?
Abstract
Bakgrunn
S-propargyl-cystein (SPRC), en H
2S donor, er en strukturell analog S-allycysteine (SAC). Det ble undersøkt for sin potensielle anti-kreft effekt på SGC-7901 magekreftceller og de mulige mekanismer som kan være involvert.
Metoder og funn
SPRC behandling betydelig redusert celle levedyktighet, undertrykt spredning og migrasjon av SPRC-7901 magekreftceller, var pro-apoptotiske samt forårsaket cellesyklus arrest på G
1 /S-fasen. I en
in vivo
studien, intra-peritoneal injeksjon av 50 mg /kg og 100 mg /kg av SPRC betydelig redusert tumorvekt og tumorvolumer av magekreft implantater i nakne mus, med en tumorvekst inhibering hastighet 40-75%. SPRC induserte også en pro-apoptotisk effekt i kreftvev og forhøyet uttrykk av p53 og Bax i svulster og celler. SPRC behandling også økt protein uttrykk for cystathione-γ-lyase (CSE) i celler og svulster, og forhøyet H
2S nivåer i cellekultur media, plasma og tumor CSE aktivitet av magekreft-indusert naken mus ved 2, 2,3 og 1,4 ganger, respektivt. De fleste av de anti-kreft funksjonene SPRC på celler og svulster ble betydelig undertrykt av PAG, en hemmer av CSE aktivitet.
Konklusjoner
Til sammen resultatene fra vår studie gir innblikk i en roman anti-kreft effekt av H
2S samt av SPRC på magekreft gjennom indusere aktiviteten til et nytt mål, CSE
Citation. MA K, Liu Y, Zhu Q, Liu Ch, Duan JL, Tan BK-H, et al. (2011) H
2S Donor, S-propargyl-cystein, Øker CSE i SGC-7901 og kreft-indusert Mus: Bevis for en Novel Anti-Cancer effekten av endogent H
2S? PLoS ONE seks (6): e20525. doi: 10,1371 /journal.pone.0020525
Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA
mottatt: 15 april 2011; Godkjent: 02.05.2011; Publisert: 27 juni 2011
Copyright: © 2011 MA et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Vi erkjenner finansiell bistand fra et stipend fra National Distinguished Unge Forskere Grant 385 (nr 30888002) i Kina, National 973 Project (2007CB512006 og 2010CB912600) og Shanghai-Unilever Research Utviklingsfond (08540750400).
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
S-propargyl-cystein (SPRC) er en strukturell analog S-allycysteine (SAC ) med den samme cystein-inneholdende struktur. SAC, en av de viktigste forbindelsene i alderen hvitløk ekstrakt, er avledet fra nedbrytningen av
S
-Alk (en) yl-cystein-sulfoksyder (ACSS). Denne forbindelse har antitumor [1], [2], anti-bakterielle [3], anti-fungal [4], anti-hepatotoksisk [5], kardiobeskyttende egenskaper [6] og apoptose [7]. Paclitaxel liposom, en lipid-basert formulering av anticancer medikament, paclitaxel, har blitt et første-linje medikament for behandling av refraktær eggstokkreft, bryst, mage og ikke-småcellet lungekreft. Vi undersøkte derfor
in vitro Hotell og
in vivo
kreft effekter av SPRC og sammenlignet disse med de av SAC og Paclitaxel liposome.
Cystathione-γ-lyase (CSE) er medlem av den trans-sulfuration enzym familie og er ansvarlig for å katalysere pyridoksalfosfat avhengige β-disulfid eliminering reaksjon som resulterer i ammonium, pyruvat og thiocysteine. Thiocysteine kan deretter reagere med andre tioler for å generere H
2S. P53 tumor suppressor protein spiller en stor rolle i cellulære svar på DNA-skader og andre genomiske avvik. Aktivering av p53 kan føre til enten cellesyklus-stans og DNA-reparasjon eller apoptose. Bax er en nøkkelkomponent i celle apoptose gjennom mitokondrie stress mens BCL-2 utøver en overlevelsesfunksjon som svar på et bredt spekter av apoptotiske stimuli gjennom hemming av mitokondrie cytokrom c utgivelse. Her for første gang, fant vi at kreft effekter av SPRC involvert en hydrogensulfid (H
2S) -mediert mekanisme. SPRC kan gjennomgå β-eliminering av CSE for å produsere endogent H
2S, som kan oppregulerer genekspresjonen av p53 og Bax, noe som resulterer i suppresjon av celleproliferasjon og apoptose. Vår undersøkelse viste således en ny anti-kreft effekt av det endogene H
2S donor, SPRC, på gastrisk kreft gjennom induserende aktiviteten til et nytt mål, CSE. Vi demonstrerte for første gang at SPRC var i stand til å undertrykke celleproliferasjon og migrering og også tumorvekst i magekreft-indusert modell av nakne mus, noe som indikerer at det kan være et potensielt middel for behandling av magekreft hos mennesker. Våre resultater viste at de anti-kreft-effekter av SPRC ble tilskrevet undertrykkelse av cellesyklus og induksjon av apoptose. Videre våre resultater viste også at SPRC kunne regulere genekspresjon av CSE, Bax og p53. Vi fant ut at PAG, en hemmer av CSE aktivitet, kunne gi en betydelig undertrykke kreft effekter av SPRC.
Resultater
Doseavhengig, vekst hemmende og påvisning av cytostatisk effekt av SPRC på SGC- 7901 celler
Effekter av SPRC på SGC-7901 magekreftceller ble vist i figur 1A, 1 uM og 10 um SPRC produsert 18-25% hemming av levedyktighet SGC-7901 celler. 20 mM til 30 mM SPRC forårsaket omtrent 50% celleviabilitet inhibering. Vi har også funnet ut at SPRC ved lave konsentrasjoner av en uM og 10 um kunne gi en betydelig undertrykke kolonidannende og migrasjon evne SGC-7901; disse effektene var mer betydelig sammenlignet med SAC (Tall 1B, 1C og 1D). PAG, en inhibitor av CSE, blokkerte den hemmende effekten av SPCR på cellevekst (figurene 1B og 1C). Resultatene indikerte at CSE veien var involvert i SPRC-indusert undertrykkelse av cellevekst.
A. Dose-responsstudie av virkningene av SPRC for veksthemming av SGC-7901-celler. B. Effekter av SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC og paclitaxel liposom på levedyktigheten til SGC-7901 celler. C. Effekter av SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC og paclitaxel liposom på kolonidannelse i SGC-7901 celler. D. Effekter av SPRC, SAC og paclitaxel liposom om migrasjon evne SGC-7901 celler. Differensialcellemigrering egenskaper ble undersøkt ved hjelp av den sår-lukke analysen. E. Effekter av SPRC, SAC og paclitaxel liposomer på sårheling hastighet. Verdier er uttrykt som% av kontroll. * Representerer signifikant forskjell mellom kontroll vs. SPRC, SAC og paclitaxel liposome grupper (p 0,01).
# representere signifikant forskjell (p 0,01) mellom SPRC vs SPRC + PAG gruppen (p 0,01).
Morfologiske endringer, apoptose og cellesyklus analyse
apoptose [ ,,,0],21] er programmert celledød som kjennetegnes ved spesifikke strukturelle endringer som inkluderer cellekrymping, kjernekondensering og DNA-fragmentering. Hoechst farging ble anvendt for å observere de morfologiske forandringer av cellene behandlet med paklitaxel liposom, SPRC og SAC. Som vist i figur 2A, elektronmikroskopi viste at morfologiske endringer som er karakteristiske for apoptose skjedde i SGC-7901-celler etter behandling med SPRC sert i 24 timer. Cellene oppviste en tett fargemønster med DNA-fragmentering og fravær av forskjellige nukleære membraner. Kontrollceller har ikke oppviser tilsvarende morfologiske endringer. Apoptose-induserende virkninger av SPRC ble vurdert ved flow-cytometri (figur 2B); 24-timers behandling av SGC-7901-celler med 10 uM SPRC resulterte i en betydelig økning på omtrent 26% av apoptotiske legemer sammenlignet med kontrollgruppen. Til sammenligning var andelen av apoptotiske celler i Paclitaxel liposome og SAC-behandlede gruppene var mindre med ca 8% og 4%, henholdsvis.
A. behandling med SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC og paclitaxel liposom (10 UM) i 24 timer for å bestemme apoptotic endringer analysert under et fluorescens mikroskop. B. Analyse av apoptotiske celler ved Flowcytometrisk analysen. C. Cellesyklus distribusjon. Markører på bildene viser: 1, Control. 2, SPRC 10 UM. 3. SAC 10 UM. 4. PAG 10 UM. 5. SPRC + PAG, hver 10 UM. 6. Paclitaxel liposome 10 UM.
Effekten av SPRC på cellesyklusen aktiviteten til SGC-7901-celler ble analysert ved å utføre propidiumjodidfarging fulgt av deteksjon med flowcytometri. I samsvar med dens effekt på hemming av cellevekst, SPRC indusert cellesyklus arrest i SGC-7901 celler på G
1 /S-fasen (figur 2C). 10 uM SPRC også resultert i en økt akkumulering av 24% av cellene i G
1 fase og redusert 20% av celler i S-fasen av cellesyklusen, sammenlignet med kontrollgruppen. Dette tyder på at det er en blokkering i G
1 /S fase overgang, noe som kan føre til cellevekst undertrykkelse eller apoptose. Den pro-apoptotiske virkning av SPRC så vel som dens virkning av cellesyklus-stans ved G
1 /S-fasen er også i stor grad hemmet av PAG.
Effekter av SPRC på CSE protein ekspresjon og aktivitet og H
2S nivåer
uttrykk for CSE protein i SGC-7901 celler (figur 3A, B og C) og svulster i nakne mus (Tall 3 D, E og F) ble signifikant økt med SPRC behandling. SPRC i doser på 50 mg /kg og 100 mg /kg økte signifikant CSE aktivitet med omtrent 1,4 ganger (figur 3G). CSE aktivitet i tumorer SPRC-behandlede nakne mus var høyere enn i vev av den SAC-behandlede gruppen. H
2S nivåer i cellekultur media (figur 3 H), plasma av hårløse mus (figur 3I) ble målt. «H
2S nivå i cellekulturmedier av 10 uM SPRC-behandlede celler og plasma-H
2S av 50 mg /kg og 100 mg /kg SPRC-behandlede nakne mus ble også signifikant økt sammenlignet med kontrollgruppen (P 0,05). Sammenlignet med den SAC-behandlede gruppe mus, den SPRC-behandlede gruppen hadde signifikant høyere H
2S nivå (P 0,05). De forhøyede nivåer av CSE protein uttrykk, CSE aktivitet og H
2S i SPRC-behandlede gruppen var alle i stor grad redusert med PAG behandling. Resultatene av disse forsøk således antydet at anticancer virkning av SPRC ble mediert av aktivering av CSE /H
2S pathway
A, bane 1, kontrollgruppe.; Lane 2, paclitaxel liposom 10 um; Lane 3, SPRC en uM; Lane 4, SPRC 10 uM; Lane 5, SAC 10 uM; Felt 6, Kontroll-gruppe; Lane 7, SPRC 10 uM; Lane 8, PAG 10 uM; Lane 9, PAG + SPRC 10 UM. For D: Lane 1, kontroll; Kolonne 2, paclitaxel liposom 10 mg /kg; Kolonne 3, SPRC 50 mg /kg; Felt 4, SPRC 100 mg /kg; Felt 5, SAC 100 mg /kg; Lane 6, kontroll; Spor 7, SPRC 100 mg /kg; Lane 8, PAG 100 mg /kg; Lane 9, PAG + SPRC 100 mg /kg. Relativ intensitet er beregnet ved å sammenligne med intensiteten av GAPDH hjelp densitometry (vist i grafene til høyre). * Representerer signifikant forskjell mellom kontroll vs. SPRC, SAC og paclitaxel liposom behandlede gruppene (p 0,05).
# representerer betydelig forskjell mellom SPRC 10 um vs. SPRC + PAG gruppen. Fig G viser CSE aktivitet (pmol /g) i magekreft av alle grupper. Figur H viser H
2S nivåer (um) i cellekultur media. Figur I viser plasma H
2S nivåer i mage svulster i nakne mus av ulike grupper.
Effekter av SPRC og SAC på genekspresjon av Bax, p53 og BCL-2
veksten-undertrykkelse effekt av SPRC på SGC-7901 celler ble vurdert til å analysere effekter på cellesyklus aktivitet og uttrykk for apoptose regulatoriske gener – Bax, p53 og BCL-2. Som vist i figur 4A og 4B, fant vi at 24-timers SPRC behandling betydelig økt mRNA nivå (ca. 1,5 ganger) og protein nivå av p53 og Bax av SGC-7901 celler.
A. Lane 1, paclitaxel liposom 10 um; Lane 2, kontroll; Lane 3, SPRC 10 uM; Lane 4, SPRC en uM; Lane 5, SAC 10 uM; Lane 6, SAC en UM. Relativ intensitet er beregnet ved å sammenligne med intensiteten av β-aktin hjelp densitometry (vist i grafene til høyre). B. Kvantifisering av Bax, p53 og BCL-2 mRNA uttrykk. * Representerer betydelig betydning mellom kontroll vs SPRC, SAC og paclitaxel liposomer på p 0,05 nivå
Vekst undertrykkelse [22] og induksjon av celle apoptose i svulster ved SPRC
Utvikling. av magekreft evaluert av tumorvolum ble signifikant redusert ved SPRC behandling av 50 mg /kg og 100 mg /kg kroppsvekt annenhver dag tre ganger i uken med en IR på 40-75% (figur 5A og 5B). Svulsten vekt ble også betydelig redusert i SPRC-behandlede grupper (Tall 5C) mens PAG behandling betydelig redusert vekst undertrykkelse funksjon av SPRC. De representative svulster i forskjellige grupper viste åpenbare tumorstørrelse endring (figur 5D og 5E).
A. Endring i gjennomsnittlig tumorvolum (mm
3). B. Inhibering hastighet (IR) på tumorvekst på forskjellige dager. C. Endring i tumor vekt. D. Endring i tumorstørrelse. E.
In vivo
svulst avbildning av nakne mus etter behandling i 24 dager. * Representerer signifikant forskjell (p 0,05) mellom kontroll vs. SPRC, SAC og paclitaxel liposom behandlede grupper.
#represents signifikant forskjell (p 0,05) mellom SPRC 100 mg /kg vs. SPRC + PAG og PAG behandlet grupper. F. H.E. farging med forsterkning av 4 × 10 og større forsterker bilder (100 × 10) på høyre hjørne. G. Tunnel farging (100 × 10) av apoptotiske legemer av mage svulster. Antall markører på bildene viser: 1, kontroll gruppe; 2, paclitaxel liposom 10 mg /kg gruppe; 3, SPRC 50 mg /kg gruppe; 4, SPRC 100 mg /kg gruppe; 5, SAC 100 mg /kg gruppe.
Vi undersøkte også om tumorvekstinhibitering av SPRC ble reflektert i apoptose av tumorceller. H E farging avslørt (figur 5F) mer apoptotisk tumorcelle i paclitaxel liposom og SPRC-behandlede grupper. TUNEL-farging viste at svulster fra SPRC-behandlede mus hadde en markert høyere telling av apoptotiske legemer sammenlignet med kontrolltumorer (Figur 5G). Den økte forekomsten av apoptose i svulstene var i samsvar med effekten av tumorvekstinhibitering av SPRC, noe som tyder på at SPRC utøves tumorvekstinhibitering dels ved styrking av apoptose i svulstene.
Effekter av SPRC og SAC på protein og mRNA uttrykk [23] av Bax, p53 og BCL-2
undertrykkelse effekten av SPRC på Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP ble videre undersøkt av Bax, p53 og BCL-2. Denne effekten av SPRC ble også bekreftet i magekreft-indusert nakne mus som vist i figurene 6A og 6B. Den protein og mRNA-nivåer av Bax og p53 i SPRC-behandlede tumorer ble betydelig økt mens de av Bcl-2 ble redusert, sammenlignet med kontrolltumorer. Lokalisering og mengden av disse tre proteiner i tumorvev ble også identifisert ved farging. Som vist i figurene 6C og 6D, ingen tydelig farging av de pro-apoptotiske proteiner, Bax og p53, ble observert i kontrollgruppen, mens et sterkt signal av immunoreaktivitet ble observert i SPRC- og Paclitaxel liposom-behandlede grupper. En meget svakt positiv farging for den anti-apoptotiske protein, Bcl-2, ble påvist i SPRC-, Paclitaxel liposombundet og SAC-behandlede grupper i figur 6E. Disse resultatene viste at SPRC er i stand til å regulere genekspresjon av Bax, p53 og Bcl-2 mot celle apoptose.
A. protein uttrykk, Lane en kontroll; Kolonne 2 paclitaxel liposom 10 mg /kg; Felt 3 SPRC 50 mg /kg; Felt 4, SPRC 100 mg /kg; Felt 5, SAC 100 mg /kg. Relativ intensitet ble beregnet ved å sammenligne med intensiteten av β-aktin ved hjelp av densitometri. B. mRNA uttrykk. * Representerer statistisk signifikans mellom kontroll vs SPRC, SAC og paclitaxel liposombundet behandlede gruppene (p 0,05). C. Immunhistokjemisk farging av pro-apoptotiske proteiner, Bax. D. Immunohistokjemisk farging av pro-apoptotiske protein, p53. E. Immunhistokjemisk farging av pro-apoptotiske proteiner, BCL-2. Antall markører på bilder i Figur 6 C, D og E indikerer: 1, kontrollgruppe; 2, paclitaxel liposom 10 mg /kg; 3, SPRC 50 mg /kg; 4, SPRC 100 mg /kg; 5, SAC 100 mg /kg.
H
2S demonstrert pro-apoptose og anti- spredning effekt på SGC-7901 celler og magekreft modell av hårløse mus
funnet at SPRC øket CSE aktivitet, og som resulterer i forhøyet H
2S nivåer, noe som i sin tur modulerer genekspresjon av Bax, p53 og BCL2. Bax er direkte forårsaket mitokondriene drevet apoptose gjennom økt Mt uttrykk og redusert BCL-2 uttrykk. P53 tumor suppressor protein spiller en stor rolle i cellulære svar på DNA-skader og andre genomiske avvik. Aktivering av p53 fører til enten hemning av celleproliferasjon og DNA-skade eller apoptose gjennom Bax-protein i figur 7. Disse resultatene antydet en ny mekanisme for kreft effekter av SPRC via CSE /H
2S-indusert hemming av cellevekst og apoptose via p53 /Bax sti.
øke nivåene av H2S har slått modulerer Bax, p53 og BCL2 protein og mRNA uttrykk. Bax har indusert apoptose gjennom Mt og BCL-2 uttrykk. p53 fører til enten hemming av celleproliferasjon og DNA-skade eller apoptose gjennom Bax protein.
Diskusjoner
I denne studien har vi demonstrert en ny anticancer effekt av SPRC på magekreft og også data som tyder på det er mulig mekanisme. Flere nye punkter er generert fra vår studie. For det første, har vi demonstrert at SPRC var i stand til å redusere cellevekstevne i betydelig grad og også undertrykke migreringen av SGC-7901-celler. Dernest har vi funnet at SPRC var i stand til å øke apoptose relaterte morfologiske endringer og induserte en stor økning i andelen av apoptotiske celler samtidig med en åpenbar cellesyklus arrest på G
1 /S-fasen. Samlet utgjør disse to funnene støtter bevis for en hemmende effekt av SPRC på SGC-7901 celler. For det tredje, vi videre demonstrert at intra-peritoneal administrering av SPRC ved doser på 50 og 100 mg /kg kroppsvekt annenhver dag tre ganger i uken var effektiv i å hemme veksten av gastriske tumorer i nakne mus. For det fjerde har vi funnet at SPRC kan øke CSE aktivitet og også sin protein uttrykk som resulterer i forhøyet H
2S nivåer i cellekulturmedier og plasma av nakne mus. For det femte, fant vi at PAG, en hemmer av CSE, kunne i stor grad undertrykke de ovennevnte funksjonene SPRC. Sjette, fant vi at SPRC behandling forårsaket tydelig heving av mRNA og protein uttrykk for Bax og p53.
Det har blitt rapportert at H
2S [24], [25], [26] kan genereres i magekreftceller ved pyridoksal-5-fosfat-avhengig enzym CSE, hvor det L-cystein er substratet. CSE [27] kan katalysere pyridoksalfosfat avhengig β-disulfid og elimineringsreaksjon, noe som resulterer i dannelse av ammonium, pyruvat og thiocysteine. Thiocysteine deretter reagerer med andre tiol å danne H
2S. PAG har vært brukt i flere studier for å teste den biologiske effekten av inhibering av endogen H
2S produksjon [28] SPRC, en analog av SAC fikk cystein-inneholdende struktur som kan gjennomgå β-eliminering og tjene som et substrat av CSE. Nøkkelen propargylgruppe i SPRC kan kombinere med aktivitets områder av CSE å øke CSE aktivitet. I vår studie ble det observert tydelig økning i CSE protein uttrykk i magekreftceller og svulster i hårløse mus i SPRC-behandlede gruppen; Dette kan forklares som en «kompenserende effekten» å produsere H
2S å takle apoptose av kreftceller. Humane lungefibroblaster behandlet med H
2S donor, NaHS, viste en økning i DNA-skade, cellesyklus-stans og stabilisering av p53, kombinert med induksjon av nedstrøms proteiner, slik som p21, Bax og cytokrom c [29]. Det er blitt rapportert at behandling av bukspyttkjertelen akinærceller av H
2S er blitt vist å indusere apoptose, som følge av aktiveringen av caspase 3, ble proteinnivået av Bcl-2 og aktivering av Bax uttrykk. H
2S kan også indusere apoptose av insulin-sekresjon beta celler ved å styrke ER stress via p38 MAPK aktivering [30]. Det ble rapportert at p53 induserer apoptose enten ved å øke transkripsjonen aktivitet av pro-apoptotiske gener som Bax eller undertrykke aktiviteten av anti-apoptotiske genet av Bcl-2-familien [31], [32]. Bax er også kjent å indusere mitokondriene-drevet apoptose. Her fant vi også at aktivering av CSE og økt H
2S nivåer ved SPRC behandling ble kombinert med forhøyet p53 og Bax uttrykk i mage celler og svulster. Disse resultatene foreslo en ny mekanisme for kreft effekter av SPRC via CSE /H
2S-indusert hemming av cellevekst og apoptose gjennom p53 /Bax sti.
I konklusjonen, vår
in vitro
og
in vivo
eksperimentelle resultatene viste at hydrogensulfid donor, SPRC, hadde åpenbart hemmende og pro-apoptotiske effekt på magekreft. SPRC kan øke CSE aktivitet, noe som resulterer i økt nivå av H
2S, som igjen modulerer genekspresjon av Bax, p53 og BCL2.
Metoder
Alle dyr eksperimentelle protokoller oppfylt Animal Ledelse reglene for lokale myndigheter og «Care og bruk av forsøksdyr «av Experimental Animal Center of Fudan University, Shanghai, PRC.
Detaljer fra studien godkjent av etisk komité
Animal kvalifisering sertifikat nr .: SCXK hu (Shanghai) 2009-0019
Study godkjenning .: Fudan University Experimental forsøksdyr~~POS=TRUNC, godkjenning nr SYXK hu (Shanghai) 2009-0082
Oppkalt review board: leder: Prof. Yi-Zhun Zhu Dean, Farmasøytisk Fudan universitet. Nestleder: Prof. Weiyue Lu, professor Wei Wu, professor Xun Sun, Prof. Wenjiang Zhou
Medlemmer: Professor Zhang Yun yi, professor Li Cong, prof. Jiang Chen, professor Yin Geng li, Prof. Hong mei ji, professor Li Xu yang
Sekretær:. Tao Lin Lin
Kjemi
SPRC ble syntetisert ved å reagere L-cystein med propargylbromid. Produktet ble renset ved omkrystallisering fra etanol-vann. Det endelige produktet ble bekreftet ved 1H kjernemagnetisk resonansspektroskopi. SAC ble kjøpt fra Tokyo Kasei (Tokyo, Japan). Paclitaxel liposome var en gave fra Luye Pharma Group Ltd, Singapore. Propargylglycine (PAG) ble kjøpt fra Yinzheng Chemical CO., LTD (Shanghai, Kina). MTT (dimetyl tiazolyl tetrazoliumbromid) ble kjøpt fra AMRESCO Inc. USA. Hoechst flekker, Cellesyklus og apoptose analysesett ble kjøpt fra Beyotime, Kina. RPMI 1640 medium ble kjøpt fra GIBCO ™ Invitrogen, USA. Kanin polyklonale antistoffer mot Bax, P53 og BCL2 ble kjøpt fra Cell Signaling, USA og geitepolyklonalt antistoff til CSE fra Santa Cruz, USA. Super II RT kit og SYBR Grønn PCR Master Mix ble kjøpt fra Takara, Japan. Tunnel farging kit ble kjøpt fra Calbiochem, Tyskland.
Cell linje og kultur
Menneskelig gastrisk karsinom (SGC-7901) celler ble hentet fra Cell Bank of Shanghai Institute for Biological Sciences, Kina og kultivert i RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i kulturflasker ved 37 ° C i fuktig 5% CO
2 inkubator. Cellene ble matet til konfluens og ekspanderes ved trypsinering og sub-dyrket ved lavere tall i nye dyrkningsflasker.
MTT-analysen
MTT (3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl- ) -2, ble 5-difenyltetrazoliumbromid)-målingen ble utført ved hjelp av fremgangsmåten ifølge Arumugam et al. [8] med små modifikasjoner. Kort sagt ble cellene i suspensjonen inneholdende omtrent 8000 til 10.000 celler tilsatt til hver brønn i en 96-brønners dyrkingsplate og inkubert i 24 timer ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2. SPRC, SAC og Paclitaxel liposom ble oppløst i kulturmedium og satt til cellene i 96-brønners plater. 10 sluttkonsentrasjoner på SPRC (1 uM, 10 uM, 100 uM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM og 30 mM), SAC (1 uM og 10 uM) og Paclitaxel liposom (10 uM) ble tilsatt til cellene for å studere deres virkninger på cellelevedyktigheten. Effekten av kombinert behandling med 10 uM SPRC og 10 uM PAG ble også undersøkt. Etter 24 timer, 100 ul av 1 mg /ml MTT-oppløsning ble tilsatt til hver brønn og re-inkubering, etterfulgt i 4 timer. 100 ul DMSO ble deretter tilsatt etter fjerning av MTT-løsning, og platene ble ristet i 10 minutter. Den optiske tetthet av 96-brønners kulturplater ble målt ved anvendelse av en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) leser. De optiske densiteter fra de behandlede brønnene ble omdannet til en prosentandel av levende celler ( «celleoverlevelsesgrad») mot styringen ved hjelp av følgende formel:
kolonidannende analyse
kolonidannende eksperiment var utført i henhold til fremgangsmåten ifølge Wang et al. (1998, 2003) [9], [10]. Den enkeltcellesuspensjon ble fremstilt og dyrket i 12-brønners plater i en tetthet på 150 celler per brønn. Etter 24 timers dyrking, ble 2 konsentrasjoner av SPRC (10 uM, 1 uM) og SAC (10 um, 1 uM) tilsatt. Et eksperiment med kombinert behandling av 10 uM SPRC og 10 um PAG ble også undersøkt. Celler ble inkubert i 6 dager. Cellene ble deretter fiksert i 70% etanol og farget med 1% Giemsa blå. Koloniene som besto av 50 celler ble bedømt og sammenlignet med den normale kontrollgruppe. Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger.
Hoechst farging analysen
apoptose [11], [12] ble bestemt ved hjelp av en Hoechst Farging Kit (Beyotime). SGC-7901-celler ble behandlet med SPRC (10 uM), SAC (10 Um), Paclitaxel liposom (10 uM) og kombinert SPRC og PAG (hver 10 uM) i 24 timer. Cellene ble skylt to ganger i PBS og deretter fiksert i 10 minutter ved 4 ° C og deretter farget ved karyophilic fargestoff, Hoechst 33258, i 5 minutter. Etter en avsluttende skylling i PBS ble cellene montert i moiwol, et anti-fade middel, og visualisert under ultrafiolett lys med et fluorescens mikroskop. Fordi dette fargestoff flekker både apoptotiske og ikke-apoptotiske celler, ble apoptotiske celler identifisert som de viser kromatin kondens og atom fragmentering.
Flowcytometrisk analyse av cellesyklus fase distribusjon og deteksjon av apoptose
All cellene ble først sådd ut i en tetthet på 2,5 x 10
5-celler /brønn på 6-brønners plater. Etter inkubering med SPRC, SAC, Paclitaxel liposom og kombinert SPRC og PAG behandling i 24 timer ble cellene fjernet og oppsamlet i flowcytometri-rør og sentrifugert ved 1000 rpm i 5 min for å oppnå en cellepellet.
Apoptose analysen
cellene ble farget med celle apoptose deteksjon Kit (Beyotime) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellepelleten ble vasket to ganger med PBS. 1 x bindingsbuffer ble tilsatt til 1 x 10
6 celler /ml, og PI ble deretter tilsatt i mørket. Etter inkubering i 30 minutter i mørke, ble cellene øyeblikkelig analysert ved hjelp av Cyan strømningscytometer (FACSCalibur BD) og ModFit programvare.
cellesyklusanalyse
cellesyklusanalyse ble utført ved fremgangsmåten ifølge Herman-Antosiewicz et al [13]. I korthet ble cellene inkubert i kulturmedia alene og kulturmedium inneholdende SPRC, SAC og Paclitaxel liposom (10 uM) ved 37 ° C i 24 timer. Cellene ble vasket med kald PBS, fiksert i 70% etanol og lagret ved 4 ° C for påfølgende cellesyklusanalyse. Fikserte celler ble vasket med PBS en gang, deretter resuspendert i 1 ml PI-farging reagens (50 mg /ml propidiumjodid og 1 mg /ml RNAse i 1 ml natriumcitratbuffer, pH 7,4). Prøvene ble inkubert i mørke i 30 min før cellesyklusanalyse. Fordelingen av cellene i cellesyklusen ble målt ved Cyan strømningscytometer (FACSCalibur BD) analysesystem og kvantifisering av cellesyklusfordelingen ble utført ved anvendelse av flersyklus-programvare (ModFit programvare). Prosentandelen av celler i G1, S og G2 fasene ble beregnet.
sårheling assay
Celler ble sådd ut i 6-brønners kulturplater og tillatt å vokse til 90% konfluens. Lignende store sår ble introdusert til monolayer celler ved hjelp av sterile pipettespisser. Såret monolags Cellene ble vasket 3 ganger med PBS for å fjerne cellerester; SPRC og SAC ble deretter tilsatt i to konsentrasjoner (1 um, 10 UM) og paclitaxel liposomer (10 UM). Hastigheten for sårheling ble overvåket og fotografert etter 12 og 24 timer. Den komparative hastigheten for sårheling av behandlede celler mot kontrollen ble beregnet ved anvendelse av følgende formel: (såret bredden av behandlede celler ved 0 time – såret bredde ved 24 timer) /(såret bredde Kontrollceller ved 0 time – såret bredde på 24 timer) × 100.
kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble revers transkribert ved hjelp av en Super II RT kit (Takara, Japan) primet med oligo (dT). Uttrykk for BCL2, Bax og P53 mRNA ble undersøkt ved real-time PCR med trinn en PCR system (Applied Biosystems). 2 ul av revers transkribert cDNA produkt ble tilsatt i en 20 ul reaksjonsblanding inneholdende 10 pl SYBR Premiks EX Taq (2 x), 0,4 ul ROX referanse Dye (50 x), 0,4 uM forover primer og 0,4 uM belønning primer. Syklusbetingelsene var som følger: pre-inkubering ved 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 5 sekunder, annealing og ekstensjon ved 60 ° C i 31 s. Ved fullføring av sykling, ble utført som smelter kurve analyse for å fastslå spesifisiteten av PCR-produktet. Den relative kvantitative verdi ble uttrykt av ΔΔC
T-metoden. Kontroll ble anvendt som referanseprøve og p-aktin ble benyttet som det endogene kontroll. Hvert eksperiment ble utført i duplikat og gjentatt tre ganger. Primersekvensene og forventede produkt størrelse var som følger: Human β-actin: forover, 5′-CGTGGACATCCGCAAAG-3 «og omvendt, 5′-TGGAAGGTGGACAGCGA-3′ (201 bp); human Bax: forover, 5»-ATGCGTCCACCAAGAAGC-3 «og omvendt, 5′-GTCCACGGCGGCAATCA-3′ (95 bp); human BCL2: forover, 5»-AACTGGGGGAGGATTGTG-3 «og omvendt, 5′-AGGTGCCGGTTCAGGTAC-3′ (128 bp); human p53. fremover, 5»-ACCACCATCCACTACAACTA-3 «og omvendt, 5′-AAACACGCACCTCAAAGC-3» (136 bp)
Western blot-analyse
Celler ble platet til retter og behandlet med SPRC (1 um, 10 uM), SAC (1 um, 10 uM) og Paclitaxel liposome (10 uM) i 24 timer. Etter 24 timers behandling ble cellene vasket to ganger med kald PBS. Cellene fra hver prøve ble oppløst i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,1% SDS, 10 mM natrium-deoksycholat, 1 mM fenylmetyl-sulfonylfluoride) og holdt på is i 30 minutter. Cellene lysatene ble sentrifugert ved 10 000 g ved 4 ° C i 10 minutter og supernatanten ble lagret ved -70 ° C inntil analyse. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved Bradford-metoden. 25
mL
protein for hver gruppe blandet med 5
ul
lasting buffer ble separert med 10% SDS-polyacrylamine gel og overført til polyvinylidenfluorid membraner [14]. Membranene ble blokkert i 2 timer i 5% skummet melkepulver i tris-buffer saltoppløsning inneholdende 0,05% Tween 20 (TBST) ved romtemperatur. De resulterende blotter ble deretter analysert med polyklonale CHT (cystation γ-lyase) /CSE Ab (1:500, Santa Cruz, USA), polyklonale BCL-2 Ab (1: 1000, cellesignalisering, USA), polyklonale Bax Ab (1
