Abstract
PIK3CA
oppregulering, forsterkning og mutasjon har vært mye rapportert i eggstokkreft og andre svulster som tyder på at
PIK3CA
er et lovende terapeutisk mål. Men til dags dato mekanismene bak
PIK3CA
regulering og aktivering
in vivo
er fortsatt uklart. Under tumorgenese, kan vert-tumor-interaksjoner spiller en kritisk rolle i å redigere tumoren. Her rapporterer vi en ny mekanisme som svulsten mikromiljøet aktiverer
PIK3CA
onkogen. Vi viser at
PIK3CA
oppregulering skjer i ikke-prolifererende svulst regioner
in vivo
. Vi identifiserte og preget
PIK3CA
5 «oppstrøms transkripsjonen regulatorisk region og bekreftet at
PIK3CA
er transcriptionally regulert gjennom NF-kB veien. Disse resultatene gir en ny mekanisme som svulsten mikromiljøet aktiverer onkogene veier i kreftceller direkte
Citation. Yang N, Huang J, Greshock J, Liang S, Barchetti A, Hasegawa K, et al. (2008) Transkripsjonell Regulering av
PIK3CA
Oncogene av NF-kB i Eggstokkreft mikromiljøet. PLoS ONE tre (3): e1758. doi: 10,1371 /journal.pone.0001758
Academic Redaktør: Edathara Abraham, University of Arkansas, USA
mottatt: 15 januar 2008; Godkjent: 07.02.2008; Publisert: 12 mars 2008
Copyright: © 2008 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NCI P01-CA83638 SPORE i Ovarian Cancer (Career Development Award, LZ); den Ovarian Cancer Research Fund (GC og LZ); Mary Kay Ash Charitable Foundation (LZ) og American Cancer Society (LZ). AG ble støttet delvis av en predoctoral fellesskap fra Hellenic Ministry of Education (Program HERACLITOS, EPEAEK). DK ble delvis støttet av den italienske foreningen for Cancer Research (AIRC)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
phosphatidylinositol-3 «kinase (PI-3-kinase) er et intracellulært transduser med lipid substrat spesifisitet implisert i en rekke kreftassosiert signalbaner som er involvert i tumorcellemetabolisme, overlevelse og proliferasjon [1], [2], [3], [4 ], [5], [6], [7]. Det er rekruttert og aktivert av flere reseptor-tyrosin-kinaser og genererer andre budbringere via fosforylering av membranen inositol lipider på D3-posisjon [3], [8]. PI-3 kinase ble først anerkjent som antatte onkogen på grunn av sin evne til å binde polyoma midtre T-antigen [9], [10]. Molekylær kloning av PI-3-kinaser avslørte en stor og sammensatt familien som inneholder tre klasser av flere underenheter og isoformer [3], [8]. Men hvordan hver subenhet nettopp bidrar til fremdriften og vedlikehold av kreft er i stor grad ukjent [3], [5].
PIK3CA
genet koder for den katalytiske subenhet P110-alfa, en av de tre katalytiske subenhet proteiner i klasse IA PI-3-kinaser som vanligvis aktiveres av vekstfaktor reseptor tyrosin kinaser.
PIK3CA
ble identifisert som en avian retrovirus-kodet onkogen som forvandler kylling embryo fibroblaster [11]. Tallrike nyere studier tyder på at
PIK3CA Hotell og nedstrøms trasé er ofte målrettet av genomisk forsterkning, mutasjon eller overekspresjon i solide tumorer inkludert eggstokkreft [12], [13], [14], [15], [16] , [17], [18], [19], [20]. Tidligere studier på funksjonen til
PIK3CA
har hovedsakelig fokusert på regulatoriske kretser innenfor kreftcelle.
In vitro
,
PIK3CA
spiller en avgjørende rolle i celle overlevelse og spredning [1], [2], [3], [4], [5], [7]. Men til dags dato er det fortsatt ukjent om
PIK3CA
foruts ulike roller avhengig av staten og /eller i hvilken sammenheng tumorcellen er funnet. Videre er det fortsatt uklart hvordan slike roller
PIK3CA
kan bli påvirket av svulsten miljøet.
Dynamiske samspillet mellom genetisk deregulering i tumorceller og reaktive molekylære og celleforandringer i vertsceller fyller svulsten mikromiljøet spille en avgjørende rolle i å fremme malign transformasjon og tumorprogresjon og vekst [21], [22]. Etter oppkjøpet av kritiske genetiske endringer, er kreftceller utsettes for metabolsk /iskemisk stress og redigere den omkringliggende mikromiljøet. I sin tur, vertsceller som tjener til å redigere tumor, fremme valg av tumorceller som har nytte av svulstens mikro påvirkninger. Medfødte og ervervede immunresponsmekanismer mot svulster som kulminerte i betennelsen har fått betydelig oppmerksomhet i denne sammenheng, som betennelse har vist seg å fremme kreft vekst og progresjon [23], [24], [25]. Tumorassosierte leukocytter produsere mange proangiogenic faktorer som fremmer tumor vaskularisering [26], [27], [28], [29]. Videre nukleær faktor kappa-B (NF-kB), en kritisk transcriptional regulator av inflammasjon, har vist seg å spille en viktig rolle i inflammasjon drevet karsinogenese og for å fremme tumorvekst og progresjon [25], [30], [31 ], [32], [33], [34], [35]. Det har således vært postulert at den kontinuerlige og dynamisk krysstale mellom tumorceller og vertsceller som sikrer overlevelsen av tumorceller og oppretttumorvekst [21], [22]. De gjensidige effektene av tumor-vert interaksjoner har blitt karakterisert med hensyn til angiogenese. Men hvordan tumor-vert interaksjoner påvirke direkte kreftceller forblir delvis ubestemt.
ovarialcancer (EOC), den vanligste eggstokkreft malignitet, fortsetter å være den ledende dødsårsaken blant gynekologiske kreftformer [36]. Mangelen på forebyggende strategier, tidlig diagnostikk og effektiv behandling for å behandle tilbakevend ovarietumorer skaper et stort behov for å forstå dens patogenesen og for å identifisere molekylære mål for både diagnostisering og behandling av EOC på ulike stadium av sykdomsprogresjon [20], [37] , [38], [39], [40], [41]. I denne studien undersøkte vi uttrykket av
PIK3CA in vivo Hotell og sitt forhold til svulsten mikromiljøet i menneskelig eggstokkreft. Identifisering og karakterisering av
PIK3CA
5 «transkripsjonen regulatorisk region (TRR) sammen med funksjonelle valideringsforsøk bekreftet at
PIK3CA
er transcriptionally regulert av mikromiljøet, gjennom betennelse og NF-kB. Disse resultatene gir en ny mekanisme som svulsten mikromiljøet aktiverer direkte onkogene trasé i tumorceller og fremmer tumorvekst.
Materialer og metoder
Pasienter og Prøvene
Prøvene brukes i denne studien ble samlet ved University of Pennsylvania og Universitetet i Torino, Italia [42]. Vev ble oppnådd etter under en generell vev samling protokoll godkjent av institusjonens Institutional Review Board (IRB) ved University of Pennsylvania og University of Turin pasienter skriftlig samtykke. Alle tumorer var fra primære områder, og ble oppsamlet på tidspunktet for kirurgi debulking fra tidligere ubehandlede pasienter med stadium III og IV eggstokkreft. Prøvene ble hurtigfrosset umiddelbart og lagret ved -80 ° C. Prøvene ble samlet under lokal Institutional Review Board godkjenning og behandlet i henhold til prosedyrer godkjent av HIPAA loven.
Cell Kultur
Cellene ble dyrket i DMEM medium (Invitrogen, Carlsbad, California) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen). I noen eksperimenter celler ble inkubert i media beriket med rekombinant humant TNF-α (50 eller 100 ng /ml, BD Bioscience, San Jose, CA) for ulike tider som angitt.
Total RNA Isolation og kvantitativ Real- time RT-PCR
Total RNA ble isolert fra 100 til 500 mg av fryst vev eller 1 × 10
6 dyrkede celler med TRIzol reagens (Invitrogen). Etter behandling med RNase-fri DNase (Invitrogen), total RNA ble revers-transkribert ved hjelp av Superscript First-Strand Synthesis Kit for RT-PCR (Invitrogen) under betingelser som er definert av leverandøren. cDNA ble kvantifisert ved real-time PCR på ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Menneskelig
PIK3CA
frem primer: TCA AAG GAT TGG GCA CTT TT, og omvendt primer: GCC TCG ACT TGC CTA TTC AG. PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn PCR kjerne reagenser (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. PCR-amplifisering av husholdningsgenet GAPDH ble utført for hver prøve som kontrollprøve for lasting og for å tillate normalisering mellom prøvene. En standardkurve ble konstruert med PCR-II-TOPO kloningsvektor (Invitrogen) inneholdende det samme innsatte fragmentet og amplifisert ved sanntids-PCR.
Tissue Microarray
vev microarray ble konstruert som beskrevet tidligere [43], [44]. I korte trekk, ble svulster i parafin og 5-mikrometer snitt ble farget med hematoksylin-eosin å velge representative områder for biopsier. Fire kjerne vevsbiopsier ble oppnådd fra hver prøve. Tilstedeværelsen av svulstvev på kledd prøvene ble bekreftet på hematoksylin-eosin farget delen.
Immunohistochemistry (IHC) og bildeanalyse
IHC ble utført ved hjelp av Vectastain ABC Kit som beskrevet av produsenten (Vector, Burlingame, CA). Vi brukte følgende primære antistoffer (alt fra BD Pharmingen mindre annet er angitt): kanin anti-human Ki67 (1:200, DAKO, Carpinteria, CA); kanin anti-humant cytokeratin (1:200, DAKO); kanin anti-human p65 (1:400, Santa Cruz, Santa Cruz, CA); mus anti-human p110α (1:250 eller 1:50); rotte-anti-mus CD31 (1:200); mus anti-human HIF1Α (1:200); mus anti-human c-Jun (1:200); rotte-anti-mus CD11b (1:200). Antistoffer ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C. Immunoreaksjonen ble visualisert med 3,3′-diaminobenzidin (Vector). Dobbelt immunofluorescerende farging ble utført som tidligere beskrevet [45]. I korthet snitt ble sekvensielt inkubert i 5% normalt serum; primære antistoffer i 2 timer; og fluoriserende merkede sekundære antistoff (Vector) i 30 minutter. Seksjoner ble kontra med DAPI før de blir inspisert under fluorescerende mikroskop. Bilder ble samlet inn gjennom Cool SNAP Pro farge digitalt kamera (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) og farging indeksen ble analysert ved hjelp av Image-Pro Plus 4.1 programvare (Media Cybernetics).
TUNEL analysen
den ApopTag peroksidase in situ deteksjon kit (Intergen) ble brukt til å visualisere apoptotiske celler
in vivo Hotell og
in vitro
. Prosedyren ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, ble tumorvevet seksjoner fiksert med 1% paraformaldehyd i PBS, etterfulgt av kald etanol og eddiksyre etter fiksering. Etter inkubering med rester av digoxigenin nukleotid og terminal deoksynukleotid-transferase i én time ved 37 ° C, ble celler inkubert med FITC-merket anti-digoksigenin antistoff.
Plasmider
mus
PIK3CA
cDNA ble sjenerøst gitt av Dr. Roberts (Harvard University). Pattedyr uttrykk plasmid pcDNA3 var fra Invitrogen. For å konstruere luciferase reporter plasmider, 5’TRRs av det humane og mus
PIK3CA
ble amplifisert fra BAC eller genomisk DNA ved bruk av Expand High Fidelity PCR System (Roche, Indianapolis, IN) og satt inn oppstrøms for luciferasegenet i pGL3 -Grunnleggende vektor (Promega, Madison, WI). Sekvenser av 5’TRR i alle disse reporter konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
5 «Rapid Forsterkning av cDNA Ends (5’RACE)
Total RNA ble ekstrahert med RNeasy Mini RNA kit (Qiagen, Valencia, CA) og 5′-RACE systemet (Invitrogen) ble anvendt. 5′-RACE-PCR-produkt ble satt inn i TA-kloningssystemet (Invitrogen).
Plasmid Transfeksjon
Cellene ble utsådd i 6-brønners plater ved 3 x 10
5-celler /brønn og dyrket over natten til ~40% samløpet før transfeksjon. Alle plasmider ble transfektert med FuGENE6 transfeksjon reagens (Roche) etter produsentens anvisninger. For å velge neomycin-resistente celler, ble 400 ug /ml neomycin (Invitrogen) anvendt. For shRNA eksperimenter ble celler transfektert med siRNA uttrykker pLTsuppressor1.0. In vitro studier indikerer at undertrykkelse av
PIK3CA
mRNA vedvarte i opptil 30 dager. Alle transfeksjon eksperimenter ble utført i tre eksemplarer og gjentas minst to ganger med forskjellig DNA-isolater.
luciferaserapportørplasmid Analyse
Celler ble sådd i 6-brønners plater på 3 × 105 celler /brønn og dyrket over natten 40% konfluens før transfeksjon. For å teste aktiviteten av promoteren
PIK3CA
, totalt 0,5 ug reporter-konstruksjonen og 0,01 ug PRL-TK intern kontroll (Promega) ble anvendt for hver transfeksjon. Alle transfeksjon forsøk ble utført i triplikat og gjentatt minst to ganger med forskjellige DNA-isolater. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble utført luciferase analyse på Luminoskan Ascent (Thermo Labsystems, Waltham, MA) med Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. For kotransfeksjonseksperimenter, 1 mikrogram av hver pCMV-IκBα eller pCMV-IκBαM plasmid (Clonetech, Mountain View, CA) ble brukt.
Elektro Mobility Skift Assay (EMSA)
Nuclear ekstrakt fra celler ble fremstilt ved bruk NE-PER Kjerne- og cytoplasmatiske Utvinning reagenser pluss Halt proteasehemmer Cocktail Kit (Pierce, Rockford, IL) i henhold til produsentens protokoller og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Rekombinant NFkB (p50) ble bestilt fra Promega. 5′-Biotin-merket DNA oligonukleotidene inneholder villtypehumant
PIK3CA
NFkB bindingssetet (GACGTGGGGGATTTTTCGCGTA), mutert menneske
PIK3CA
NFkB bindingssetet (GACGTGGGCGATTTTTCGCGTA), scramble menneskelig
PIK3CA
NFkB bindingssetet (TCAGATAGACGAGACTTGAGTC), villtype-styre NFkB bindingssetet (AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG) [35], mutert kontroll NFkB bindingssetet (AGTTGAGGCGACTTTCCCAGG) ble syntetisert og de to komplementære oligonukleotider ble sammensmeltet for å oppnå den dobbelt-trådet probe. EMSA ble utført ved hjelp LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Pierce). De kjerneekstrakt (eller p50) og 30 fmol av merket probe ble inkubert i 10 x bindingsbuffer pluss 1 ug poly (di-dC) i 20 ul reaksjonssystemet ved romtemperatur i 20 min. Hele 20 ul bindingsreaksjonsblandingen ble applisert på en 7,5% polyakrylamidgel og kjørt ved romtemperatur i 0,25 x TBE ved 110 V i 1-1,5 timer. Den elektroforese bindingsReaksjonsBlandingen ble deretter overført til Bright-Plus positivt ladet nylonmembran (Ambion, Austin, TX) i Trans-Blot SD halvtørr elektroforetisk overføring Cell (Bio-Rad, Hercules, CA) ved 15 V i 30 minutter og kryss -bundne i UV Stratalinker 1800 (Stratagene, La Jolla, CA) ved autokryssbinde nivå i 1 min. Påvisning av Biotin-merket DNA probe ble utført strengt å følge produsentens protokoll.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip)
ChIP analyse for å påvise p65 bindende for den menneskelige
PIK3CA
promoteren utføres ved hjelp av Upstate ChIP analysen kit (Upstate, Charlottesville, VA) etter produsentens anvisninger. Skåret DNA ble inkubert ved 4 ° C over natten med 2 ug immunoutfelling kanin-polyklonalt IgG antistoff til p65 (Santa Cruz) eller 2 ug normal kanin IgG-kontroll. Inngang og kromatin-immunopresipitert DNA ble anvendt som PCR-templat for påvisning av p65 binding til promotoren (med primerne 5′-GCACCAAGACACTACCTTGAATC-3 «og 5′-CTCTGCAGTCCTTTGACTCACTT-3′) eller på GAPDH-promotoren (med primerne 5»-GACACCATGGGGAAGGTGAA -3 «og 5′-GAGTAGGGACCTCCTGTTTC-3») ved hjelp av PCR Core-kit (Roche).
Bioinformatikk
Et søk etter potensielle transkripsjonsfaktor bindingsseter på menneske og mus
PIK3CA
5’TRRs ble utført ved hjelp av programmet Mat Inspector V2.2 på https://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html [46].
statistikker
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS statistikk programvarepakken (SPSS). Alle resultater ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD og p 0,05 ble brukt for betydningen
Resultater
PIK3CA
er oppregulert i ikke-prolifererende regioner i eggstokkreft
for å avdekke romlige aspektene av
PIK3CA
regulering i tumor
in vivo
, vi først undersøkte uttrykk for p110α i menneskelige eggstokkreft prøver. Interessant, sterk p110α ekspresjon ble påvist i hovedsak i grupper av ikke-formerende, Ki67- tumorceller (figur 1 A til C). I disse cellene ble p110α translokert til cellemembranen (figur 1C). I motsetning til dette, Ki67 + regioner oppviste lav ekspresjon av p110α, som var hovedsakelig lokalisert i cytoplasma, mens bare noen få Ki67 + celler oppviste p110α på cellemembranen (figur 1 B). En vev microarray ble anvendt for å ytterligere bekrefte dette resultatet i human ovarian cancer. I 18 av 30 (60%) svulster, sterk p110α uttrykk (og membran lokalisering) ble påvist hovedsakelig i Ki67- tumor regioner, mens i de andre svulster sterk membran p110α uttrykk var enten påvist både i både Ki67- og Ki67 + kreftceller (5 /30, 16,7%); hovedsakelig i Ki67 + tumorceller (3 /30,10.0%); eller det var umulig å oppdage. (4/30; 13,3%)
A til C. Double farging av p110α (grønn, FITC) og Ki67 (rød, Texas Rødt) i menneskelig eggstokkreft B. høy forstørrelse av et regionen fra A med lav uttrykk for p110α. p110α blir uttrykt ved lave nivåer, og lokaliserer til cytoplasma av Ki67-positive tumorceller. C. Høy forstørrelse av en region fra A med høy uttrykk for p110α. p110α blir uttrykt ved høye nivåer, og lokaliserer til plasmamembranen i Ki67-negative tumorceller. D og E. Immunhistokjemisk lokalisering av Ki67 muliggjør entydig identifisering av områder med voksende og områder av ikke-prolifererende tumorceller
in vivo
i 2008 eggstokkene xenografttumorer. E. høy forstørrelse av området fra D viser grensen mellom et prolifererende og et ikke-formerende region. F H. sterkt uttrykk og cellemembranen lokalisering av p110α er bare funnet i Ki67-negative områder. F. avsnitt som grenser til D, farget med antistoff mot humant p110α (1: 250 fortynning). G. høy forstørrelse av området fra F viser grensen mellom prolifererende og ikke-formerende region. H. høy forstørrelse av området fra G viser membran lokalisering av p110α i den ikke-prolifererende region. I. Farging av menneskelig cytokeratin identifiserer kreftceller i prolifererende og ikke-prolifererende områder i 2008 xenograft modell. Linjen sporer grensen mellom de to områdene, som definert av Ki67 flekker i tilstøtende del (se J). Både prolifererende og ikke-prolifererende regionene er positive for humant cytokeratin (FITC, grønn), noe som indikerer tumorceller. Cellekjerner ble kontra med DAPI. J til L. Double p110α og Ki67 farging kart
PIK3CA
aktivering i prolifererende eller ikke-prolifererende områder i 2008 xenografttumorer. J. Ki67 (rød, Texas Red) og p110α (FITC, grønn) utviser gjensidig uttrykk. K og L. høy forstørrelse av voksende region (I) og ikke-prolifererende region (H) fra J.
For ytterligere å bekrefte dette resultatet, undersøkte vi xenografttumorer generert med 2008 eggstokkreft cellelinjen . Fordelen med denne modellen er at forskjellige områder av prolifererende og hviler tumorceller klart kan identifiseres
in vivo
av Ki67 farging (figur 1 D og E) [47]. På samme måte som den resiproke ekspresjon observert i humane prøver, ble sterk p110α ekspresjon detektert i tumorceller bare i Ki67-, ikke-formerende områder (figur 1 F til H). I disse områdene ble p110α hovedsakelig lokalisert til cellemembranen (figur 1 H). Dobbelt flekker bekreftet at områdene uttrykker p110α ble faktisk befolket av tumorceller, som uttrykte cytokeratin, en epitelial tumor markør (figur 1 jeg til K). Med økt primær antistoffkonsentrasjon (fra 1:200 til 01:50), kan svak p110α uttrykk også påvises i Ki67 + regioner, men p110α lokalisert diffust til cytoplasma i disse områdene (figur 2). Dermed onkogen
PIK3CA
er betydelig oppregulert i ikke-prolifererende regioner i menneskelig eggstokkreft
in vivo
. Disse ikke-prolifererende regioner mangler alltid blodåre støtte og inneholder mange nekrotiske /apoptotiske celler samt rik lymfocytter infiltrere (figur 3).
A. Immunhistokjemisk farging av p110α ved hjelp av høy primær antistoffkonsentrasjon (01:50) viser lav ekspresjon av p110α diffust i cytoplasma av tumorceller i Ki67-positive (Ki67 +) regioner. B og C. høy forstørrelse av ikke-formerende (B) og (C) formerende områder fra A.
A. Dobbel farging av CD31 (rød, Texas Red) og p110α (grønn, FITC) i 2008 xenograft modell. Sterk p110α farging er hovedsakelig påvist i tumor regioner som ligger fjernt fra kapillærer. B. Triple farging av p110α (rød, Texas Red), Ki67 (blå, AMCA) og TUNEL (grønn, FITC) i 2008 xenograft modell.
Identifisering og karakterisering av menneskelige og murine
PIK3CA
arrangører
for bedre å forstå reguleringssignalene bidrar til oppregulering av
PIK3CA
i kreft, 5 «oppstrøms regulatoriske sekvenser av den menneskelige
PIK3CA
genet var identifisert. 5′-rask amplifikasjon av cDNA-ende (5’RACE) ble anvendt for å identifisere transkripsjons-startsetet (TSS) humant
PIK3CA plakater (figur 4A og B). Et 125 bp segment av det 5′-ikke-translaterte region (UTR) og 2,3 kbp av TRR av human
PIK3CA
ble klonet fra human bakterielt kunstig kromosom (BAC, klon nummer: PR11-245C23). Vi fant at den 5 «oppstrøms regulatorisk område av human
PIK3CA
ligger omtrent 50 kbp oppstrøms for oversettelse startkodon området (figur 4A). Denne regionen er meget rik på GC (figur 4B). Kartlegging RT-PCR ytterligere bekreftet TSS på
PIK3CA
, og en liten skjøting variant ble identifisert (figur 4C til E). Den murine
PIK3CA
5 «oppstrøms regulatorisk sekvens ble også klonet ved den samme metode, og ble funnet å være 63,6% identitet med det humane sekvens (figur 5) og for å inkludere et lite intron.
A. Illustrasjon av strukturen av menneskelig
PIK3CA
genet og dens 5 «oppstrøms regulatoriske regionen. B. En region svært rik på GC er funnet i
PIK3CA
5’TRR. C. Illustrasjon av primere som brukes for kartlegging RT-PCR av
PIK3CA
transkripsjonen start hotellet (SST). D. Resultater av kartlegging RT-PCR. Det er ingen bånd mellom den fremre primer F1 plassert oppstrøms for den SST og den reverse primer R ligger på exon 1 fra
PIK3CA
. De riktige størrelse bånd kunne påvises mellom primeren F2 eller F3 (begge befinner seg nedstrøms for SST) og revers primer RE En liten spleisevariant er funnet i 5’UTR av human
PIK3CA
gen, som også kan detekteres ved kartlegging RT-PCR (primere F2 og R). F. Oppsummert resultatene av transkripsjonen aktivitet av
PIK3CA
TRR fragmenter.
For å karakterisere transkripsjonen aktivitet av arrangøren regionen, hele 2,3 kbp 5 «TRR videre eller inkrementelt avkortede promotorfragmenter ble subklonet sammen med en 316 eller en 150 bp region transkripsjon inn i det PGL-basisvektor for å avsløre reporter luciferase-ekspresjon (figur 4F). Sterk transkripsjonen aktivitet ble lokalisert til -2340 til -159 bp regionen ved luciferase assay, mens transkripsjonen aktivitet betydelig redusert etter -159 bp (Figur 4F).
Deretter transkripsjonsfaktor bindingsseter ble spådd på menneskelig
PIK3CA
5’TRR
i silico
av GenomatiX (https://www.genomatix.de/index.html). Bindingssteder for en rekke stress assosiert transkripsjonsfaktorer ble funnet, blant annet NF-kB; hypoksi-induserbar faktor (HIF); varmesjokkprotein (HSP); og aktivator protein 1 (AP1) (figur 6). Dermed kan stress-signaler mediert av disse faktorene regulere
PIK3CA
uttrykk i ikke-prolifererende tumorceller i områder med nedsatt vascularization og økt lymfocytt-infiltrerende.
Expression og lokalisering av kandidat transkripsjon faktorer
in situ
uttrykket og lokalisering av tre mulige regulatoriske forhold som fremkom fra de ovennevnte
i silico
analyse, HIF1α; c-Jun, et medlem av AP1 kompleks; og p65 subenheten av NF-kB, ble vist i 2008 xenografter. Fordi funksjon av disse faktorene krever uttrykk og kjernekraft translokasjon, vi vurderte sterkt uttrykk og kjernefysiske lokalisering indirekte bevis for funksjonell aktivering. Sterk kjernekraft HIF1α uttrykk ble sett i usammenhengende cellegruppene i Ki67- regioner. HIF1α protein ble også påvist i Ki67 + regioner, men det hovedsakelig lokalisert til cytoplasmaet (figur 7 A, D og G). c-Jun protein ble strengt uttrykt i grensene mellom Ki67 + og Ki67- regioner, hvor eneste atomvåpen farging ble oppdaget. Få spredte c-Jun-positive celler kan også påvises i Ki67 + regioner, men atom c-Jun ble ikke sett i Ki67- regioner (figur 7 B, E og H). Sterk kjernefysisk lokalisering av NF-kB /p65 protein ble sett i Ki67- regionene og i Ki67 + områder som grenser til de Ki67- regionene (figur 7 C, F og I). Interessant nok var sterkest atom NF-kB /p65 påvist i tilknytning til områder av vevsnekrose (figur 7 F). Denne informasjonen sammen med
PIK3CA
arrangøren analyse tyder på at HIF1α og NF-kB er innblandet i oppregulering av
PIK3CA
i Ki67- regioner
in vivo
. I samsvar med denne hypotesen, har hypoksi /HIF vei blitt rapportert å regulere
PIK3CA
i kreftceller [48]. Siden hypoksisk regulering av
PIK3CA
har blitt bekreftet, vi neste fokusert på reguleringen av
PIK3CA
av NF-kB veien.
A til C. Immunhistokjemisk farging av kandidat transkripsjon faktorer HIF1α, c-Jun og NF-kB i 2008 xenografter. Linjen viser grensen mellom de Ki67 + p110α-lav, og Ki67- p110α-høy regioner. D til F. høy forstørrelse fra A til C, henholdsvis, viser uttrykk og kjernefysiske lokalisering av HIF1Α, c-Jun og NF-kB i 2008 xenografter. G til I. Illustrasjon av lokalisering av kandidaten transkripsjonsfaktorer HIF1α, c-Jun og NF-kB i 2008 xenograft modell. Store prikker representerer cytoplasma lokalisering, mens små prikker representerer kjernefysiske lokalisering. Den linjen representerer grensen mellom Ki67 + p110α-lav, og Ki67- p110α-høy regioner.
NF-kB binder seg til arrangøren og oppregulerer
PIK3CA
uttrykk
i samsvar med en viktig rolle NF-kB i regulering
PIK3CA
, fant vi NF-kB bindingssetet konsensussekvenser i mennesker og mus
PIK3CA
5’TRRs (figur 8A). Den menneskelige promoter NF-kB bindingssete var plassert på -807 til -786 bp. Vi testet om NF-kB regulerer transkripsjonen aktivitet av menneskelig
PIK3CA
arrangøren
in vitro
. NF-kB-aktivering krever frigivelse fra sin inhiberende subenhet IκBα, noe som gjør det mulig for NF-kB translokasjon til kjernen [34], [35]. Forbigående tvang ekspresjon av villtype eller mutant IκBα IκBα (IκBαM), som begge binder NF-kB og blokkere translokasjon til kjernen, dempes den transkripsjonelle aktivitet av
PIK3CA
promoter, slik det er åpenbart av luciferase-assay. Fjerne NF-kB bindingssete fra arrangøren regionen avskaffet hemmende aktivitet av IκBα eller IκBαM (Figur 8 B og C).
A. Illustrasjon av den anslåtte NF-kB bindingssete i menneskelig (øverst) eller murine (nederst)
PIK3CA
promoter-regionen. B. Illustrasjon av konstruksjoner bestående luciferase knyttet til den menneskelige
PIK3CA
promoter med (Luc-2340/316) eller uten NF-kB bindingssete (Luc-378/316). C. Oppsummering av luciferase aktiviteter Luc-2340/316 og Luc-378/316 kotransfektert med pCMV- IκBα eller pCMV- IκBαM. D. Gelshift analyse ved bruk av eggstokk-kreft cellekjerneekstrakt etter TNF-α stimulering. Lane 1, NF-kB bindingssete for villtypehumant
PIK3CA
promoter (wt hu
PIK3CA
NF-kB probe) alene; baner 2 og 3, vekt hu
PIK3CA
NF-kB sonde + kjerneekstrakt; felt 4, tak NF-kB-probe + kjerneekstrakt, kolonnene 5 og 6, mutert hu
PIK3CA
NF-kB-probe + kjerneekstrakt; lane 7, mutert kontroll NF-kB sonde + kjerneekstrakt; baner 8 og 9, rykke hu
PIK3CA
NF-kB sonde + atom ekstrakt. E. Gel shift analyse ved hjelp av rekombinant NF-kB /p50 protein. Lane 1, vekt hu
PIK3CA
NF-kB probe alene; baner 2 og 3, vekt hu
PIK3CA
NF-kB sonde + p50; lane 4, mutert hu
PIK3CA
NF-kB probe alene; baner 5 og 6, mutert hu
PIK3CA
NF-kB sonde + p50; lane 7, kontrollere NF-kB probe alene; baner 8 og 9, kontrollere NF-kB sonde + p50.
spådd NF-kB bindende sekvens i menneske
PIK3CA
promoter ble videre testet ved hjelp av gel shift analysen. Atom proteiner fra 2008 eggstokkreft cellelinje som behandles med TNF-α var i stand til å skifte (bind) oligonukleotid sekvenser som inneholder den antatte NF-kB bindingssete for menneskelig
PIK3CA
arrangøren, men var ikke i stand til å skifte enten mutant eller mock oligonukleotid sekvenser (figur 8 D). I tillegg er rekombinant NF-kB /p50-protein var i stand til å forskyve oligonukleotidsekvenser som inneholder de forutsagte NF-kB-bindingsseter, bekrefter deres tilstedeværelse i den menneskelige
PIK3CA
promoteren (figur 8 E). Til slutt, tilstedeværelse av NF-kB bindingssete i
PIK3CA
promoter ble bekreftet av kromosom immunoprecipitation analysen (chip).
Betennelse kan regulere
PIK3CA
uttrykk via NF- kB pathway
I løpet av tumorvekst, induserer metabolske /iskemisk stresset svulst celledød, rekruttering inflammatoriske celler, inkludert makrofager. Disse utgivelsen proinflammatoriske cytokiner som aktiverer NF-kB vei [25], [33], [34], [35]. Vi kartlagt fordelingen av nekrose, tumor infiltrere makrofager og aktivering av NF-kB i 2008 xenograft modell. Morfologiske nekrose ble påvist hovedsakelig i Ki67- p110α + regioner, ofte ligger i deres midten (Figur 9). Livlig infiltrering av CD11b + makrofager, som produserer pro-betennelses cytokiner slik som TNF-α, ble funnet i sammenheng med områder med nekrose (figur 9 B til D).
A. H E farging av 2008 svulst avslører en fremtredende område av nekrose (N). B og C. Immunohistokjemisk farging av murine CD11b avslører makrofag infiltrere i en 2008 xenograft. CD11b + celler infiltrere svulster i Ki67-negative regioner i nærhet av nekrose. C. Høy forstørrelse fra B. D. Double farging av CD11b (grønn, FITC) og Ki67 (rød, Texas Red) avslører CD11b + makrofager hovedsakelig i ikke-prolifererende Ki67-negative regioner. E. ChIP analyse av NF-kB binding til endogene
PIK3CA
promoter.
