Abstract
De molekylære mekanismene bak chordoma patogenesen er ukjent. Vi har derfor søkt å identifisere nye mutasjoner for å bedre forstå chordoma biologi og til potensielt identifisere terapeutiske mål. Gitt den relativt høye kostnader for hele genomsekvensering, utførte vi en fokusert genetisk analyse ved hjelp av matrise-assistert laser desorpsjon /ionisering-time of flight massespektrometer (Sequenom iPLEX genotyping). Vi testet 865 hotspot mutasjoner i 111 onkogener og valgt tumorsuppressorgener (OncoMap v. 3.0) av 45 mennesker chordoma tumorprøver. Av de analyserte prøvene, syv ble identifisert med minst én mutasjon. Seks av disse var fra ferske frosne prøver, og en var fra en parafininnebygd prøve. Disse observasjonene ble validert ved hjelp av en uavhengig plattform ved hjelp homogen masse forlenge MALDI-TOF (Sequenom HME genotyping). Disse genetiske endringer inkluderer: ALK (A877S), CTNNB1 (T41A), NRAS (Q61R), PIK3CA (E545K), PTEN (R130), CDKN2A (R58 *), og SMARCB1 (R40 *). Denne studien rapporterer om den største omfattende mutasjonsanalyse av chordomas utført hittil. Å fokusere på mutasjoner som har størst sjanse for klinisk relevans, testet vi bare onkogener og tumorsuppressorgener som tidligere har blitt innblandet i tumorigenesis av mer vanlige kreftformer. Vi identifiserte sjeldne genetiske endringer som kan ha funksjonell betydning for den underliggende biologi og mulige behandlingsformer for chordomas. Mutasjoner i CDKN2A og PTEN skjedde i områder med kromosom kopi tap. Når disse dataene er sammenkoblet med studier som viser 18 av 21 chordoma prøvene viser kopi tap på locus for CDKN2A, 17 av 21 chordoma prøvene viser kopi tap på PTEN, og tre av fire chordoma prøvene viser sletting på SMARCB1 locus, kan vi slutte som et tap av heterozygositet på disse tre loci kan spille en betydelig rolle i chordoma patogenesen
Citation. Choy E, MacConaill LE, Cote GM, Le LP, Shen JK, Nielsen GP, et al. (2014) Genotyping Cancer knyttet gener i chordoma Identifiserer Mutasjoner i onkogener og Områder i kromosom tap i CDKN2A, PTEN, og SMARCB1. PLoS ONE 9 (7): e101283. doi: 10,1371 /journal.pone.0101283
Redaktør: Anette Duensing, University of Pittsburgh Cancer Institute, USA
mottatt: 18 oktober 2013; Godkjent: 04.06.2014; Publisert: 01.07.2014
Copyright: © 2014 Choy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet delvis av Jennifer Hunter Yates Foundation, Stephan L. Harris chordoma fondet, Cassandra Moseley Berry sarkom Velsignet Fund, de Gategno og Wechsler Funds, og KL2 Medical Research Investigator Training (fortjeneste) stipen EC gjennom Harvard Catalyst /Harvard klinisk og translasjonell Science Center (National Institutes of Health gi 1KL2RR025757-01), og av økonomiske bidrag fra Harvard University og dets assosierte akademiske helsestasjon. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. EC har mottatt konsulenthonorar fra Amgen, Bayer, NPS, og Pfizer. LG er en konsulent for Novartis og Foundation Medisin og en egenkapitalholder i Foundation Medicine. Men dette betyr ikke endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
chordoma er en aggressiv primær malignitet av det aksiale skjelettet som er antatt å stamme fra notochordal vev [1]. De fleste av disse svulstene forekomme i enten bunnen av hodeskallen (35%) eller i sacrum (50%), og disse er vanligvis administreres med kirurgi og /eller stråling [2] – [10]. Deres kliniske atferd er preget av langsom vekst og en forkjærlighet for å gjenta seg selv kirurgisk reseksjon. De fleste pasienter med residiverende chordoma og nesten alle pasienter med metastaser vil til slutt dø av denne sykdommen [11], [12]. Dessverre er det ingen effektiv systemisk middel til å kontrollere inoperabel eller metastatisk chordoma og utvikling av nye behandlingsmetoder er begrenset av vår dårlig forståelse av sin biologi [12] – [15]
Identifisering av sjåføren mutasjoner i malignitet. , slik som EGFR-mutert lungekreft, c-Kit mutert gastrointestinal stromal tumor og ALK-translokerte svulster, blant andre, har dramatisk endret behandling landskapet for disse sykdommene [15] – [20]. Vi hypotese derfor at det for en typisk kjemoresistent svulst som chordoma hvor det ikke er noen effektiv systemisk behandling, identifikasjon av mutasjoner i gener som det eksisterer en terapeutisk strategi kan informere utvikling av nye legemidler. Men på grunn av sjeldenhet av pasienter med disse svulstene, omfattende molekylær forståelse av chordoma patogenesen er foreløpig ufullstendig.
karyotype studier observert chordomas med tap på kromosom 1p og 3p og gevinster som involverer kromosomer 7q, 20, 5q, og 12q [21], [22]. Mobley et al. identifisert en kohort av dårlig differensierte chordomas som mangler SMARCB1 /INI1 uttrykk [23]. Cytogenetisk evaluering ved hjelp av FISH viste at 3 av de 4 prøvene hadde sletting på dette locus. Gensekvensering viste ingen punktmutasjoner. Nylig, Le et al. utføres komparativ genomisk hybridisering på 21 chordoma tumorprøver for å vise hyppig tap av kromosomale regioner 9p21 og 10q23.3 [24]. De har også genotypet for 56 punktmutasjoner som forekommer i 13 gener som vanligvis forbindes med kreft, inkludert CDKN2A (ligger i 9p21) og PTEN (ligger i 10q23.3), men ikke identifisere noen endringer i sin årsklasse. Vi søkte å utvide på disse observasjonene ved å analysere 45 chordoma prøver via høy gjennomstrømning genotyping av kreft-assosiert gener som er kjent for å spille en viktig rolle i kreft.
Metoder
Etikk erklæringen
Institutional Review board godkjenning ble innhentet for å retrospektivt studere disse tumorprøver fra human-komiteen Partners Research, 116 Huntington Avenue, Suite 1002, Boston, MA 02116. protokollen nummeret~~POS=HEADCOMP er 2007P-002464. The Institutional Review Board fravikes behovet til å samtykke. Vevsprøver ble innhentet fra de kliniske arkiver Dr. Francis Hornicek (Department of Orthopaedic Surgery, Massachusetts General Hospital) og Massachusetts General Hospital Tissue Repository (https://www.massgeneral.org/cancer/research/resourcelab.aspx?id = 31).
chordoma tumorprøver
vevsprøver ble innhentet fra de kliniske arkiver Dr. Francis Hornicek (Department of Orthopaedic Surgery, Massachusetts General Hospital) og Massachusetts General Hospital Tissue Repository ( https://www.massgeneral.org/cancer/research/resourcelab.aspx?id=31).
Utvinning av Genomisk DNA
Utvinning av DNA fra chordoma tumorvev og cellelinjer var utføres ved å bruke QIAamp DNA Micro kit (Qiagen) som tidligere beskrevet i tidligere publikasjoner [25]. Den ekstraksjon ble utført i henhold til produsentens anvisninger. DNA ble bevart ved -20 ° C inntil bruk.
Valg av kreft genmutasjoner og OncoMap v3 analysen Design
Valg av kreft genmutasjoner for analysen design og massespektrometrisk genotyping ble utført som tidligere beskrevet [25] – [27]. Flere databaser, herunder Sanger Institute COSMIC database, PubMed, og The Cancer Genome Atlas (TCGA), ble spørres for kjente somatiske onkogen og tumor suppressor genmutasjoner. Mutasjoner ble rangert i betydning av frekvens i kreft og på tvers av kreft subtyper, og gener med eksisterende terapeutiske modifikatorer ble fortrinnsvis valgt.
Grunning for PCR forsterkning og utvidelse probe ble utformet ved hjelp Sequenom MassARRAY analysen Design 3,0 og den resulterende DNA sekvenser ble (1) spørres i dbSNP databasen for å unngå innlemmelse av SNP i løpet av analysedesign, (2) bekreftet gjennom et BLAST-aktig innrettingsverktøy (BLAT) og modifisert når det er nødvendig for å unngå pseudogen amplifikasjon [28], og (3) syntetisert umodifisert bruker standard rensing (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA).
massespektrometrisk Genotyping
Primere og prober ble samlet og deretter godkjent for kontroll DNA avledet fra CEPH panel av menneskelig HapMap DNA ( Coriell Institute), samt et panel av humane cellelinjer med kjent mutasjonsstatus, som tidligere beskrevet [26]. Genomisk DNA ble kvantifisert ved hjelp Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, California), utsatt for hel-genom forsterkning (WGA) ved hjelp av Qiagen Repli-g kit, og en post-WGA opprydding trinn ble gjennomført ved hjelp av en Nucleofast Rensing Kit (MACHEREY-NAGEL). Massespektrometrisk genotyping hjelp iPLEX kjemi ble utført som tidligere publisert [27].
Kandidat mutasjoner ble ytterligere filtrert ved manuell gjennomgang og valgt for bekreftelse ved hjelp av multi-basen forlengelse homogen masse-Extend (HME) kjemi med kompleksdannelse på ≤ 6 analyser per basseng. Betingelser for å HME validering var i overensstemmelse med de metoder som er beskrevet av MacConaill et al. 2009 [27].
Array Comparative Genomisk Hybridisering (CGH) Analyse
Array CGH hjelp av Agilent 4x180k CGH + SNP mikromatriser (Santa Clara, CA) ble tidligere beskrevet [24]. Kopier nummer aberrasjon samtaler ble gjort med et minimum regional absolutt gjennomsnittlig log base 2 ratio på 0,25 og minimum sammenhengende sonde teller til 5. Alle matrisedata ble anmeldt for subtile endringer manuelt.
Resultater
Egenskaper for klinisk tumorprøver
totalt 45 DNA-prøver ble hentet fra 40 pasienter som hadde gjennomgått operative resections av deres chordoma. Pasient dato for kirurgi (DOS), alder, kjønn, tumor beliggenhet, tilbakefall og metastasering er katalogisert i tabell 1. 28 prøver ble innhentet fra Dypfryst vev, og 17 ble avledet fra FFPE- blokker.
genotype og CGH analyse
Eksempler på massespektrometri avlesninger er vist i Figur 1. Mutasjons resultatene er katalogisert sammen pasientkarakteristika i tabell 1. de identifiserte mutasjoner er: ALK (A877S), CTNNB1 (T41A) også kjent som β-catenin, NRAS (Q61R), PIK3CA (E545K), PTEN (R130), CDKN2A (R58 *), og SMARCB1 (R40 *).
PCR produktene varierer i masse avhengig av om sonden forlengelse detekterer en cytosin (C) eller thymin (T). Figuren til høyre viser masse spec tomt på et allel i SMARCB1 viser en topp på både C og T. Det venstre panelet viser at de fleste prøvene testet var homozygot med C, og 2 prøver var heterozygote.
Blant de 28 ferske frosne prøvene testet, ble 6 mutasjoner identifisert. Av de 17 FFPE- prøvene testet, var bare en mutasjon (i ALK) identifisert. I likhet med våre tidligere rapporterte tallene for å påvise tilsvarende frekvens av mutasjoner mellom ferskt frosset og parafin innebygd osteosarkom tumorprøver [25], det syntes å være noen forskjell i forekomsten av mutasjoner i prøver som ble ferskt frosset i forhold til prøver av FFPE forberedt (Fishers eksakte test, p = 0,22 to haler). To prøver (prøver # 7 og 8 i tabell 1), hentet fra samme pasient på ulike anatomiske steder og kirurgiske datoer, hadde hvert de samme mutasjonene i både SMARCB1 og CDKN2A. Når vi utført CGH analyse på prøver med CDKN2A og PTEN mutasjoner, observerte vi kopitall tap på respektive loci (figur 2), som viser at disse mutasjonene skjedde i regioner av kromosom tap.
X-aksen tiltak beliggenhet langs kromosom 9 (panel A) eller 10 (panel B). Y-aksen måler relativ sonde telle. A: aCGH viser heterozyogous kopi tap på CDKN2A; B:. ACGH viser heterozyogous kopi tap på PTEN
Diskusjoner
Chordomas har tidligere blitt beskrevet å ha kromosomavvik og er preget av kromosom gevinster og tap på ulike regioner over hele genomet [ ,,,0],21], [22], [24], [29]. En omfattende genom-wide undersøkelse for høyrente mutasjoner har ennå ikke blitt utført over en stor samling av chordomas. Array sammen genomisk hybridisering (aCGH) ble anvendt for å analysere 21 chordoma tumorprøver [14] og det observert store kopitall tap som involverer kromosomer 1P, 3, 4, 9, 10, 13, 14, og 18 [24]. I den studien, gjorde en fokusert analyse av 11 kreftrelaterte gener avdekket ingen nye mutasjoner i DNA-sekvensen. Diaz et al. utført en hel-genom enkeltnukleotidpolymorfi microarray analyse av 21 clival chordoma prøver å bekrefte CGH funn av andre at kromosom 3 Aneuploidy og kromosom 9p sletting skjer (riktignok sjeldnere enn i sakrale chordomas) [29].
med dagens teknologi, er hel-genomsekvensering av store samlinger av chordomas kostbart og arbeidskrevende. Derfor ønsket vi å utvide vår mutasjons skjermen mens fokus bare på de genetiske endringer som tidligere har blitt brukt som tumorigenisis sjåfører i andre tumortyper med det overordnede mål om å identifisere nye mutasjoner som kan lede videre forskning på chordoma terapeutisk oppdagelse. Noen av mutasjonene som er identifisert i denne studien er i genene kjente for sin rolle som tumor suppressors som PTEN og CDKN2A. Interessant, begge disse genene ligge i kromosomale regioner som ofte ble funnet å ha kopi nummer tap i den siste CGH rekke analyse (9p21 for CDKN2A og 10q23.3 for PTEN) med en hastighet på 80% for hver. Derfor utførte vi CGH i prøvene som inneholder mutasjoner i PTEN og CDKN2A og funnet kromosom tap på hvert loci i de respektive prøvene. Interessant, 33% av prøvene testet i Le et al. Samlingen fant fullstendig tap av både kopier av CDKN2A – og hevder at enten en punktmutasjon i CDKN2A eller komplett kopi tap av CDKN2A kan føre til LOH på dette locus [24]. Vi antyde derfor at tap av heterozygositet (LOH) på disse loci kan potensielt være tumorigent begivenhet for utviklingen av chordoma.
SMARCB1 er en underenhet av ATP-avhengige kromatin remodeling kompleks SWI /SNF, en kraftig epigenetisk tumor suppressor, som direkte motvirker den histone metyltransferase EZH2. Mutasjoner i SWI /SNF medlemmer blir i økende grad anerkjent i maligniteter hvor de er nå antatt av enkelte grupper til å være mer vanlig enn å inaktivere mutasjoner i p53 [30], [31]. SMARCB1 også regulerer cellesyklusen ved å aktivere CDKN2A, og dens tap fører til oppregulering av EZH2 et molekyl som blir angrepet av flere inhibitorer som for tiden gjennomgår klinisk testing [32] – [34]. SMARCB1 er kjent for å bli forstyrret i maligne rhabdoid svulster, runde celle bløtdels sarkomer (de fleste var en undergruppe av svulster som ligner extraskeletal myxoid chondrosarcoma med rhabdoid funksjoner, epiteloide sarkomer og schwannomatosis [34] -. [38]
Disse svulstene, som chordomas, er grupper av sjeldne svulster som ingen effektiv behandling er kjent. Mobley et al. observerte at i dårlig differensierte chordomas, uttrykk for SMARCB1 er også mangler. de brukte FISH å evaluere SMARCB1 locus på kromosom 22q og funnet sletting i 3 av 4 prøver [38]. Vi vil derfor også antyde at når SMARCB1 mutasjoner sammenfallende i områder med kromosom tap, kan tap av heterozygositet også være tumorigent hendelse.
Flere av mutasjoner funnet i vår studie , slik som ALK, PIK3CA, og CTNNB1, som hver har inhibitorer som er enten kommersielt tilgjengelige, for eksempel ALK-inhibitoren XALKORI (crizotinib), eller har flere inhibitorer som er under aktiv klinisk utvikling [39] -. [44] Observasjoner som vår foreslår den kliniske nytten av å utføre en genotype rettet klinisk studie for å teste nye kinase hemmere i denne sykdommen befolkningen.
i konklusjonen, observerte vi chordomas med punktmutasjoner i tumorsuppressorgener i områder med hyppige kromosom tap og i onkogener med kommersielt tilgjengelige hemmere. Den tidligere antyder mulige mekanismer for chordoma tumorgenese, det sistnevnte antyder muligheter for nye behandlingsformer. Videre studier må gjøres for å etablere disse genene som viktige biomarkører eller mål i chordoma. Det ideelle Studien vil være en fullstendig genomsekvense innsats som involverer mange flere chordoma prøver. Vi håper at denne første tegn på vellykket genotyping i den største samlingen av menneskelige chordoma tumorprøver hittil kan antennes entusiasme til videre undersøkelser i den molekylære patologi av denne sykdommen som i dag ikke har noen effektiv medisinsk behandling.
