Abstract
miRNA regulerer genuttrykk ved post-transcriptional nivå og finjustere de viktigste biologiske prosesser, inkludert kreft progresjon. Her viser vi involvering av MIR-200b i metastatisk spredning av prostatakreft. Vi identifiserte MIR-200B som en nedstrøms mål av androgen reseptor og knyttet sitt uttrykk til redusert tumorigenicity og metastatisk kapasiteten på prostatakreftceller. Overekspresjon av MIR-200b i PC-3 celler betydelig hemmet deres spredning og dannelse av subkutane svulster. Videre, i en orthotopic modell, MIR-200b blokkert spontane metastase og angiogenese ved PC-3 celler. Dette reduserte metastatisk potensial var sannsynligvis på grunn av reversering av epithelial-til-mesenchymale overgang, som ble dokumentert av økt pan-epitelial markør E-cadherin og spesifikke markører for prostata epitel, cytokeratins 8 og 18. I kontrast, mesenchymale markører, fibronektin og vimentin, ble signifikant nedregulert av MIR-200b. Våre resultater tyder på en viktig rolle for MIR-200b i prostatakreft progresjon og viser sitt potensial verktøy for prostatakreft behandling
Citation. Williams LV, Veliceasa D, Vinokour E, Volpert OV (2013) MIR-200b hemmer prostate Cancer EMT, vekst og metastasering. PLoS ONE 8 (12): e83991. doi: 10,1371 /journal.pone.0083991
Redaktør: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences sentrum, USA
mottatt: 23 september 2013; Akseptert: 11. november 2013, Publisert: 31.12.2013
Copyright: © 2013 Williams et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Herman L . Kretschmer Fund, via Northwestern University Urology Department (OV), den SPORE i Prostate Cancer Pilot Award P50 CA090386 (OV), Diversifisering Higher Education fakultet i Illinois Fellowship Grant (LVW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mikroRNA (miRNA) er korte, (21-22 nukleotider) ikke-kodende RNA som binder til mRNA og undertrykke genekspresjon av mRNA degradering /destabilisering eller ved nedsatt oversettelses [1]. MikroRNA først transkribert som 100 bp primære miRNA hårnål strukturer, som deretter spaltes ved drosha inn i pre-miRNA og eksporteres fra kjernen til cytoplasma for videre behandling [2], [3]. Spalting av pre-miRNA ved dicer proteiner erholdt 22 bp dobbelt-trådede molekyler, hvorav den ene tråden blir selektivt anbrakt på de argonaute proteiner, som letter miRNA binding til 3’UTR målsekvenser på mRNA. Mirna spille sentrale roller i flere utviklings og patologiske prosesser, blant annet kreft i bryst, hud, lunge og livmorhalsen [4] -. [9]
Den miRNA HSA-MIR-200B tilhører en familie som inkluderer MIR-200A, MIR-200c, MIR-141, og MIR-429. Feilregulering av mir-200b har blitt tillagt en avgjørende rolle i epiteliale til mesenchymale overgang (EMT) og metastasering i kreft som brystkreft, mage, og bukspyttkjertelen karsinom [10] – [12]. Menneskelig MIR-200B er med i en dobbel feedback loop med de to transkripsjons regulatorer av E-cadherin, ZEB1 og ZEB2 [13]. I normale epitelceller, er MIR-200b uttrykkes ved høye nivåer; ved å målrette 3’UTR regioner av pro-metastatisk transcriptional faktorer ZEB1 og ZEB2 det blokkerer uttrykk og stopper EMT [10]. I motsetning til i mesenkymale celler, hvor ZEB1 /ZEB2 uttrykk er unormalt høy, undertrykke de miRNA av MIR-200 familien ved å blokkere deres promoter aktivitet [13]. Flere studier vurdere MIR-200b funksjon i EMT, selv om det er noen forsøk på å ta sin rolle i primærtumorvekst.
Her viser vi at Mir-200B besitter en lignende aktivitet i prostatakreft. Søker å identifisere miRNA som bidrar til redusert aggressivitet og tumorigenesis i prostatakreft, utførte vi miRNA profilering av cellelinjer med induserbar uttrykk for androgen reseptor tidligere utviklet i vårt laboratorium. Vi fant ut at Mir-200B var signifikant oppregulert i dårlig tumorigene PC3 AR-positive celler og at overekspresjon av MIR-200B ført til redusert tumorvekst. Dette reduserte tumorigenesis var sannsynligvis på grunn av redusert spredning. På den annen side, MIR-200b sterkt oppregulert epitel cellemarkør E-cadherin i PCA-celler, mens mesenchymale markører Fibronectin og vimentin ble samtidig redusert. Etter avtale med analysene utført i andre tumortyper, ble ZEB1, en transkripsjonen regulator av E-cadherin også redusert på MIR-200b overekspresjon. I tillegg MIR-200b redusert invasiv potensialet i PCA cellene
in vitro Hotell og nedsatt metastasering. Våre resultater viser at Mir-200b reduserer tumorvekst og reverserer EMT i prostatakreft.
Metoder
Animal Welfare Assurances
Alle studier med forsøksdyr (mus) ble godkjent av Northwestern University Animal Care og bruk komité og utført i samsvar med de retningslinjer som er vedtatt og foreslått av National Institutes of Health (Animal forsikring antall A3283-01, utløpsdato 5/31/2014).
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og behandling Forhold
PC3 celler transfektert med induserbar villtype androgen reseptor (AR) eller kontroll plasmid ble etablert tidligere [14]. Celler ble opprettholdt i RPMI-medium supplert med 10% Tetracyclin-fri føtalt bovint serum (FBS), 2% penicillin /streptomycin, 50 ug /ml Zeocin og 1 ug /ml Blasticidin. For AR ekspresjon, ble PC3-AR-celler ble behandlet i 5 dager, med 1 ug /ml doksycyklin og 1 nM av methyltrienolone (R1881) i fenol rød frie RPMI-medium supplert med 10% trekull-strippet FBS, 2% penicillin /streptomycin, 50 ug /ml Zeocin og 1 ug /ml Blasticidin. Foreldre PC3-celler ble holdt i RPMI med 10% FBS og 2% penicillin /streptomycin. Alle celler ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2, i en fuktet inkubator.
Immunoblotting
Celler ble sådd ut ved en tetthet på 100.000 celler pr 10 cm plate. Cellene ble samlet opp ved skraping i fosfatbufret saltvann (PBS) og sentrifugert ved 2500 RPM i 10 minutter ved 4 ° C. Cellepelleten ble lysert i Ripa buffer (Sigma, St. Louis, MO) supplert med protease 1X /fosfatase-inhibitor oppløsning (Thermo Scientific, Waltham, MA) og sentrifugert ved 12000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C. Konsentrasjonen av supernatanten ble bestemt i triplikat ved proteinanalyse (DC Protein Assay, Biorad, Hercules, CA). Lysatene ble elektroforese på 4% -20% Tris HCL polyakrylamidgeler (Biorad, Hercules, CA). Protein lysat ble overført over natten på PVDF membraner (GE Healthcare og biovitenskap, Pittsburg, Pennsylvania). Hver membran ble skyllet i 1X Tris-bufret saltvann med 0,1% Tween 20 (TBS-T), blokkert med 5% ikke-fettmelk i TBS-T og probet med antistoffer som er angitt i Tabell S3.
RNA Utvinning
For miRNA deteksjon, ble totalt RNA isolert med miRNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). For mRNA utvinning, svulster var snap-frosset i flytende nitrogen og overført til RNA stabilisering løsning (Ambion, Life Technologies, Grand Island, New York). Tumorene ble opprettholdt ved -80 ° C og RNA-ekstraksjon ble utført ved anvendelse av miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA konsentrasjon og renhet ble målt med NanoVue Plus spektrofotometer (GE Healthcare og biovitenskap, Pittsburg, Pennsylvania).
Real Time RT-PCR
RNA ble revers transkribert med miScript II RT Kit (Qiagen , Valencia, CA) etter produsentens anvisninger. Den resulterende cDNA ble brukt for real-time PCR-analyse ved hjelp miScript SYBR Grønn PCR kit (Qiagen, Valencia, CA). For individuelle miRNA kvantifisering vi brukte miScript Primer Analyser (Qiagen, Valencia, CA). For polymerase chain reaction (PCR) analyse, ble forover og bakover primere designet og kjøpt fra Integrerte DNA Technologies (Coral, IA) og reaksjoner utføres med SYBR Grønn super mix (Quanta biovitenskap, Gaithersburg, MD). Reaksjonene ble utført i en termisk iCycler (Biorad, Hercules, CA). Hver prøve ble testet i tre eksemplarer.
miRNA rekke analyse
PC3-AR-celler ble behandlet med doxycycline (Dox) og R1881 (som beskrevet ovenfor) for ekspresjon og aktivering av androgen reseptor (AR) hhv. RNA ble ekstrahert som beskrevet ovenfor, og 5 pg av hver prøve ble sendt til LC Sciences (Houston, Texas) for rekke analyse. Prøvene ble merket med Cy
3 eller Cy
5 og intensitetsforholdet av hver ble brukt for å bestemme endringer i miRNA ekspresjonsnivå. En 20-nukleotid RNA-kontroll-sekvens er komplementær til flere kontroll sonder flekket på hver brikke ble inkludert i hver prøve som en intern kontroll. De mikromatriser ble utført i triplikat for human, mus og rotte-sekvenser. Den potensielt mål spekteret for utvalgte miRNA ble definert ved hjelp Sanger miRBase 11,0. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av t-test for p 0,10, p 0,05 og p. 0,01
MIR-200b Overuttrykte
Transport vektor koding forløper sekvens HSA-MIR-200b (pMIRNA1 pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) og kontroll vektor (pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) fra System biovitenskap (SBI, Mountain View, CA) ble dyrket i Luria buljong 50 mikrogram /ml ampicillin over natten ved 30 ° C på en orbital-rystemaskin. Endotoksin-fritt plasmid DNA ble isolert ved anvendelse av endo-Free Maxi Prep-sett (Qiagen, Valencia, CA). Lentiviral partiklene ble produsert for hvert plasmid i HEK293T celler ved hjelp av pMD2.G konvolutten og psPAX2 2
nd generasjons emballasje plasmider (Addgene, Cambridge, MA). Titeren ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri av infiserte celler som beskrevet tidligere [15]. For transfeksjon, ble PC3-celler sådd ut i 6-brønns plater ved 10
5-celler /brønn. Dagen etter, media ble erstattet med 1 ml 1X DMEM inneholder riktig MOI av lentiviral partikler for MIR-200B og tom vektor kontroll. Etter 6 timers inkubasjon ble cellene matet med RPMI med 10% FBS og 2% penicillin /streptomycin og inkubert i ytterligere 48 timer. Transduserte celler som uttrykker høye nivåer av RFP markør ble isolert og flowcytometri kombinert med cellesortering og holdt i RPMI med 10% FBS, penicillin /streptomycin og 1 ug /ml puromycin for ytterligere valg.
tumorigenesis Assays
(1) Subkutan vaksinasjonen.
Foreldre PC3 cellene ble PC3 celler transduced med kontroll lentivirus og MIR-200b celler dyrket som beskrevet ovenfor, høstet og resuspendert i 2 × 10
7 celler /ml i serumfritt RPMI. Ett hundre ul av cellesuspensjonen (2 x 10
6 celler /mus) ble injisert subkutant inn i de bakre bakparten av atymiske mus av hannkjønn (Nu /Nu, n = 5). Svulstene ble målt med microcalipers tre ganger i uken og forsøket ble avsluttet ved 29 dager etter implantasjon. Tumorene ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C for etterfølgende analyse.
(2) ortotopisk implantasjon av tumorceller ble utført som beskrevet tidligere [16].
I korthet , midtlinje snitt ble gjort, overlegen til kjønnsorganene av liggende bedøvet mannlig atymiske mus (nu /nu). Blæren ble ekstern og utvidet med en bomullspinne for å avsløre sædblærene og dorsum av prostata. Tumorceller i 50 pl serumfritt RPMI (10
6 per dyr) ble injisert inn i prostata og muskelen og huden ble lukket med suturer og metallklips, respektivt. Alle prosedyrer ble utført i sterilt miljø. Metallklips ble fjernet 2 uker etter injeksjonen. Tumorveksten ble overvåket ved GFP fluorescens, ved hjelp av små dyr avbildningssystem OV100 (Olympus). Forsøket ble avsluttet 20 dager etter implantasjon. Svulstene ble skåret ut og snap-frosset for senere analyse. For å vurdere metastasering, ble den gjenværende fluorescens målt etter fjerning av den primære tumoren.
Proliferation Assay
Cellene ble sådd ut i triplikat i 96-brønners plater ved 3 x 10
3 celler /godt. Etter 24, 48 og 72 timer, 10 ul WST-1 reagens (Roche, Indianapolis, IN) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 2 timer. Absorbansen ble målt for hvert tidspunkt ved 450 nm bølgelengde med Biorad mikroplateleser (Biorad, Hercules, CA).
In Vitro
invasjon analysen
Transwell inserts (Corning, Tewksbury, MA) ble belagt med 100 ul av 1 mg /ml fenolrødt fri Growth Factor Redusert Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) og tillatt å stivne ved 37 ° C i en vevskultur-inkubator i 24 timer . Cellene ble resuspendert ved en tetthet på 10
6 celler /200 ul i serumfritt RPMI, seeded i duplikater i den øverste delen av de belagte innsatser og inkubert ved 37 ° C i 24 timer, med 700 ul 10% FBS tilsatt til det nedre kammer som et kjemotiltrekkende. Cellene ble fiksert og farget hjelp DiffQuick Fiksering løsninger (Dade Behring, Malvern, PA) og 6 felt ble fotografert for hver eksperimentell tilstand. Invasjonen ble beregnet som prosent invaderte celler. Eksperimentet ble utført to ganger.
Cell Cycle Analysis
Cellene ble sådd ut på 10
6 celler /ml i RPMI supplert med 0,2% FBS. Etter 48 timer ble cellene trypsinert, vasket to ganger i kald PBS, fiksert i 10 ml 75% iskald etanol og holdt over natten ved -20 ° C. Cellene ble vasket to ganger i 1 x PBS ved 4 ° C, resuspendert i 2,0 ml DAPI fargeløsning (0,1% TritonX 100 i 10 ml PBS, 100 ul av 1 mg /ml DAPI) og analysert ved FACS.
statistisk analyse
Alle kvantitative data ble samlet inn fra minst to uavhengige forsøk sammenslåtte sammen, med hver enkelt datapunkt utført i triplikater. Standardavvik (SD) ble beregnet ved hjelp av Microsoft Excel-programvare. For å bestemme statistisk signifikans av de observerte difffrences, har vi utført parvis sammenligning av datasett, ved hjelp av ensidige t-test. Statistisk signifikans ble satt til P-verdi som ikke overstiger 0,05.
Resultater
MIR-200b er oppregulert ved AR
Tidligere data fra vår gruppe viste at androgen reseptor (AR) hemmer tumorigene egenskaper av AR-negative prostatakreft-cellelinje, PC-3 [14]. MikroRNA er viktige modifiseringsmidler av biologiske funksjoner, inkludert tumorvekst. Vi søkte miRNA som er kontrollert av AR og involvert i negativ regulering av prostatakreft progresjon. For dette formål, utførte vi miRNA profilering av tidligere genererte cellelinje med tetracyklin-induserbar ekspresjon AR ([14], fig. 1a). Cellene ble behandlet med Doxycycline (Dox) for å sikre AR uttrykk og med R1881, for å indusere AR kjernefysisk translokasjon og transkripsjonen aktivitet.
(A) Western blot for å bekrefte induserbar AR uttrykk i PC3-AR celler. PC3-AR-celler ble behandlet 5 dager med doksycyklin å indusere AR uttrykk og med R1881 å indusere AR aktivering og kjernefysisk translokasjon. Sammenligningen er å ubehandlet kontroll. Totale cellelysater ble anvendt for analyse. (B). Heat kartet miRNA uttrykk i PC3-AR og kontrollceller. Total RNA fra celler i A ble benyttet for analyse microarray, og hver prøve analyseres i triplikat. Statistisk signifikans for uttrykk endringer vist er fastsatt ved bruk t-test. P-verdier 0,05 ble tilskrevet statistisk signifikans
Microarray analyse viste statistisk signifikant differensial uttrykk av 837 individuelle miRNA som svar på AR aktivering. (P 0,05 som bestemmes av Studentenes T-test), av hvorav 116 var viste P-verdier under 0,01 (Figur 1b, Bord S1 og S2). Vi valgte miRNA som ble endret mer enn to ganger og analysert deres potensielle mål og funksjoner ved hjelp Sanger miRBase versjon 11.0 og Diana Micro T-versjon 3.0. Åtte miRNA ble valgt basert på deres potensial engasjement i kreft progresjon som ble bestemt av
i silico
analyse og publiserte studier. Fem av den valgte miRNA oppregulert i de mindre tumorigene PC3-AR-celler ble også assosiert med redusert tumordannelse i andre kreftformer (tabell 1). MikroRNA fra MIR-200 klynge (MIR-200A, MIR-200b) er blitt vist å virke som tumor-suppressorer i gastrisk, cervical, lunge, bryst og prostata-kreft [9], [10], [17], [18] . Økt MIR-200C nivåer har vært knyttet til redusert metastaser i melanom, plateepitelkarsinom og prostatakreft [6], [18], [19]. MIR-30a og MIR 30-d uttrykk er betydelig redusert i kronisk myelogen leukemi, ikke-småcellet lungekreft, nyrecellekarsinom, og prostata kreft [20] – [23]. I motsetning til dette ble MIR-7 og MIR-9 nivåer avtok i mindre tumorigen cellelinje. I samsvar har MIR-7 har blitt identifisert som et onkogen av nyrecellekreft [24] og MIR-9 tillagt en rolle i leukemogenesis [25] – [27]. Lave MIR-196a nivåer ble observert i malignt melanom [28] (tabell 2).
Vi har validert velger mikroRNA identifisert av rekke analyse ved hjelp av real-time PCR. Faktisk, MIR-200b, 30a og 30d ble økt, og MIR-9 redusert, og disse endringene var statistisk signifikant (p≤0.05) (figur 2a). Vi valgte MIR-200b for videre analyse siden det viste høyeste ganger endring og på grunn av sin kjente rolle i EMT og metastasering [10], [13].
(A). MiRNA uttrykket ble normalisert til at kontrollceller (Ctrl). PC3-AR og kontrollceller ble behandlet 5 dager med doksycyklin å indusere ekspresjon AR og med R1881 for å fremkalle AR-aktivering og nukleær translokasjon og total RNA innsamlet for analyse. Sammenligningen er å ubehandlet kontroll og RNU1A_1 ikke-kodende RNA blir brukt som en intern kontroll. Den statistiske betydningen av observerte forskjellene i forhold til kontroll er * p≤0.05, og ** p≤0.01 som ble bestemt av ensidige t-test. Gjennomsnittsverdiene beregnes for to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. (B) AR aktivering oppregulerer MIR-200b. PC3-AR celler (grå søyler) ble behandlet 5 dager med både doksycyklin å indusere AR uttrykk og med R1881 å indusere AR aktivering og kjernefysisk translokasjon. Sammenligningen er å ubehandlet kontroll. Flutamide ble lagt der det er angitt å blokkere AR aktivitet. Control (ctrl) PC3-AR celler ble ubehandlet. RNU1A_1 ikke-kodende RNA ble anvendt som en intern kontroll. *, P 0,05; **, P 0,01 som bestemmes av studenter T-test. De gjennomsnittlige verdier ble beregnet for to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer.
Vi målte MIR-200b nivåer i PC3-AR-celler behandlet med kombinasjonen av doxycycline, en syntetisk androgen R1881 og den anti-androgen flutamid , en kompetitiv hemmer av AR funksjon. MiR-200b ble betydelig økt respons på R1881 og denne økningen ble avskaffet ved flutamide på en doseavhengig måte, noe som tyder på en direkte transkripsjonsregulering av AR (figur 2b).
MIR-200b Undertrykker Vekst av prostatakreft xenografter
neste søkt effekten av MIR-200b uttrykk på prostatakreft tumorigenesis. Vi overexpressed MIR-200b i PC3 celler ved transduksjon med høy titer lentivirus, bruker tom vektor (pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) som en negativ kontroll, og bekreftet MIR-200b uttrykk ved real-time RT-PCR (figur 3a). De resulterende cellelinjer og paren PC3-celler ble subkutant injisert i hann atymiske nakne mus. Viktigere, svulster som dannes av celler som uttrykker Mir-200b var betydelig mindre da svulstene dannet av foreldre PC3 og cellene transduced med kontroll vektor (figur 3b). Viktigere var MIR-200B ekspresjon opprettholdes i løpet av forsøket, som ble verifisert ved sanntids RT-PCR (figur 3c). Ettersom tumor interaksjoner med dens mikro spille en avgjørende rolle i tumorprogresjon, utførte vi ortotopisk implantasjon av PC3-200b og kontrollere cellelinjer som tidligere beskrevet [16] inn i dorsal prostata av hann atymiske mus. Vi tok fordel av RFP markør innlemmet i bicistronisk lentiviral vektor for å utføre lengde
in vivo
imaging. Den samlede fluorescens pre-disseksjon var signifikant lavere i mus som bærer PC3 MIR-200b positive tumorer sammenlignet med vektoren kontrollgruppen (figur 3d, e). Således MIR-200b ekspresjon var tilstrekkelig til å redusere tumorvekst. Videre avbildning av magen etter fjerning av svulster viste betydelig mindre fluorescens på grunn av sekundære lesjoner, noe som tyder på at MIR-200B ble redusert både den primære vekst og metastasering av PC-3-PCA-celler (se nedenfor).
A) Tvungen uttrykk for MIR-200b i PC3 celler. PC3 cellene ble trasduced med en bicistronisk lentiviral shuttle vektor (pMIRNA1 pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) koding HSA-MIR-200B og tom vektor kontroll (ctrl). Total RNA ble isolert og speil 200b uttrykk målt ved hjelp av real-time RT-PCR. Verdiene representerer tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *, P≤0.01. (B) MIR-200b redusert tumorigenesis av PC-3 celler. Foreldre PC3 celler, PC3 celler trasduced med Mir kontroll (ctrl) og Mir-200b ble subkutant injisert i de bakre bakparten av atymiske hannmus (n = 5). Tumor vekt på dag 29 etter injeksjonen er vist. *, P≤0.05; **, P≤0.01. (C) Svulstene opprettholdt MIR-200b uttrykk. Relativ MIR-200b uttrykk ble målt ved real-time RT-PCR i svulster fra panelet (B). * P≤0.05. (D). MIR 200b redusert tumorvekst i en orthotopic modell av prostatakreft. RFP-merket PC3-ctrl og PC3-200b celler ble implaned i prostata av atymiske hannmus. Den gjennomsnittlige fluorescens ble målt 20 dager etter injeksjonen. (E) Fluorescens per dyr ble bestemt ved hjelp av hele kroppen bildebehandling, med Olympus OV100 system. *, P≤0.05. (F) Celleveksten ble målt ved hjelp av WST-1-assay. PC3-ctrl eller PC3 MIR-200b-celler ble sådd på 3000 celler per brønn i en 96-brønns plate. Absorbansen ble målt ved angitte tidspunkter ved hjelp av en Biorad Modell 680 mikroplateleser. Resultatene representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *, P≤0.05 av t-test. (G, H) Tumor snitt ble farget for Ki-67, for å evaluere proliferasjon. Legg merke til en betydelig reduksjon i Ki-67-positive kjerner i nærvær av MIR-200b. *, P. 0,001
MIR-200b undertrykker spredning av PCA Cells
Søker faktorer som bidrar til redusert tumorvekst, utførte vi cellesyklus analyse av PC3 kontroll og PC3 speil 200b celler og observert en mild økning i G2 /M fase om MIR-200b positive celler som tyder på cellesyklus arrest (figur S1). Faktisk WST-1-assay for levedyktige celler viste en svak, men signifikant reduksjon i celleantallet i den MIR-200b positive celler sammenlignet med vektor-kontroll (figur 3 g, h). Kombinert med betydelig reduksjon i Ki-67 positive kjerner i PC-3 svulster på MIR-200b uttrykk (figur 3f), tyder våre resultater at den observerte redusert i tumorvekst ble forårsaket av redusert spredning.
speil 200b reverserer Epithelial å Mesencymal Overgang i PCA Cells
i tidligere studier, MIR-200b uttrykk i bryst, mage, og nyrecellekarsinom korrelerer med mer differensiert tilstand, og re-introduksjon av MIR-200b reverserer EMT [ ,,,0],10], [11], [29]. Disse endringene kan til slutt bidra til både redusert tumorvekst og metastasering. Derfor, analyserte vi nivåene av kjente EMT og differensieringsmarkører uttrykt av PC-3-celler i nærvær eller fravær av MIR-200b. Først viste Western blot analyse en betydelig økning i de typiske differensieringsmarkører prostata epitel Cytokeratin CK8 og CK18 av MIR-200B, noe som tyder på en mer differensiert tilstand av MIR-200b positive celler (figur 4).
(A ). CK 8 og CK 18 ble analysert ved western blot av totale proteinlysatene fra PC3-ctrl og PC3 MIR-200b celler. (B) Kvantitativ analyse av eksperimentet (A) med bilde J programvare. Grafen viser data gjennomsnittet av to uavhengige eksperimenter. *, P≤0.05 og **, p. 0,01 ved t-test
I avtalen, nivåene av E-cadherin ble også økt (figur 5a), noe som tyder på en dreining mot epitelial fenotype . Videre vimentin, en mesenchymale markør, gjennomgikk en statistisk signifikant reduksjon på MIR-200b uttrykk. En annen mesenchymale markør, fibronektin (FN) viste en lignende trend selv om nedgangen ikke statistisk signifikant (figur 5b). Fordi i tidligere studier MIR-200b styrt E-cadherin og EMT ved undertrykkelse av transkripsjonsfaktoren ZEB1 har vi vurdert både totalt ZEB1 protein og RNA-nivåer i MIR-200B-positive og kontroll PC-3 celler. Vi har observert en signifikant og reproduserbar reduksjon i ZEB1 protein og mRNA som respons på MIR-200b (figur 5c, d). Dette resultatet er i overensstemmelse med den økte E-cadherin uttrykket (figur 5a). Våre resultater viser tydelig at Mir-200B uttrykk fremmer epiteliale celleegenskaper og undertrykker mesenchymale funksjoner i PC3 cellene.
(A) Markers berørt av MIR-200b i PC-3 celler. E-cadherin, Fibronectin, og vimentin ble påvist i helcellelysater fra PC3 ctrl og PC3 MIR-200b celler ved western blot. (B) Kvantitativ analyse av forsøket er vist i (A) utføres med bilde J programvare. *, P 0,05 og, **, p≤0.01 som bestemt ved t-test. To uavhengige eksperimenter ble slått sammen. (C) Western blot for ZEB1 og kvantifisering utført som ovenfor (gjennomsnittet av to eksperimenter er vist). (D) End-point PCR for ZEB1. (E)
In vitro
transwell invasjon analysen: sammenligning av PC3-ctrl og PC3 MIR-200b celler. 10% FBS ble anvendt som kjemotiltrekkende og forsøket ble utført i duplikat. *, P 0,05 ved t-test. (F)
in vivo
spontane metastaser av PC3-ctrl og PC3 MIR-200b celler. Cellene ble implantert orthotopically i den ventrale prostata av hann nakne mus. Musene ble utsatt for hele kroppen avbildning for RFP-positive masser ved hjelp Surface bilde. Ved slutten av forsøket ble dyrene avlivet, bukhulen åpnet og metastase visualisert ved fluorescens avbildning etter fjerning av en primærtumor inn i bukhulen og på den fremre veggen av magen (bukhulen). Bright feltet (BF) og fluorescens (RFP, rød fluorescerende protein) er vist. (G) Kvantifisering av forsøket er vist i (F). De metastaser ble talt og total fluorescens per metastase beregnet (til venstre). Brutto metastatisk byrde ble beregnet som total fluorescens per mus. Ctrl indikerer kontroll og 200b indikerer MIR-200b. **, P≤0.01 av t-test.
MIR-200B Reduksjoner Invasjon og metastasering av PC-3 celler
Fordi MIR-200b forårsaket EMT reversering ved PCA PC- 3 celler, var det rimelig å forvente en redusert invasiv potensial også. Ved hjelp av en standard prosedyre for å måle celle invasjon, ble det observert en signifikant reduksjon i prosentandelen av invaderte celler på grunn av MIR-200b ekspresjon sammenlignet med kontroll (figur 5e). Dette reduserte invasjon ligger til grunn sannsynlig redusert regional metastase av PC3 MIR-200b celler
in vivo
.
ortotopiske injeksjon av foreldre PC-3 og vektorkontrollceller inn i rygg prostata av atymiske hannmus resulterte i spontan metastaser, som ble detektert etter fjerning av de primære tumorer (fig. 5f og fig S2). Den totale fluorescens på grunn av metastaser ble dramatisk redusert hos mus implantert med PC-3 celler som overuttrykker MIR-200b (Figur 5f, g og figur S2). Dermed våre data tyder på at Mir-200B reduseres betydelig mesenchymale funksjoner i prostatakreftceller og dermed reduserer sine invasive egenskaper og metastatisk potensial.
MIR-200b Reduserer Tumor Angiogenese
En annen funksjon som kan gjøre det mulig metastase er angiogenese og EMT er ofte ledsaget av økt angiogenese. Ekspresjonen av MIR-200B viste seg å reversere angiogenic switch i PC-3-celler som ble vist ved redusert mikrovaskulær tetthet i MIR-200b positive tumorer sammenlignet med foreldre PC-3 eller vektor kontrolltumorer (fig. 6).
Avsnitt fra de tumorer som er dannet av kontroll og MIR-200b positive PC-3-tumorer ble farget for endotel-markør CD31 og antallet microvessels per felt bestemt i ti 10 x felt. *, P . 0,01
Diskusjoner
Den MIR-200-familien er en tumor-undertrykkende familie av mikroRNA som spiller avgjørende roller i undertrykkelse av EMT. Mens rollen til mir-200 familie i bryst og enkelte andre epiteliale kreftformer er vel etablert, er det få resultater som forbinder MIR-200 med prostatakreft. En liten skala studie (20 pasienter) antyder en sammenheng mellom biokjemisk tilbakefall etter radikal prostatektomi og lavere nivåer av MIR-200c [30]. En studie av He
et al.
Viser at lave nivåer av MIR-200B-3p i androgen-uavhengige celler er forårsaket av redusert ekspresjon av p-53-relatert protein p73 og bidra til økt proliferasjon [31] . De to klynger som koder MIR-200 familien finnes på kromosomene 1 og 12, med MIR-200b, MIR-200A, og MIR-429 på kromosom 1 og MIR-200c og MIR-141 på kromosom 12. mikroRNA 200c er antatt å være epitelial-spesifikke og dens ekspresjon er undertrykt ved hypermethylation av den proksimale CpG øya i fibroblaster og i brystkreftcellelinjer [32]. I PC-3, men ikke i LNCaP og DU145 PCA-celler, ligner hypermethylation av CpG øya faller sammen med den lave nivåer av MIR-200c og MIR-141 [32]. I samsvar med våre resultater, i denne studien PC3 celler negative for MIR-200c og MIR-141, viser en klar mesenchymale fenotype og evne til invasjon og metastasering [32]. To studier indikerer rollen for MIR-200 i tumorigenesis av PCA stamceller. I stem-lignende PCA-celler ekspresjon av Sox2, Nanog, Oct4, Lin28B og /eller Notch1 er forenlig med forbedret klonogene overlevelses og evnen til å danne sfæroider (prostaspheres). Disse stilk-lignende funksjoner er koblet til redusert uttrykk av MIR-200B /c og /eller la-7 familie der re-uttrykk for MIR-200 hemmer prostasphere dannelse og reduserer Notch1 og Lin28B, driverne av selvfornyelse [33] . I en urelatert studien, invasive tumorigen kloner avledet fra benign prostatahyperplasi (BPH) -1 cellelinje kronisk eksponert for TGF-beta skjerm fremtredende EMT funksjoner med høye nivåer av SNAI2, ZEB1, og ZEB2, alle bekreftet Mir-200 mål; Men basal MIR-200 nivåer i disse cellene forblir uendret foreslå en avvikende mekanisme [34].
augmented stilk-lignende funksjoner foreslår forbedret tumorigenicity. Faktisk har flere grupper vist at Mir-200B endrer veksten av eksperimentelle tumorer av de dyrkede PCA celler [35]. Våre data klart underbygge disse observasjonene.
