (Hyclone), 0,1% ITS og 0,1% glutamin (Gibco-BRL).
Generering av NF-kB kB signale kontinuerlig aktivert /inaktiv PCA cellelinjer
For å generere en konstitutivt aktivert NF-kB signale PCa cellelinje, ble LNCaP celler stabilt infisert med IKK2-EE retroviral vektor som resulterer i LNCaP-EE, hvor NF-kB aktiviteten ble aktivert med en konstitutivt aktiv (EE) mutanter av IKK2 [32], [33]. For å generere NF-kB signale kontinuerlig inaktiv PCA-cellelinjer, ble C4-2B og PC3-celler som stabilt infisert med IKK2-KD retroviral vektor (C4-2B-KD og PC3-KD), hvor NF-kB aktivitet ble inhibert med en kinase død (KD) IKK2 mutant [32], [33]. Cellene som er infisert med tom vektor ble anvendt som kontroller (LNCaP-EV, C4-2B-EV og PC3-EV). Alle retrovirale vektorer var en gave fra Dr. Martin Leverkus, Universitetet i Magdeburg, Tyskland.
Reverse Transcription og Real-time PCR
Total RNA fra LNCaP, LNCaP-EE, C4-2B og PC3-celler ble ekstrahert ved bruk av Trizol (Gibco-BRL), og gjenværende genomiske DNA ble fjernet ved DNaseI (Invitrogen) behandling. De RNA ble revers transkribert ved hjelp av tilfeldige primere og Hevet II (Gibco-BRL) i henhold til produsentens protokoll. Primerne anvendt for å amplifisere RANKL var 5′-TGGAAGGCTCATGGTTGGAT-3 «(fremover), 5′-CATTGATGGTGAGGTGTGCAA-3′ (revers); PTHrP var 5»-TTAAAGCAGTACCCCCCTACCA-3 «(fremover), 5′-ATGGGCTCTAGCGCCTCTCT-3» (bakover). Real-time PCR-reaksjoner ble utført i et 20 ul volum ved anvendelse av en 96-brønners plateformat og fluorescens ble påvist anvendelse av Bio-Rad I-Cycler IQ sanntid deteksjonssystem. Genekspresjon ble normalisert til 18s rRNA av 2
-ΔΔCt metode [34].
RANKL ELISA og PTHrP Radio-immunanalyser (RIA)
For å bestemme RANKL og PTHrP nivåer utskilt av PCA celler, LNCaP-EV, LNCaP-EE, PC3-EV og PC3-KD-celler dyrket separat for 48 timer; celle tall ble talt. 40 og 100 mL av kultur media ble brukt i ELISA (MyBioSource) og RIA (Beckman Coulter) per produsentens instruksjoner, henholdsvis. Hver prøve ble analysert i tre eksemplarer av ELISA-leser eller en gammateller (Beckman Coulter) og konsentrasjoner ble bestemt i henhold til produsentens instruksjoner.
Western blot analyse
Hele cellelysat ble hentet fra NF-kB aktiverte /inaktiv PCA celler. En 20 ug prøve av hver proteinprøve ble separert på en 4 til 12% Tris-glysin-gradient-gel (NOVEX ™), og deretter overført til nitrocellulosemembraner (Schleicher PC3-EV og PC3-KD-celler). For å generere det kondisjonerte medium inneholdende sekret av PCA-celler, RPMI 1640 medium (inneholdende 5% FBS, 0,1% ITS og 0,1% glutamin) ble tilsatt til PCA cellekulturskåler. Etter 24 timer ble mediet innhøstet og overført til målrette celler (osteoblaster). MTT Analysen ble utført ved 48 timer etter behandling.
Mus modell av tumorindusert bein sykdom
Alle dyrestudier ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Vanderbilt Institutional Animal Care Bruk Committee (Permit Number: M /09/387). Både NF-kB aktivert (PC3-EV, C4-2B-EV og LNCaP-EE) og inaktivert (PC3-KD, C4-2B-KD og LNCaP-EV) PCA celler ble brukt for å undersøke om aktivering av NF- kB signalering bidrar til PCa svulst etablering og vekst i beinet miljø. For å redusere inter-vert variabilitet når man sammenligner kontroll- og testgrupper, NF-kB aktiverte og inaktiverte PCA-celler ble podet på samme mus. I hver enkelt vert, ble venstre tibia injisert med NF-kB aktivert PCa (PC3-EV, C4-2B-EV og LNCaP-EE) celler, mens høyre tibia ble injisert med NF-kB inaktivert PCa (PC3-KD, C4-2B-KD og LNCaP-EV) -celler, respektivt. Nærmere bestemt, en enkelt celle-suspensjon av 2 x 10
5 PC3-EV eller PC3-KD; C4-2B-EV eller C4-2B-KD; LNCaP-EV eller LNCaP-EE celler /10 ul PBS ble plassert direkte i 6-7 uker gamle atymiske nakne mus (BALB /c-stamme) ben ved intratibial injeksjon under isofluran anestesi, respektivt. Hver gruppe hadde en minimum 4 mus. Osteoblastiske lesjoner ble vurdert ved hjelp av små dyr X-ray røntgendiagnostikk (Faxitron LX-60, Lincolnshire). Etter offer, ble bein volum evaluert av mikro CT scanning og histologisk analyse på 3 (for PC3-EV og PC3-KD celler injisert mus) og 10 (for LNCaP-EV, LNCaP-EE, C4-2B-EV og C4-2B -KD celler injisert mus) uker etter tumorinokulasjon. Slaktet tibiae ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin-løsning i 24 timer og decalcified i 0,5 mol /L EDTA i Ca
2 + – og Mg
2 + -fri Dulbeccos PBS i én uke før innstøping i parafin. Seks mikrometer langsgående seriesnitt ble skåret fra tibia og farget med H E, eller ved IHC for å analysere tumorvekst i benet. Histomorphometric analyser for tumorvolum (TV) og trabekulært ben volum (BV) ble utført ved hjelp av Metamorph programvare (Molecular Devices, Inc.) som beskrevet tidligere [37].
Microcomputed tomografi (μCT) analyse
for bestemmelse av den tredimensjonale arkitektur av benet etter tumor-inokulering, ble musene avlivet og den tibiae ble oppsamlet og fiksert over natten i 10% nøytral bufret formalin-oppløsning i 24 timer, etterfulgt av 70% etanol. Prøvene ble skannet med en μCT system (Scanco μCT 40; Bassersdorf, Sveits). Skanningen ble sammensatt av 129 skiver, med en terskelverdi på 263. En tredimensjonal rekonstruksjon av bildene ble gjort med den regionen av interesse bestående av trabekulære områder. Regioner av interesse ble trukket på hver av de 100 skiver, rett innenfor kortikalt ben, til å omfatte kun trabekulært bein og marg.
Immunohistochemistry
parafininnstøpte vevssnitt av skinneben var farget immunohistochemically med antistoffer mot AR (klone N20, Santa Cruz), Petroleumstilsynet (klone LK2H10, Santa Cruz) og Fox A1 (klon T20, Santa Cruz). Det primære antistoff ble inkubert ved passende konsentrasjon (AR: 1:1000; PSA: 1:500; Fox A1: 1:1000) i en time ved romtemperatur. Det sekundære antistoff ble inkubert i 60 minutter, ved anvendelse av enten pepperrot-peroksidase-konjugert geite-anti-kanin eller geit anti-mus (1:1000), respektivt. Lysbilder ble skylt grundig i vann fra springen, kontra med Mayers hematoksylin og montert
Statistiske og bildeanalyse
eventuelt eksperimentelle grupper ble sammenliknet med to-utvalg
t
. – test, med betydning definert som
P
. 0,05
Resultater
Aktivering av NF-kB signalering øker uttrykk for osteoclastogenesis assosierte gener i PCA celler
IκBα inhiberer NF-kB signalering ved binding til NF-kB og forebygge nukleære lokaliserings [38], [39]. Derfor, nedregulering av IκBα resulterer i kontinuerlig aktivering av NF-kB signalering [40], [41]. For å undersøke hvilken rolle NF-kB signale på prostata /PCa utvikling og progresjon, utførte vi RNA microarray for å direkte sammenligne prostata vev fra IκBα knock out (KO) mus [40], [41] (inkludert IκBα – /- og IκBα +/- mus) med normale mus prostata vev. Resultatene fra mikromatriseanalyse viste at ekspresjonen av mange osteoclastogenesis-assosierte gener, slik som RANKL, PTHrP, GM-CSF og uPA, økt over to ganger i både IκBα – /- og IκBα +/- prostatiske vev, sammenlignet med den av normal prostata (data ikke vist). For ytterligere å bekrefte hvorvidt NF-kB signalering er involvert i reguleringen av osteoclastogenesis assosierte gener i PCA-celler, aktivert vi NF-kB signalering i LNCaP-celler ved å infisere med IKK2-EE retrovirusvektor, hvor NF-kB aktivitet ble aktivert med en konstitutivt aktive mutanter av IKK2 [32], [33]. Aktivering av NF-kB signale ble bekreftet ved hjelp av NGL-reporter, en NF-kB reporter plasmid som har en NF-kB reagerende element koplet til en GFP /luciferase reporter [35] (fig. 1A). QRT-PCR-analyse viste at RANKL og PTHrP uttrykk er betydelig økt i NF-kB aktivert LNCaP celler, sammenlignet med tomme vektorkontrollceller (Fig. 1B og 1C). RANKL og PTHrP er kjent som viktige faktorer for osteoclastogenesis i beinet, og de spiller en nøkkelrolle i bein metastasering av mange kreftformer [15], [42] – [45]. Derfor resultatene fra vår QRT-PCR indikerer at NF-kB signalering er involvert i reguleringen av RANKL og PTHrP, de osteoclastogenesis assosierte gener i PCA celler.
NF-kB signale ble aktivert i LNCaP celler ved infiserer med IKK2-EE retroviral vektor (LNCaP-EE), mens LNCaP-celler infisert med den tomme vektoren ble benyttet som kontroller (LNCaP-EV). NF-kB aktivitet i LNCaP-EV og LNCaP-EE-celler ble målt ved anvendelse av en NF-kB responsive NGL-reporter (A). Ekspresjon av RANKL (B) og PTHrP (C) ble målt ved QRT-PCR. De opptegnede verdiene representerer gjennomsnitt av minst tre individuelle prøver ± SEM. Statistisk signifikans ble bestemt av to-utvalg
t
-test. **
P
. 0,01
PCA celler i stand til å vokse i benet mikromiljøet har høyere NF-kB aktivitet
Det er rapportert at C4 2B og PC3 PCA cellene vokse godt, men LNCaP-celler er vanskelig å vokse i murine ben følgende intratibial /intrafemural injeksjon [46]. Dette tyder på at celle-spesifikk genekspresjon hendelser bidra til en vellykket kolonisering av benet ved PCA-celler. For å bestemme hvorvidt NF-kB aktivitet reflekterer PCa celler vekst i ben, ble endogen NF-kB aktivitet i LNCaP, C4-2B og PC3-celler målt ved anvendelse av NGL-rapportør [35]. Interessant, NF-kB aktivitet på C4-2B og PC3-celler (som vokser godt i benet) er betydelig høyere enn den til LNCaP-celler (fig. 2A). I tillegg QRT-PCR indikere PTHrP (mRNA) ekspresjon er signifikant høyere i NF-kB aktivert LNCaP-EE, C4-2B og PC3-celler, sammenlignet med det i LNCaP-celler (fig. 2B). ELISA- og RIA-analyser viser at aktiveringen av NF-kB signale økt RANKL og PTHrP (protein) sekresjon i betydelig grad i LNCaP-EE-celler, sammenlignet med tom vektorkontrollceller (Fig. 2C, D og E). Imidlertid inaktivering av NF-kB signalering i PC3-celler (PC3-KD) ved å infisere dem med IKK2-KD retrovirusvektor hvori NF-kB aktivitet ble inhibert med en kinase død (KD) IKK2 mutant [32], [33] ( fig. 2C), resulterte i en betydelig reduksjon i RANKL og PTHrP-nivåer sammenlignet med tom vektorkontrollceller (PC3-EV) (fig. 2D og E). Western blot-analyse bekreftet videre at ekspresjon av RANKL og PTHrP ble øket i NF-kB aktivert PCA-celler (LNCaP-EE), mens, redusert i NF-kB inaktivert PCA-celler (PC3-KD), sammenlignet med tom vektorkontrollceller ( LNCaP-EV og PC3-EV) (fig. 2F). Disse resultatene indikerer at PCA-celler som er i stand til å vokse i benet mikromiljøet har høyere NF-kB aktivitet og aktivering av NF-kB signale oppregulerer osteoclastogenesis assosierte gener i PCA-celler, noe som kan øke deres evne til å feste seg og vokse i benet mikromiljøet.
(A) PCA celler som kan vokse i benet mikromiljøet utstillings økt NF-kB aktivitet. NF-kB aktivitet i LNCaP, C4-2B og PC3-celler ble målt ved anvendelse av en NF-kB som reagerer NGL reporter. (B) Ekspresjon av PTHrP er korrelert med aktiviteten av NF-kB signalering i PCA-celler. Uttrykk av PTHrP i LNCaP, NF-kB aktivert LNCaP-EE, C4-2B og PC3 cellene ble målt ved QRT-PCR. (C) generering av NF-kB inaktivert PCA-cellelinjer. NF-kB signale ble inaktivert i C4-2B og PC3-celler ved å infisere med IKK2-KD retroviral vektor (C4-2B-KD og PC3-KD), mens PCA-celler infisert med den tomme vektoren ble anvendt som kontroller (C4-2B og PC3-EV). NF-kB aktivitet ble målt ved anvendelse av en NF-kB som reagerer NGL reporter. (D og E) Ekspresjon av RANKL (D) og PTHrP (E) proteiner i NF-kB aktivert LNCaP-EE og NF-kB inaktiverte PC3-KD-celler ble målt ved hjelp av ELISA og RIA-analyser, respektivt. Cellene som er infisert med tom vektor (LNCaP-EV og PC3-EV) ble anvendt som kontroll. (F) Ekspresjon av RANKL og PTHrP er korrelert med aktiviteten av NF-kB signalering i PCA-celler. RANKL og PTHrP-ekspresjon ble undersøkt ved Western blot-analyse. De opptegnede verdiene representerer gjennomsnitt av minst tre individuelle prøver ± SEM. Statistisk signifikans ble bestemt av to-utvalg
t
-test. **
P
. 0,01
Aktivering av NF-kB signalering i PCA cellene bidrar til osteoclastogenesis
osteoklaster høyt spesialiserte multinucleated celler ansvarlig for bein resorpsjon, en fremgangsmåte kritisk for opprettholdelse av benbygning og kalsium homeostase. Imidlertid patologisk aktivering av osteoklaster resulterer i bentap assosiert med inflammatorisk artritt, periodontal sykdom, kreft og metastaser i ben. Osteoklaster er avledet fra monocytt /makrofag progenitorceller avstamning under påvirkning av cytokinet RANKL [47]. For å bestemme hvorvidt aktivering av NF-kB signalering i PCa celler påvirkninger osteoclastogenesis i benmarg, ble monocytt /makrofag avstamning progenitorer fra primærbenmargceller behandlet med kondisjonert medium fra NF-kB aktivert /inaktiv PCA-celler, og overvåket for osteoclast Differensiering. Våre resultater viser at kondisjonert medium fra NF-kB aktivert LNCaP-celler (LNCaP-EE) induserte TRAP-positive multinukleære celledannelse karakteristisk for osteoklaster, mens det kondisjonerte medium fra LNCaP-celler ikke klarte å gjøre dette (fig. 3A og tabell 1). C4-2B og PC3 cellekondisjonerte medier også indusert TRAP-positive multinukleerte celledannelse (Fig. 3A og tabell 1). For ytterligere å forstå hvordan NF-kB signalering i PCA-celler påvirker cellulære komponenter i benet microenviornment, ble osteoblaster fra primærkulturer av murine benmargceller behandlet med kondisjonert medium fra NF-kB aktivert /inaktiverte PCA-celler. Våre resultater viser at kondisjonert medium avledet fra NF-kB aktivert PCA-celler hadde ingen signifikant effekt på osteoblast proliferasjon (Fig. 3B). Disse resultater indikerer at aktivering av NF-kB signalering i PCA-celler bidrar til osteoclastogenesis, men ikke til osteoblast proliferasjon.
(A) kondisjonert medium fra NF-kB aktivert PCA-celler induserer osteoklast-liknende celledannelse
in vitro
. Benmargsmakrofager ble behandlet med kondisjonert medium fra LNCaP, NF-kB aktivert LNCaP-EE, C4-2B og PC3 celler. TRAP-farging ble utført etter 10 dager med ytterligere kultur med kondisjonert medium. Piler indikerer osteoklast-lignende celler. (B) Aktivering av NF-kB signalisering i PCA-celler ikke har noen signifikant virkning på osteoblaster proliferasjon. Primære dyrkede osteoblaster ble behandlet med kondisjonert medium fra NF-kB aktivert (LNCaP-EE, C4-2B-EV og PC3-EV) eller inaktivert (LNCaP-EV, C4-2B-KD og PC3-KD) PCA celler. Spredning analysen (MTT-analyse) ble utført på 48 timer etter behandling.
motvirke NF-kB signale hemmer PCa svulst etablering og vekst i beinet
For å bestemme hvis antagonisering av NF-kB signale inhiberer PCa tumor etablering og vekst i benet mikromiljøet, genererte vi NF-kB signaleinaktiv PCA-cellelinjer som stabilt ved å infisere med IKK2-KD vektorer (PC3-KD og C4-2B-KD) (fig. 2C ). Selv om NF-kB blokade ubetydelig endrede spredning priser (Fig. 4), alle de konstruerte cellene vokste godt (overleve)
in vitro
etter nedregulering av NF-kB aktivitet. NF-kB inaktivert PC3 og C4-2B celler (PC3-KD og C4-2B-KD) ble podet inn i beinet av mus ved intratibial injeksjon, og små dyr X-ray røntgenavbildning ble utført for å overvåke bein utvikling lesjon. Musene ble ofret for histologisk analyse på 3 uker (for PC3-EV og PC3-KD celler injisert mus) og 10 uker (for C4-2B-EV og C4-2B-KD celler injisert mus) etter vaksinasjon. Alle tumorer implantert med PC3-EV og C4-2B-EV-celler (PC3 og C4-2B celler infisert med tom vektor, ble benyttet som kontroller) vokste godt i ben; mens, NF-kB inaktiverte PC3-KD og C4-2B-KD cellevekst ble ikke detektert (0/4 i både gruppe) ved røntgenstråle-avbildning røntgenbilde eller histologisk analyse (Fig. 5A og 5B). Histomorphometric analyser viste at den gjennomsnittlige BV /TV er 5,3% for PC3-EV og 13,9% for C4-2B-EV svulster. Disse resultatene indikerer at inaktivering av NF-kB signale hemmer både osteolytic (PC3) og osteoblastisk /osteoklastaktiviteten blandet (C4-2B) PCa svulster etablering og vekst i benet miljø.
NF-kB aktiveres /inaktivert PCa celle linjer ble generert ved å infisere stabilt med IKK2-EE /IKK2-KD vektorer. IKK2-EV ble anvendt som kontroll vektor. Proliferasjonsrate ble bestemt ved MTT-analyse.
NF-kB inaktivert PC3-KD og C4-2B-KD celler ble podet inn i muse bein av intratibial injeksjon.
