Abstract
I en to-trinns strategi, en intraperitoneal (IP) injeksjon av poly (etylenglykol) –
blokkere
-poly (ε-kaprolakton) (PEG-
b
-PCL) miceller inneholdende paclitaxel (PTX), cyclopamine (CYP), og gossypol (GSP) ved 30, 30 og 30 mg /kg, henholdsvis, debulked tumorvev med 1,3 ganger, basert på tap av biolumine med 10% av kroppsvektendring, og induserte apoptose i peritoneale tumorer når det anvendes som neoadjuvant kjemoterapi (NACT) i en ES-2-luc bærende xenograft modell for ovarian cancer. I et andre trinn, en enkel intravenøs (IV) injeksjon av apoptose målretting GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-
b
-PCL miceller som inneholder en nær-infrarødt (NIR) fluorescens sonde, DIR (1,1′-dioctadecyltetramethyl indotricarbocyanine iodide), resulterte i økt peritoneal dir akkumulering i apoptose-indusert ES-2-Luc tumorvev (
ex vivo
) med 1,5 ganger sammenlignet med dIR molekyler levert av metoksy PEG-
b
-PCL miceller (ikke-målrettede) etter 48 timer etter IV injeksjon, i et andre trinn. Som et resultat av en tandem av PEG-
b
-PCL miceller aktivert høyoppløselig påvisning av
ca
. 1 mm diameter tumor, noe som resulterer i fjerning av ca. 90% av svulster, og en lav peritoneal kreft indeks (PCI) fra
ca
. 7. Dermed vil en tandem av PEG-
b
-PCL miceller som brukes for NCAT og NIR fluorescens avbildning av terapi-indusert apoptose for intraoperativ kirurgisk veiledning kan være en lovende behandlingsstrategi for metastatisk kreft i eggstokkene.
Citation: Cho H, Cho CS, stede GL, Lavasanifar A, Vakili MR, Kwon GS (2014) Polymer Miceller for apoptose-Målrettet Optisk Imaging of Cancer og Intraoperativ kirurgisk veiledning. PLoS ONE 9 (2): e89968. doi: 10,1371 /journal.pone.0089968
Redaktør: Sung Wan Kim, University of Utah, USA
mottatt: 07.11.2013; Godkjent: 23 januar 2014; Publisert: 26 februar 2014
Copyright: © 2014 Cho et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health (R21 CA-161537) og Carbone Cancer Center ved University of Wisconsin-Madison. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er portrettert som den sykdommen som hvisker grunn av lat symptomer i tidlige stadier [1]. Dessverre er det ingen effektiv screening-tester: den generelle screening av serum kreftantigen 125 (CA 125) eller transvaginal sonografi ikke tillater tidlig påvisning av kreft i eggstokkene. Delvis på grunn av vanskelighetene med diagnose, er ovarian cancer den mest dødelige gynekologisk kreft [2]. Den konvensjonelle behandlingsstrategi for eggstokkreft innebærer en kombinert tilnærming utnytte aggressive cytoreduserende kirurgi og intravenøs (IV) kjemoterapi (platina og taxan analoger) [3].
I det siste tiåret, en potensiell nytte av kjemoterapi gitt gjennom intraperitoneal (IP) rute for eggstokkreft har blitt sett i flere kliniske studier, og det har blitt fremhevet at IP kjemoterapi kan gi høye svarprosenter innenfor magen på grunn av peritoneal plasma barriere avgrensa eksponering av kjemoterapi til peritoneal flatene, noe som resulterer i høyere narkotika konsentrasjon i bukhulen [3].
kirurgi er kritisk for pasienter med kolorektal og eggstokk-kreft som har spredt vidt til bukhulen. Det er tre typer av kirurgiske debulking som er blitt forsøkt for å behandle kreftpasienter ovarian: (1) primær debulking kirurgi (initial kirurgi) som i stor grad har vært standardmetoden; (2) intervall debulking kirurgi etter neoadjuvant kjemoterapi (NACT), reservert for pasienter som er medisinsk uskikket for umiddelbar operasjon eller hvis omfattende metastaser kan ikke i utgangspunktet resected; og (3) sekundær debulking kirurgi (ytterligere kirurgi), for pasienter som utvikler tilbakevend kjemoresistent eggstokkreft [1]. Selv om den optimale kirurgiske tilnærming fortsatt kontroversielt, er det helt klart at bedre intra kreft bildesystemer vil gi betydelig fordel for vellykket kirurgisk debulking av eggstokkreft. Selv om radiologiske tilnærminger som computertomografi (CT) og magnetisk resonans imaging (MRI) har vært til stor hjelp i å karakterisere kreftformer innenfor bukhulen, er de ikke nyttig for intraoperativ vurdering. I kontrast, har fluorescens bildebehandling vist seg å være vellykket i prekliniske og kliniske studier som en optisk teknikk som tilbyr sanntidsbilder av kirurgiske mål (peritoneal karsinomatose og brystkreft) med tilstrekkelig bildeoppløsning og høy intraoperativ sensitivitet [4] – [8] . Coll og medarbeidere rapporterte at intraoperativ nær-infrarødt (NIR) fluorescens bildestyrt kirurgi ved anvendelse av en tumor-targeting peptid, flåte-c (RGDfK)
4-Alex Fluor 700 (IV rute), i en TSA-pGL3 bærende musemodell for peritoneal adenocarcinoma kunne forbedre kvaliteten av den kirurgiske debulking ved å doble antallet detekterte tumorknuter og forkorte driftstiden [5]. Ntziachristos og kolleger vellykket gjennomført den første menneskelige prøveversjon av intraoperativ tumor-spesifikke fluorescens bildebehandling i regi og debulking kirurgi for kreft i eggstokkene ved hjelp IV folat-FITC, og beviste at antall svulster oppdages av kirurger under veiledning av tumorspesifikke fluorescens bilder økt med 5,3 ganger (34
vs.
7) sammenlignet med hvitt lys visuell observasjon alene [7]. Frangioni og medarbeidere demonstrerte også nytten av fakkel (fluorescens-pasning Reseksjon og Exploration) enhet for bildestyrt onkologisk kirurgi i første menneskelige klinisk studie av brystkreft sentinel lymfeknute (SLN) kartlegging følgende intratumoral /subkutan injeksjon av 1 :1 blanding av indocyanine grønn og humant serumalbumin (ICG: HAS) [6]. I denne studien SLNs identifisert av lymphoscintigraphy og NIR fluorescens bildebehandling var identiske i fire av seks brystkreftpasienter
Bruk av nanomaterialer som optisk fluorescens bildebehandling agenter bruker kvanteprikker, gull nanopartikler, og fluorescens sonde holdig eller. – konjugerte nanopartikler har trukket oppmerksomheten til diagnostiske formål i pre-kliniske studier [9] – [13]. Polymer miceller tilhører en større klasse av nanomaterialer som har kommet inn flere kliniske studier for levering av legemidler,
f.eks
. SP-1049C (doxorubicin, fase II), Genexol-PM (paclitaxel, fase II), og NC-6004 (cisplatin, fase I) [14]. Polymer miceller tilbyr flere fordeler, ikke bare som legemiddelbærere, men også som optiske avbildningsmidler i onkologi: små størrelser-partikler med snever størrelsesfordeling, strukturell stabilitet, høy vannløselighet, lav giftige bivirkning over konvensjonelle tensider (
f.eks
. Cremophor EL), fortrinnsrett akkumulering ved solide tumorer gjennom økt permeabilitet og oppbevaring EPR effekt (), unndra nyrefiltrasjon, og multifunksjonalitet ved overflaten dekorasjon.
Det har blitt diskutert at apoptose-målrettet levering av legemidler og kreft imaging ( spesielt for bildebehandling tumor respons på kjemoterapi) [15], [16] kan være bedre enn kreft-assosiert antigen eller protein målretting strategi i et bredt spekter av kreftformer, fordi betydelig heterogenitet i kreftcellepopulasjoner ikke garantere den eksklusive tilstedeværelse av antigen og protein biomarkører i målet vev [17]. Kirurgiske onkologer kunne dra nytte av apoptose-målrettet tumor imaging (uavhengig av celletype og celledød-induserende triggere) etter NACT med større presisjon og nøyaktighet [18]. Dermed kirurgisk tumor debulking bruker intraoperativ visuell veiledning med sanntids NIR fluorescens bilder kan føre til økt kirurgisk nøyaktighet og utfall. En av de mest fremtredende egenskapene til programmert celledød, apoptose, er eksternalisering av fosfatidylserin (PS), som normalt befinner seg hovedsakelig i den indre paknings av plasmamembranen [18].
I vårt tidligere arbeid, vi rapporterte at poly (etylenglykol) –
blokkere
-poly (ε-kaprolakton) (PEG-
b
-PCL) miceller som inneholder dIR (1,1′-dioctadecyltetramethyl indotricarbocyanine jodid) kunne passivt akkumulere i LS180 menneskelige solide kolon tumorvev ved EPR effekt og gi ikke-invasiv avgrensning av LS180 tumorvev med en tumor-til-muskel ratio på 30-43 fra innsamlede vev [19]. Vi har også observert forbedret dir akkumulering i «primede» LS180 tumorvev etter en intravenøs injeksjon av multi-legemiddel inneholdende poly (etylenglykol) –
blokkere
-poly (
D, L-melkesyre) (PEG –
b
-PLA) miceller, noe som antyder at tilgjengeligheten av en tandem av polymere micellene som kunne muliggjøre forbedret tumor avgrensing for anvendelse ved kirurgisk onkologi [20]. Mer nylig, PEG-
b
-PCL miceller med paclitaxel (PTX), cyclopamine (CYP), og gossypol (GSP) ved 30, 30 og 30 mg /kg, henholdsvis (q7d x 3) leveres via IP, hindret metastatisk spredning av kreft i eggstokkene og omfattende ascites formasjon, noe som resulterer i forlenget overlevelse i peritonealt metastatisk ES-2-luc (udifferensiert adenokarsinom, aggressiv subtype) og Skov-3-luc (serøs adenokarsinom, moderat grad av subtype) murine xenograft modeller av eggstokkreft [21].
Vi foreslår en ny to-trinns strategi for NACT, apoptose-målrettet optisk bildebehandling og intraoperativ kirurgisk veiledning (figur 1). I trinn én, PEG-
b
-PCL miceller som inneholder PTX, CYP, og GSP brukes til IP NACT og apoptose induksjon i tumorvev. I et andre trinn, kan apoptose målretting PEG-
b
-PCL miceller som inneholder dir aktivt akkumuleres i apoptotiske tumorvev, tillater optisk fluorescens avbildning av apoptose i en sanntid måte (figur 1). Dir molekyler, NIR fluorescens sonder sender ut lys i vinduet bølgelengde NIR, kan være nyttig som en optisk fluorescens avbildningsmiddel, unngå sterk autofluorescens fra hud og blod og tillate detekterbare signaler som skal måles gjennom flere millimeter vev [22]. I dette arbeidet, viser vi at denne to-trinns strategi forbedret svulst avgrensing i NIR fluorescens optisk avbildning og nyttige råd for intervall debulking kirurgi i en IP ES-2-luc bærende xenograft modell av eggstokkreft, kopling to anvendelser av polymere miceller i levering av legemidler og optisk bildebehandling for kirurgisk onkologisk behandling av eggstokkreft.
Materialer og metoder
Utarbeidelse av PEG-
b
-PCL Miceller Bære PTX, CYP og GSP
narkotika~~POS=TRUNC lastet PEG-
b
-PCL miceller ble utarbeidet av et løsemiddel fordampning metode som tidligere beskrevet [21]. Kort, 4,0 mg PTX, CYP, og GSP hver og 120 mg PEG-
b
-PCL (M
n av PEG = 5000 g /mol, M
n av PCL = 10000 g /mol, og M
w /M
n = 1,26) (Advanced Polymer Materials Inc., Montreal, Canada) ble fullstendig oppløst i 1,0 ml aceton, etterfulgt av en hurtig tilsetning av 1,0 ml forvarmet 0,9% saltløsning ved 60 ° C med kraftig blanding. Aceton ble fordampet under redusert trykk ved 60 ° C. Den vandige micelle-løsning ble sentrifugert i 5 minutter ved 10.000 x
g
og ført gjennom en 0,2 um regenerert cellulose (RC) sterilt sprøytefilter (Corning, Tewksbury, MA) for å fjerne uoppløselige stoffer. Innholdet av PTX, CYP, og GSP i PEG-
b
-PCL miceller ble kvantifisert ved reversfase-HPLC (RP-HPLC) systemet med en Shimadzu Prominence HPLC system (Himadzu, Japan) som tidligere beskrevet [ ,,,0],21]. Separasjonen av PTX, CYP, og GSP ble gjort i en isokratisk modus med mobil fase av 55% acetonitril, 45% destillert vann, og 0,1% trifluoreddiksyre. PTX, CYP, og GSP ble overvåket på 227, 204 og 373 nm, henholdsvis, og eluert ved 2,7 min, 1,9 min, og 10,6 min, henholdsvis.
Produkter av apoptose målretting PEG-
b
-PCL og metoksy-PEG-
b
-PCL Miceller Bære dir
Klargjøring av apoptose målretting PEG-
b
-PCL (GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-
b
-PCL) miceller bærer dIR ble startet med konvertering av acetal grupper på overflaten av PEG-
b
-PCL miceller til aldehydgrupper (Figur S1). Acetal-PEG-
b
-PCL (M
n av PEG = 5000 g /mol, M
n av PCL = 5000 g /mol, og M
w /M
n = 1,13) ble vennlig levert av Dr. Afsaneh Lavasanifar, University of Alberta (Edmonton, Canada). Konverteringen metoden ble litt modifisering fra litteraturen [23]. Acetal-PEG-
b
-PCL kopolymer ble oppløst i aceton i en konsentrasjon på 20 mg /ml. Destillert vann ble deretter hurtig tilsatt til polymerløsningen under kraftig omrøring ved romtemperatur, etterfulgt av inndamping av aceton under redusert trykk ved romtemperatur. Micellen Løsningen ble sentrifugert i 5 minutter ved 10.000 x
g
og ført gjennom en 0,2 um RC sterilt sprøytefilter. Konvertering av acetal grupper på acetal-PEG-
b
-PCL miceller ble utført ved pH 2,0 ved å tilsette 0,5 N HCl. Etter 4 timer med moderat omrøring ved værelsestemperatur ble reaksjonsblandingen nøytralisert med 0,5 N NaOH for å stoppe reaksjonen. Den nøytraliserte micell-løsningen ble deretter dialysert mot vann med dialysemembran (MWCO 6000 g /mol) for å fjerne salt over natten og lyofilisert i 48 timer for fremtidig bruk. Frysetørket prøve ble oppløst i CDCh
3 (6 mg /ml) for å anslå konverteringsfrekvensen fra acetal til aldehyd gruppe på PEG-
b
-PCL av
1 H NMR. Fritt peptid, GFNFRLKAGAKIRFGS (UW Biotechnology Center, Madison, WI) ved Mw = 1769 g /mol (figur 2A), ble oppløst i HEPES buffer (10 mM, pH 6,4) og blandet med det lyofiliserte aldehyd-PEG-
b
-PCL miceller for å oppnå 4 mg /ml av polymeren og 0,35 mg /ml av peptidkonsentrasjonen ved 02:01 molforhold (aldehyd-PEG-
b
-PCL: GFNFRLKAGAKIRFGS). Etter 2 timer med moderat omrøring ble NaBH
3CN (10 ekv) tilsatt til blandingen for å redusere Schiff-base. Etter 4 dager ble micelle-løsning igjen dialysert mot vann med dialysemembran (MWCO 6000 g /mol) over natten og deretter GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-
b
-PCL micelle-løsning ble lyofilisert i 48 timer. Konjugeringen effektivitet av peptid på aldehyd-PEG-
b
-PCL ble bestemt ved RP-HPLC-analyse. Kort beskrevet ble prøver (10 ul) injisert i en Zorbax 300SB-C18-kolonne (4,6 x 15 mm, 3,5 um, Agilent) holdt ved 40 ° C og strømningshastigheten var 0,8 ml /min. Gradienteluering ble utført med mobil fase av 0,1% trifluoreddiksyre i destillert vann og 0,1% trifluoreddiksyre i 90/10 (v /v) acetonitril /destillert vann. Den mobile fasen ble programmert som følger: 0 min 85% oppløsningsmiddel A og 15% løsningsmiddel B; 35 min, 50% oppløsningsmiddel A og 50% oppløsningsmiddel B. Fritt peptid ble overvåket ved 215 nm og eluert ved 16 min. Mengden av peptid konjugert på PEG-
b
-PCL miceller ble beregnet ved å trekke beløpet av fritt peptid fra mengden av peptid i utgangspunktet lagt til reaksjon. Parallelt lyofilisert peptid konjugert på PEG-
b
-PCL ble oppløst i DMSO
d
6 (6 mg /ml) for å beregne konjugering frekvensen av peptidet på PEG-
b
-PCL av
1 H NMR ved 80 ° C.
Resultatene er presentert som% FLI dir molekyler bundet på tallerkener og% FLI fra dIR molekyler bundet på ES-2-Luc eggstokkreft tumor kuler. BLI fra ES-2-Luc celler og FLI fra dir molekyler ble kvantifisert ved hjelp Xenogen IVIS 200 Series. (A) Konkurranse binding test av apoptose målretting PEG-
b
-PCL miceller bærer dir (1,0 mikrometer peptid og 500 nM dir) til PC- eller PS-belagte 96-brønners plater (totalt 200 mikrometer av fosfolipid ). (B) Konkurranse binding test av apoptose målretting PEG-
b
-PCL miceller bærer dir til apoptose indusert ES-2-Luc ovarian tumor kuler (** 0,01, *** 0,001) .
metoksy-PEG-
b
-PCL og apoptose målretting PEG-
b
-PCL miceller bærer dir ble utarbeidet av et løsemiddel fordamping metode: 4,0 mg av polymerer og 0,1 mg av dir (Invitrogen, Carlsbad, CA) ble oppløst i 1,0 ml aceton, etterfulgt av en hurtig tilsetning av PBS (10 mM, pH 7,4) under kraftig blanding. Aceton ble fordampet under redusert trykk ved romtemperatur. Den vandige micelle løsning som inneholder DIR ble sentrifugert i 5 minutter ved 10000 x
g Hotell og gått gjennom et 0,2 mikrometer RC steril sprøyte filter for å fjerne unincorporated dir. Innholdet av dir i miceller ble kvantifisert ved RP-HPLC som tidligere beskrevet [20]. Elueringen av dir ble gjort i en gradient modus med mobil fase av 70% destillert vann og 0,07% trifluoreddiksyre som oppløsningsmiddel A og 30% acetonitril og 0,03% trifluoreddiksyre som oppløsningsmiddel B. DIR ble overvåket ved 745 nm og eluert ved 16 min.
Fysisk karakterisering av metoksy-PEG-
b
-PCL og apoptose målretting PEG-
b
-PCL Miceller Bære dir
Z -gjennomsnittlig diameter på metoksy-PEG-
b
-PCL miceller og apoptose målretting PEG-
b
-PCL miceller bærer dir ble bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS) målinger ved hjelp Zetasizer Nano- ZS (Malvern Instruments, Storbritannia) ved 25 ° C med en deteksjonsvinkel på 173 ° og en He-Ne ion laser (4 mW, λ = 633 nm) for den innfallende strålen. Autokorrelasjonsfunksjoner ble laget basert på cumulant analyse, beregning av hydrodynamisk diameter miceller fra Stokes-Einstein ligningen og polydispersitetsindeksen (PDI). Før målingene ble det micelle-oppløsninger fortynnet med PBS (10 mM, pH 7,4) for å gi en polymerkonsentrasjon på ~ 0,4 mg /ml som representerer polymerkonsentrasjonen over den kritiske micelle-konsentrasjon. DIR lasteeffektivitet ble vist som% vekt dir /vekt polymer.
in vitro
dir frigjøringskinetikk metoksy-PEG-
b
-PCL og apoptose målretting PEG-
b
-PCL miceller bærer dir ble studert for å estimere tid for 50% medikamentfrigjøring (t
1/2) basert på en en-fase forfall modellen ved hjelp GraphPad Prism versjon 5.00 for Mac OS X (La Jolla, California). DIR-lastet miceller, som representerer 100 ug /ml av dir, ble tilsatt til dialysevideokassetter (MWCO 20 000 g /mol), og kassettene ble plassert i 2,0 liter PBS (10 mM, pH 7,4) ved 37 ° C med moderat omrøring. Prøver (20 μΛ ble tatt ut av kassettene ved ulike tidspunkter, 0, 0,5, 1, 2, 3, 8, 12 og 24 timer, og etter hver sampling, ble kassetter etterfylles med 20 μΛ av fersk PBS (10 mM, pH 7.4 ). innholdet av dir i miceller igjen i kassetter ble analysert ved RP-HPLC som beskrevet ovenfor.
Vurdering av PS-selektiv Binding av apoptose målretting PEG-
b
-PCL miceller Bære dIR
Binding av apoptose målretting PEG-
b
-PCL miceller bærer dir til PS ble vurdert ved hjelp fosfolipid-belagte brønn plater [24] og 3-D svulstklumper dannet av luciferase-uttrykke ES-2-Luc-celler. PC eller PS oppløst i etanol ble immobilisert på klar bunn 96-brønners plater ved en konsentrasjon på ca 200 pM i hver brønn, og etanol ble avdampet ved romtemperatur natten over. Noen av PC eller PS-belagte brønnene ble inkubert med 1,0 mikrometer gratis peptid i 3 timer for å mette PS på fosfolipid-belagte brønner. Apoptose målretting PEG-
b
-PCL miceller bærer dir, som representerer 1,0 mikrometer peptid og 500 nM dir, ble tilsatt til brønnene og det ble inkubert i 1 time ved romtemperatur i mørke. Hver brønn ble vasket med PBS (10 mM, pH 7,4) og apoptose målretting PEG-
b
-PCL miceller bærer dir bundet på brønner ble oppdaget av Xenogen IVIS 200-serien (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) . ES-2-Luc 3-D-tumor sfæroider ble samlet ved utsåing 5000 ES-2-luc celler /brønn i agarose-belagte 96-brønners plater og inkubert i 4 dager. ES-2 human ovarian cancer-celler ble stabilt transfektert med luciferase-uttrykkende plasmid pGL4.51 som inneholder neomycin-resistensgenet (Promega, Madison, WI) ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) som tidligere beskrevet [21]. ES-2-Luc-celler ble dyrket i McCoys 5a-medium supplert med 1% L-glutamin, 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin /streptomycin, og 750 pg /ml G418 antibiotika og holdt ved 37 ° C under en atmosfære av 5 % CO
2 i en fuktet inkubator. PEG-
b
-PCL miceller som inneholder PTX, CYP, og GSP (3,3, 3,3, og 3,3 nM) ble lagt til ES-2-Luc kreftklumper og ruges i 3 dager. Noen av de behandlede ES-2-Luc sfæroider ble inkubert i 3 timer med 200 nM av fritt peptid for å mette PS eksponert på tumor sfæroider. Apoptose-målretting PEG-
b
-PCL miceller som bærer DIR ble deretter tilsatt til ES-2-Luc tumor sfæroider ved en sluttkonsentrasjon på 200 nM peptid og 100 nM DIR og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C i 5% CO
2 fuktet inkubator. Som en kontroll, bioluminescens intensiteten av ES-2-Luc-celler ble også overvåket for å sikre at ES-2-Luc tumor sfæroider ble gående dannet i hver brønn, ved hjelp av Xenogen IVIS 200 Series.
Intraperitoneal human Ovarian Cancer Xenograft og Micelle behandlinger
Dame 6-8 uker gamle atymiske nakne Foxnl
nu mus ble kjøpt fra Harlan Laboratories (Madison, WI). Alle dyreforsøk ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health (NIH). Det etiske og humane bruk av dyr ble informert av All Campus Animal plan- og Advisory Committee (ACAPAC) og protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Wisconsin-Madison (Permit nummer: M02472) . Narkose ble indusert med 1,5% isofluran /oksygen og vedlikeholdes med 1% isofluran /oksygen. ES-2-Luc-celler ble trypsinert, oppsamlet fra sub-konfluente kulturer, og 1 x 10
6 celler /dyr av ES-2-Luc-celler ble injisert inn i bukhulen til bedøvde mus. IP-injeksjon av PEG-
b
-PCL miceller bærer 30, 30, og 30 mg /kg av PTX, CYP, og GSP ble utført 7 dager etter inokulering av IP-ES-2-Luc-celler etter observasjon av biolumine signal i hele kroppen bilder av dyr med Xenogen IVIS 200 Series. En dag etter at IP-injeksjon av PEG-
b
-PCL miceller som inneholder PTX, CYP, og GSP, metoksy eller apoptose målretting PEG-
b
-PCL miceller som frakter 250 mikrogram /kg av DIR ble injisert gjennom halevenen til bedøvede dyr. Kroppsvekt av dyrene ble målt ved hjelp av en bærbar målestokk, og generelle utseende og dødelighet av dyr ble nøye overvåket under alle sett av dyreforsøk. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelsene til dyrene. Dyr ble avlivet ved medisinsk kvalitet karbondioksyd med strømningshastighet på 10-30% av eutanasi kammervolumet per minutt.
TUNEL-analysen
ES-2-luc bærende xenograft ble dosert via IP rute med PEG-
b
-PCL miceller bærer PTX, CYP, og GSP på dag 7 etter ES-2-Luc celler ble inokulert i bukhulen. Etterpå dyr (
n
= 4) ble avlivet ved 0, 12, 24, 48 og 72 timer etter behandling micelle. Tumor, milt, nyre, lever og vev ble dissekert. DNA-fragmentering indusert ved apoptose ble påvist i vev av TdT-mediert dUTP Nick-End Merking (TUNEL) metode med bruk av blindgaten Fluorometrisk TUNEL analysen kit (Promega, Madison, WI). Vev ble frosset delt inn i 10 mikrometer skiver, permeabilized av proteinase K, og festes med 4% formaldehyd. Reaksjonsblandingen bestående av TdT og fluorescein-merket dUTP ble tilsatt til fast del av vevet og inkubert i 1 time ved 37 ° C i et fuktet kammer i mørke. Fluorescein-merkede DNA-fragmenter og kjerner av celler couterstained etter DAPI ble visualisert ved 520 nm og 460 nm, henholdsvis, ved hjelp av et konfokalt mikroskop (Olympus FV1000 FLUOVIEW, Minneapolis, MN). Apoptotiske celler og kjerner av celler ble vist i grønt og blått, respektivt.
bioluminescens og Fluorescens Imagings
Xenogen IVIS 200-serien ble brukt for å avbilde både bioluminescens og fluorescens fra objekter
in vitro
,
in vivo
, og
ex vivo
. Xenogen IVIS 200-serien var utstyrt med en 150 watt kvartshalogenlampe og en 1 mW scanning laser. Bilder ble på skjermen, med romlig oppløsning på 60 mikrometer /pixel. Bioluminesens bilder ble kjøpt opp av et belastet par enhet (CCD) kamera med følgende parametre: eksponeringstid = 1 s, binning = medium, og f /stop = 2.
In vitro
, D-luciferin (Sylinder Livet Science, Hopinton, MA) ved 10 ug /brønn ble lagt inn i ES-2-luc svulstklumper 5 min før bioluminescence bildebehandling, og
in vivo
, D-luciferin på 113 mg /kg ble injisert IP inn ES-2-luc bærende xenograft modell 5 min før hele kroppen bioluminesens imaging. Dynamikken i ES-2-Luc tumorvekst ble samlet og vist som fargekodede bilder med Live-bildebehandling for kvantitativ analyse og BLI av ES-2-Luc svulster ble skalert med totaltellinger.
Fluorescens bildene var også kjøpt opp av en ladet par enhet (CCD) kamera med følgende parametre: eksponeringstid = 1 s, binning = medium, og f /stop = 2. et filter innstilling for dIR påvisning ble fastsatt til 745 nm for eksitasjon og 800 nm for utslipp. Alle fargekodede bildene ble samlet inn ved hjelp Live-bildebehandling for bilde oppkjøpet og analyse. FLI av dir ble demonstrert av gjennomsnittlig strålende effektivitet, totalt fotoner per sekund per kvadratcentimeter per steradian i irradians området (mikrowatt per kvadratcentimeter): [ps
-1cm
-2sr
-1] /[ ,,,0],μW cm
-2]. Fluorescens dir i tumorvev ble fastsatt til gjennomsnittlig strålende effektivitet på ROI trukket rundt tumorvev forhåndssatt av bioluminesens avbildning av en identisk dyr.
Whole-body Bioluminescens og fluorescens bilder ble registrert på 6, 12, 24 , og 48 timer etter en intravenøs injeksjon av PEG-
b
-PCL miceller bærer dir. Mus ble plassert i mage stillinger for å få hele kroppen fargekodede Bioluminescens og fluorescens bilder. Alt utstyr innstillinger for Bioluminescens og fluorescens imagings var identiske i tidsforløpet forsøket.
Sanntids Fluorescens Imaging Acquisition i Dyr
Fluobeam 800 er en 2-D NIR fluorescens imaging system bestående av CCD kamera og en integrert NIR lyskilde (100 mW) med en eksitasjonsbølgelengde på 780 nm og en emisjonsbølgelengde på 820 nm. Dette systemet gitt 7,5 x 10 cm av homogen lettet felt og den bærbare håndholdte system bestående av kamera og laser ble plassert ca 20 cm over objektet. Fluorescens bilder var på skjermen, med romlig oppløsning på 110 mikrometer /pixel og registrert som enten svart-hvitt-statiske bilder (9 bilder /sek) eller videoer i sanntid (25 bilder /sek).
kirurgisk prosedyre
Dyr mottok en intraperitoneal injeksjon av D-Luciferin (113 mg /kg) 5 minutter før det hele kroppen bioluminescens avbildning på dag 9 etter ES-2-luc celle vaksinasjon (24 timer etter IV-injeksjon av PEG-
b
-PCL miceller bærer dIR). Etter hele kroppen bioluminesens bilde ble gjennomført, ble dyrene avlivet umiddelbart. Alle ofret dyr gjennomgikk en midtlinjen laparotomi og Bioluminescens hele kroppen bilder av radert dyr ble hentet igjen. Alle kirurgiske prosedyrer ble utført på ofret dyr og ved en kirurgisk onkolog opplevd i murine kirurgi. I ett sett av forsøket (
n
= 4), for sammenligning, ble den tradisjonelle kirurgisk tumorreseksjon utført under den normale hvitt lys. Når kirurgisk tumorreseksjon ble godkjent, ble dissekert svulstlignende vev og kadaver skannet av Xenogen IVIS 200-serien for å få Bioluminescens bilder. I en annen gruppe av dyr (
n
= 4), NIR imaging system, den Fluobeam 800 NIR imaging system ble slått på, og det kirurgiske tumorreseksjon ble assistert av sanntids fluorescens bilder som vises på skjermen. Når tumor-lignende FLU
+ vev ble skåret ut så fullstendig som mulig, dissekert svulstlignende vev og kadaveret ble skannet med Xenogen IVIS 200-serien for å få Bioluminescens og fluorescens bilder. Varigheten av operasjonen ble registrert fra tidspunktet for innsnitt til ferdigstillelse av tumor debulking. Kirurgisk nøyaktighet ble vurdert ved hjelp av to beregninger: (1)% sum av BLU
+ svulstlignende vev til summen av de totale kreftlignende vev skåret gjennom den kirurgiske prosedyren, og (2) totaltellinger av BLI av [ROI i midten -line radert dyr minus avkastningen i dissekert dyret] over dem av ROI i midtlinjen radert dyr. Kirurgisk nøyaktighet ble også målt ved å beregne en post-reseksjon peritoneal kreft indeks (PCI) som beskrevet av Sugarbaker [3]. PCI er avhengig av fordelingen og størrelsen av lesjoner i magen på dyret. I denne studien ble PCI tilpasset til tumorstørrelser i mus med følgende poengsummene: Buken ble delt inn i 13 regioner og lesjonen størrelse (LS) ble scoret (0 til 3) i hver region som følger: ingen synlige tumorer (LS = 0) 0 til 0,5 mm, tumor (LS = 1), 0,6 til 2,0 mm tumor (LS = 2), og 2,0 mm svulst (LS = 3). Total LS poengsum per dyr ble summert som en poengsum som kan varierte fra 0 (ingen tumorer observert) til 39 (13 områder × 3).
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble gjort ved hjelp enveis ANOVA på 5% signifikansnivå kombinert med Tukey er flere sammenligningstester av GraphPad Prism ver 5.00 for Mac OS X (La Jolla, California).
Resultater
Karakterisering av apoptose målretting PEG –
b
-PCL Miceller Bære dir
Tabell 1 viser størrelser og lasteeffektivitet (% vekt dir /vekt polymer) av apoptose målretting PEG-
b
-PCL ( GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-
b
-PCL) og metoksy-PEG-
b
-PCL miceller oppnådd etter forming dIR-innlemmet miceller av en løsemiddelfordamping teknikk. Apoptose målretting PEG-
b
-PCL miceller hadde en z-gjennomsnittet diameter på 83 ± 2 nm (polydispersitet indeks, PDI 0,1) og metoksy-PEG-
b
-PCL miceller hadde en z-midlere diameter på 45 ± 2 nm (PDI 0,1). Laste effektiviteten dir for begge miceller var ca 2%. Peptid (GFNFRLKAGAKIRFGS) ble konjugert på PEG-
b
-PCL miceller med det molare konjugering ratio på 30%
via
en Schiff-base reaksjon, basert på resultater fra både HPLC (subtraktiv kvantifisering av ikke -konjugert peptidet fra peptid opprinnelig tilsatt for reaksjon) og
1 H NMR (kvantifisering av konjugert peptid) analyse (data ikke vist). I
1H-NMR-analyse, er den relative intensitet forholdet mellom toppen av benzyl-protoner av fenylalanin ved δ = 7,2 ppm i peptidet til metylen proton toppen av PEG protoner ved δ = 3,7 ppm bestemmes nivået av peptidet på PEG-
b
-PCL. Dataene for peptidet kvantifisering fra HPLC og
1H NMR gitt sammenlignbare verdier.
