Abstract
I vår forrige undersøkelse, mikrovesikler (MV) løslatt fra
menneskelige
Wharton gelé mesenchymale stamceller (HWJ-MSC) forsinke veksten av blæren kreftceller. Vi vil gjerne vite om MV har en lignende effekt på
menneskelige
nyrecellekarsinom (RCC). Ved anvendelse av cellekultur og BALB /c nu /nu
mus
xeno-transplantat modell, påvirkning av MV ved vekst og aggressivitet RCC (786-0) ble vurdert. Celletelling kit-8 (CCK-8) analyse, forekomst av svulst, tumor størrelse, Ki-67 eller
TUNEL
farging ble brukt til å evaluere tumorcellevekst
in vitro
eller
in vivo
. Flowcytometri analyse (
in vitro
) eller undersøkelse av cyclin D1 uttrykk (
in vivo
) ble utført for å bestemme endring av cellesyklusen. Aggressiviteten ble analysert ved
Wound Healing analysen product: (
in vitro
) eller MMP-2 og MMP-9 uttrykk (
in vivo
). AKT /p-AKT, ERK1 /2 /p-ERK1 /2 eller HGF /c-MET uttrykk ble oppdaget av real-time PCR eller western blot. Våre data viser at MV fremme vekst og aggressivitet RCC både
in vitro Hotell og
in vivo
. I tillegg MV lettes progresjonen av cellesyklusen fra G
0/1 til S. HGF-ekspresjon i RCC var sterkt indusert av MV, assosiert med aktivering av AKT og ERK1 /to signalveier. RNase forbehandling avskaffet alle effektene av MV. I sammendraget, induksjon av HGF syntese via RNA overført av MV aktive AKT og ERK1 /2 signalisering er en av viktige bidragsytere til den pro-tumor effekt
Citation. Du T, Ju G, Wu S, Cheng Z Cheng J, Zou X, et al. (2014) mikrovesikler avledet fra humant Wharton Jelly stamceller fremme menneske Nedsatt kreft celle vekst og Aggressivitet gjennom Induksjon av hepatocytter Growth Factor. PLoS ONE 9 (5): e96836. doi: 10,1371 /journal.pone.0096836
Redaktør: Giovanni Camussi, Universitetet i Torino, Italia
mottatt: 26 januar 2014; Godkjent: 11 april 2014; Publisert: 05.05.2014
Copyright: © 2014 Du et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien er støttet med tilskudd fra Research Program of Science and Technology Commission av Shanghai kommune (10411967200) og Shanghai Song-Jiang Health Bureau (2011PD06) og Natural Science Foundation National of China (81170642) og Shanghai Shen Kang Plat-skjema Grant (SHDC12007206) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Selv om forfatterne mottatt støtte fra Shanghai Song-Jiang Health Bureau, dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
evnen til MSC til hjem til områder av svulster har inspirert etterforskning av disse cellene som potensielle anti-svulst verktøy [ ,,,0],1], [2]. Imidlertid har det vært debatt om hvorvidt MSC utøve anti-tumor effekt før nå. I ganske mange av studiene, MSC gjøre fremme utviklingen av svulster. Det er blitt dokumentert at MSC-er ikke bare involvert i dannelsen av tumor-mikromiljøet, men kommuniserer med cancerceller for å fremme deres vekst og metastase [3] – [5]. Den eksakte virkningsmekanismen er fortsatt uklart. Immunosuppressiv virkning [6], [7], trans-differensiering mot retning av mesenchymale celler [8], [9], så vel som forskjellige bioaktive faktorer utskilt fra MSC [10] er blitt foreslått å være potensielle effektorer.
Det har blitt anerkjent nylig at MV løslatt fra MSC er en avgjørende effektor av sine handlinger. MV er blitt beskrevet som en ny vei for intercellulær kommunikasjon som kan omprogrammere målceller ved å levere funksjonell mRNA og sekvenser mikroRNA [11], [12]. Som MSC er en rik kilde til MVS det tenkes at de spiller en sentral rolle i stamcelle biologiske effekt [13]. Forstå rollen MV i formidling av svulst celle atferd og funksjon kan hjelpe til ytterligere å avsløre den eksakte mekanismene som ligger til grunn MSC pro- eller anti-tumor effekt.
I vår forrige undersøkelse, MV avledet fra HWJ-MSC svekket vekst av blæretumorcelle (T24) til nedregulering av AKT-aktivering og oppregulering av spaltet Caspase-3 [14]. RCC er en annen vanlig urologiske tumor. Vi hadde en stor interesse for påvirkning av MV på sin vekst og aggressivitet.
Menneskelige
nyrecellekreft 786-0 celler ble brukt i denne studien. I motsetning til T24, 786-0 celler uttrykker både HGF og c-MET, som representerer en kreft tidlig stamcelle markør [15]. Derfor er mye oppmerksomhet til effekten av MV på HGF /c-MET signalveien.
in vivo Hotell og
in vitro
bevis indikerer at MV løslatt av HWJ-MSC favorisere vekst og aggressivitet av RCC. Ytterligere innsikt er gitt i mekanismene bak denne effekten. Dataene viser at induksjonen av HGF-ekspresjon i RCC via RNA informasjon overføres ved hjelp av MV er en av viktige bidragsytere til aktivering av AKT og ERK1 /2 signalveier som bidrar til pro-tumoreffekt av MV. Mediet betinget av HWJ-MSC har vist seg å indusere innfødte og utenlandske HGF syntese i skadet tubulære celler [16]. I en fersk studie fant vi at
menneskelige
HGF mRNA til stede i MV avledet fra HWJ-MSC er levert inn
rotte
rørformede celler utsatt for hypoksi /re-oksygenering og er oversatt til proteinet . Vi tror at levering av
menneskelige
HGF mRNA til
menneskelige
tumorceller kan være en av virkningsmekanismer.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
i denne studien, all forskning som omfatter mennesker deltakere ble godkjent av Institutional Review board av den kinesiske Academy of Medical Science and Medical School of Shanghai Jiao Tong University. Menneskelige individer i denne studien ga skriftlig informert samtykke til å delta i forskning og tillate oss å publisere tilfelle detaljer. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i Shanghai Jiao Tong University. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Shanghai Jiao Tong University. Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Cell kultur
Dette eksperimentet ble godkjent av forskningsetiske komité ved Shanghai Jiao Tong University Affiliated First Folkets sykehus . HWJ-MSC ble isolert og propagert som beskrevet tidligere [17].
Menneske
RCC linjen (786-0) (Shanghai Institute for Biological Sciences, Shanghai, Kina) var dyrket i RPMI-1640 (Gibco) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco).
Isolering og karakterisering av MVS
MV utgitt av HWJ-MSC ble isolert og karakterisert som tidligere beskrevet [14]. For fremstilling av MV, HWJ-MSC ble dyrket i lav glukose DMEM fratatt FBS og supplert med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) over natten. Supernatantene ble oppsamlet og sentrifugert ved 2000 g i 20 min for å fjerne rusk. Den celle-frie supernatanter ble ultra sentrifugert ved 100 000 g (Beckman Coulter Optima L-80K ultrasentrifuge, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) i 1 time ved 4 ° C. Supernatantene ble forlatt og de isolerte MV ble suspendert med M199 (Sigma-Aldrich) inneholdende 25 mM HEPES (pH 7,4) og underkastet en andre ultrasentrifugering under de samme betingelser. MV ble resuspendert i serumfritt M199. Proteininnholdet i MV ble kvantifisert ved
Bradford metode
mens
Limulus test
ble ansatt for å utelukke endotoksin forurensing av MV. RNA ekstrahert fra MV ved bruk av TRIZOL-reagens ble analysert ved hjelp av spektrofotometer. Strømningscytometrisk analyse av MV viste tilstedeværelse av CD9, CD29, CD44, CD63, CD73 og CD105, men ikke CD34 og CD45 (data ikke vist). De fremstilte MV ble lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
Transmisjonselektronmikros
Suspensjonen ble fiksert med 2,5% glutaraldehyd i PBS i 2 timer. Etter skylling, ble MV ultrasentrifugeres og suspendert i 100 ul PBS. En 20 pl dråpe av MV ble fylt på en formvar /karbon-belagt gitter, negativt farget med 3% vandig fosforwolframsyre i 1 min og observert ved transmisjonselektronmikroskopi (Hitachi, H-7650, Tokyo, Japan). Størrelsen av de isolerte MV varierte fra 30 nm til 500 nm.
MV forbehandlet med RNase
Del av isolerte MV ble behandlet med 100 ug /ml RNase (Fermentas, Burlington, ON , Canada) i 3 timer ved 37 ° C og reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av RNase-inhibitor (Fermentas). Etter ultrasentrifugering ved 100 000 g i 1 time ved 4 ° C, ble MV opphengt i M199 og deretter lagret ved -80 ° C inntil bruk (RNase-MV). Spektrofotometrisk analyse viste at de fleste av RNA ekstrahert fra MV ved bruk av TRIZOL-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ble nedbrutt av RNase-behandling (MV: 1,8 ± 0,3 ug RNA /mg protein; RNase-MV: mindre enn 0,15 mikrogram RNA /mg protein).
Animal modell
Atten BALB /c nu /nu mus på 4-6 wk år gammel (Laboratory Animal Center of Shanghai, Academy of Science, Shanghai, Kina) ble tilfeldig delt inn i 3 grupper (n = 6 for hver gruppe). Alle mus som mottok subkutan injeksjon av 1 x 10
7 786-0 celler med tillegg av MV (200 pg /ml protein) (en mengde av MV utgitt av ca. 1 x 10
6 HWJ-MSC over natten), RNase-MVS eller M199 (kontroll). Dyrene ble overvåket hver 3. dag. Tiden punktet av tumor forekomst ble registrert. Tumorvekst ble evaluert ved tumorvolum, som ble beregnet ved den modifiserte ellipsoide formelen: V = 1/2 (lengde x bredde) [18]. Lengden og bredden av tumormasse ble målt med skyvelære.
CCK-8 analysen
CCK-8 (Beyotime Institutt for bioteknologi, Jiangsu, Kina) ble benyttet for å bestemme
in vitro
veksten av kreftceller. 786-0 celler ble sådd i 96-brønners plater (2000cells /brønn) og inkubert i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C. Etter 24 timer inkubering ble cellene vasket med PBS, og deretter ko-dyrket med MV (200 pg /ml protein), RNase-mVs i M199 og M199 (kontroll) i 24 eller 48 timer. Cellene ble vasket to ganger med PBS og inkubert i 100 ul RPMI-1640 (Gibco) inneholdende 10 ul CCK-8-reagens til en annen 3 timer. Absorbansen for hver brønn ved 450 nm ble spektrofotometrisk-metrisk målt ved anvendelse av en mikroplate ELISA-avleser (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Kultur medium (RPMI-1640) uten celler ble brukt som blank kontroll.
Analyse av cellesyklus og Wound Healing analysen
786-0 celler (5 × 10
4) ble inkubert med MV (200 ug /ml) eller RNase-mVs i M199 og M199 (kontroll) i 48 timer. Etter behandling med trypsin, ble cellene oppsamlet og vasket to ganger med PBS, deretter fiksert i 70% iskald etanol i 24 timer. De fikserte celler ble merket med 50 ug /ml propidiumjodid (PI) (Sigma) i PBS inneholdende 0,1% Triton X-100 (Sigma) og 50 ug /ml RNase (Sigma), og deretter analysert for G
0 /G
1, G
2 /M og S-fasen renten med et FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson FACS Calibur, Franklin Lake, NJ, USA).
Wound Healing analysen
ble også utført for å vurdere celle migrasjon. 786-0 celler (5 × 10
4) ble sådd i 6-brønners plater i frisk RPMI-1640 media (Gibco) for 12 timer av startkultur, og deretter fortsatte å kultur for en annen 12 og 24 timer med tillegg av MVS eller RNase-MV i M199 eller M199 (kontroll). De grunnleggende trinnene innebærer å skape en «sår» i en celle monolag, ta bildene i begynnelsen og på slutten under cellemigrasjon til å lukke såret. Såret ble opprettet av manuelt skraping cellen monolayer med en P200 pipette tips. Arealet av de sårede regionen mangler celler ble registrert for evaluering.
Real time PCR
Total RNA ble isolert fra celle eller tumorprøver ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og deretter ble omvendt transkribert med Moloney murine leukemia virus (M-MLV) reverstranskriptase Kit (Promega, Madison, WI, USA) og Oligo dT primere (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for 60 min ved 42 ° C. Real-time PCR ble utført av TaqMan genuttrykk analyser (Applied Bio-Systems, Foster City, CA, USA) for påvisning av genekspresjon av HGF, MMP-2, MMP-9 eller β-aktin ved hjelp av følgende primere:
HGF
: 5’CTCTGGTTCCCCTTCAATAG, 3’GATAGCCCCATTTCTGGATGTC;
MMP-2
: 5’CCCATTTTGATGACGATGA, 3’CAAGTTACCGTTCCTCATGTT;
MMP-9
: 5’CGAACTTTGACAGCGACAAGA, 3’GATACCAGGAGCGGGACTT;
β-aktin
: 5’AAGGTGACAGCAGTCGGTT, 3’GGAGAGGGTTCAGGTGTGT;
kvantifisering av målgenet ble normalisert ved β-aktin, en intern kontroll-genet. Den Ct for målgenet og β-actin ble bestemt for hver prøve. De eksperimentelle prøver ble uttrykt som en n-ganger forskjell i forhold til kontrollgruppen (M199-behandlede celler eller tumorprøver). Den relative ekspresjon av mRNA-ekspresjon ble beregnet ved 2
-ΔΔCT. Tre paralleller av hver prøve ble utført.
Western blot-analyse
Proteinekstrakter (30 ug per bane) ble underkastet elektroforese og deretter overført til polyvinylidenfluorid membran. Immuno-blotting ble utført ved å inkubere hver membran med en anti-HGF (fortynning: 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), c-MET (fortynning: 1:250; Abcam, Cambridge, UK), AKT (fortynning: 1 :1000; Abcam, Cambridge, UK), p-AKT (fortynning: 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), ERK1 /2 (fortynning: 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), p-ERK1 /2 ( fortynning: 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), MMP-2 (fortynning: 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), MMP-9 (fortynning: 1:500; Abcam, Cambridge, UK), cyclin D1 ( fortynning: 1:250; Abcam, Cambridge, UK) eller β-aktin natten ved 4 ° C. Etter å ha blitt vasket i PBS, ble hver membran inkubert i 1 time med et sekundært antistoff konjugert med peroksydase ved romtemperatur. Bandet ble utviklet ved bruk av forbedret kjemi-luminescens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Tettheten av hvert band ble bestemt. Resultatene ble gjentatt to ganger for å bekrefte reproduserbarheten
Immunhistokjemi
I korthet, ble platene inkubert med antistoff mot human HGF (fortynning: 1:100; Abcam, Cambridge, UK) eller ki-. 67 (fortynning: 1:200; Abcam, Cambridge, UK) etterfulgt av en HPR-konjugert sekundært antistoff ved bruk av DAB som substrat. Negativ kontroll ble utført ved å erstatte primære antistoffer med en ikke-immune immunoglobulin av det samme iso-type. Kjerner ble kontra med Harris hematoxylin. Celle apoptose ble bestemt ved en terminal transferase-mediert dUTP nick-ende merking (TUNEL) analyse ved bruk av en
in situ celledød Detection Kit plakater (Roche, Mannheim, Tyskland). Alle deler ble vurdert av en lege blindet for dette eksperimentet.
Utfyllende eksperimenter
Thirty BALB /c nu /nu mus på 4-6 wk år gammel ble tilfeldig subkutant inokulert med 1 × 10
7 786-0 celler med tilsetning av kondisjonert medium (CM) fra HWJ-MSC, MV isolert fra CM eller kontrollmedium (M199 eller lav-glukose DMEM). Dyrene ble overvåket hver 3. dag. Tiden-punktet av tumor forekomst og tumorstørrelse ble notert.
In vitro
, 786-0 celler ble sådd i 96-brønners plater (2000 celler /brønn) og inkubert i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C. Etter 24 timer inkubering ble cellene vasket med PBS, og deretter ko-dyrket med CM, MV isolert fra CM eller kontrollmedium i 24 eller 48 timer. CCK-8 analysen ble utført for å bestemme cellevekst.
I en annen supplerende eksperiment, 786-0 celler (5 × 10
4) ble sådd i 6-brønners plater i frisk RPMI-1640 media (Gibco ) i 12 timer etter første kultur og ble deretter inkubert med MV (200 pg /ml protein), MV med tilsetning av PF2341066 (Pfizer, 6 uM), PF2341066 eller kontrollmedium i 48 timer. Totale proteiner i celler ble isolert for western blot analyse av p-AKT og p-ERK1 /2. Effekten av ulike behandlinger på cellevekst ble også vurdert av CCK-8 analysen.
Statistisk analyse
Data er rapportert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av
SPSS v19.0.
Statistiske forskjellen mellom data midler ble bestemt av to-tailed
Student t test
og
variansanalyse plakater (ANOVA) som passende. En verdi på
P 0,05
ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
MV lette vekst og migrasjon av 786-0 celler in vitro
den CCK-8-analysen viste at MV sterkt fremme proliferasjon av 786-0 celler etter 48 timers inkubasjon, mens RNase forbehandling avskaffet denne effekten (fig. 1A). Analyse av cellesyklusen viste også at 786-0 celler behandlet med MV overveiende akkumulert i S-fasen i forhold til G
0 /G
1 fase i RNase-MV eller kontrollgruppen (Fig. 1B og 1C). Basert på disse resultatene, mener vi at MV lette utviklingen av cellesyklus, og dermed akselerere spredning av RCC. I tillegg ble
Wound Healing analysen
ansatt for å vurdere muligheten for celle migrasjon. Data indikerte at MV fremtredende forbedre celle migrasjon (Fig. 1 D).
(A) CCK-8 analysen. Etter 48-0 celler, MV sterkt fremmet cellevekst, mens forbehandling med RNase avskaffet denne effekten. Cellene som var inkubert med M199 ble betraktet som kontrollen. *
P
0,01, MV vs. kontroll;
#
P
0,05, RNase-MV vs. MV; (B) (C) cellesyklusanalyse. 786-0 celler behandlet med MV primært akkumulert i S-fasen i forhold til G
0 /G
1 fase i RNase-MV eller kontrollgruppe. *
P
0,05, MV vs. kontroll;
#
P
0,05, RNase-MV vs. MV; (D)
Wound Healing analysen
. Migrasjonen evne 786-0 celler ble betydelig forsterket av MV.
MV akselerere utvikling og progresjon av inokulert svulster
I nærvær av MVS ble tumornoduler dannet i noen mus så tidlig som 6d etter inokulering med 786-0 celler (fig. 2B). Ved 18d, tumor forekomsten nådd 100% (fig. 2B). I motsetning til dette var det ingen dannelse av tumorknuter i mus behandlet med kontroll medium til 12d etter inokulering (fig. 2B). Den endelige svulst Forekomsten var bare 75% (Fig. 2B). I tillegg, tumorvekst under induksjon av MV var raskere enn det indusert av RNase-MV eller kjøretøy som angitt ved måling av tumorstørrelse (fig. 2A og 2C). Videre ble mer Ki-67-positive og færre tunel-positive tumorceller oppdaget på tumorsnitt fra mus som fikk behandling med MV (Fig. 2D). Av interesse, cyklin D1 protein ekspresjon i tumorvev var markert oppregulert etter MV (fig. 3A og 3B). Cyklin D1, som en kritisk mediator, er involvert i overgangen av cellesyklus fra G
1 til S-fasen. Derfor vil økning av Cyclin D1 ekspresjon letter cellesyklusprogresjon. Ekspresjonen av MMP-2 og MMP-9 er brukt til å vurdere evnen til tumor aggressivitet. Ved hjelp av RT-PCR og western blot, har vi funnet at MV føre til en betydelig oppregulering av deres gene og protein ekspresjon (Fig. 3A-3C). Alle disse bevisene viser at MV fremme svulst utvikling og progresjon, i samråd med resultatene av
in vitro
eksperiment.
(A) Nude mus inokulert med 786-0 celler. 786-0 celler blandet med MVS eller RNase-MV i M199 eller M199 (kontroll) ble inokulert subkutant i naken mus ofret på 36d følgende inokulasjon; (B) Tumor forekomst. Det var en høyere svulst forekomst i nakne mus behandlet med MV sammenlignet med RNase-MVS eller kontroll; (C) Tumor volum. I motsetning til RNase-MV eller kontroll, MV førte til utviklingen av en større tumor i nakne mus. *
P
0,05, MV vs. RNase-MVS eller kontroll; (D) Ki-67 og TUNEL-farging. I nærvær av MVS var det flere Ki-67-positive flekker celler og færre celler farging positiv for TUNEL på kreft seksjoner.
(A) (B) Gel fotografi og densito-metrisk analyse av cyklin D1, MMP-2 og MMP-9 proteinekspresjon. MV førte til en betydelig oppregulering av cyclin D1, MMP-2 og MMP-9-protein-ekspresjon i tumorvevet. RNase forbehandling destrueres disse effektene. Tettheten av hvert band ble bestemt. Verdiene i diagrammet er uttrykt som densitometri forhold av cylin D1 /β-aktin, MMP-2 /β-aktin eller MMP-9 /β-aktin som brettes over kontroll (prikket linje). Data ble oppnådd fra 3 dyr for hvert eksperiment. *
P
0,05, MV vs. kontroll;
#
P
0,05, RNase-MV vs. MV; (C) Gene ekspresjon av MMP-2 og MMP-9. Genet ekspresjon av MMP-2 eller MMP-9 var markert opp-regulert av MV. Den Ct (terskel syklus) for hvert gen ble bestemt for hver prøve. Kvantifiseringen av MMP-2 eller MMP-9 ble normalisert ved β-aktin. Genuttrykket i kontrollgruppen ble ansett som den kalibrator (stiplet linje) sikret relative uttrykk av målet genet ble beregnet ved 2
-ΔΔCt. *
P
0,05, MV vs. kontroll;
#
P
. 0,05, RNase-MV vs. MV
Aktivering av AKT og ERK1 /2 signalisering i inokulert svulster er utløst av MV
i lys av den nære tilknytning av AKT og ERK1 /2-signalering med overlevelse, vekst og vandring av RCC [19], [20], også fastslått at det er endring av disse to signale fremkalt ved MV i
in vivo
eksperimentell innstilling. Western blot analyse viste at, MV førte til en sterk økning i fosforylering nivået av AKT i inokulert tumorer i motsetning til RNase-MV eller kontroll (Fig. 4A og 4B). MV forårsaket også en forholdsvis svakere, men signifikant økning av p-ERK1 /2-nivå (fig. 4A og 4B).
(A) (B) Gel fotografi og densito-metrisk analyse av fra AKT, p-AKT , ERK1 /2 og p-EREK1 /2 protein-ekspresjon i inokulerte tumorer. MV førte til en betydelig fosforylering av svulst AKT og ERK1 /2 proteiner. Tettheten av hvert band ble bestemt. Verdiene i diagrammet er uttrykt som densitometri forhold mellom p-AKT /β-aktin, p-ERK1 /2 /β-aktin, p-AKT /AKT eller p-ERK1 /2 /ERK1 /2 som brettes over kontroll (prikket linje ). *
P
0,05, MV vs. kontroll;
#
P
0,05, RNase-MV vs. MV
MV indusere HGF uttrykk i RCC enten in vitro eller in vivo
It. er dokumentert at HGF /c-MET er involvert i kreftcelleformering og invasjon [21], [22]. I tillegg over- eller mis-uttrykk for HGF og c-MET korrelerer ofte med dårlig prognose og metastasering av menneskelig RCC [23] – [26]. HGF /c-MET signalering kan også føre til aktivering av både AKT og ERK1 /2-signalering. Derfor har vi gjort ytterligere gransking av virkningen av MV på HGF /c-MET uttrykk i RCC.
Etter 48 timers inkubasjon med MVS HGF protein uttrykk i 786-0 celler ble betydelig oppregulert som demonstrert ved western blot-analyse, mens c-MET uttrykk ikke gjennomgå en slik endring (fig. 5A og 5B). Et lignende resultat ble oppnådd ved undersøkelse av HGF mRNA-ekspresjon (fig. 5C). Den induktive effekten av MV på HGF er også bekreftet i
in vivo
eksperimentell setting. I nærvær av MV, var det en markert intensivering av HGF flekker på tumorsnitt (fig. 5D). Western blot-analyse avslørte også at tilsetning av MV førte til en markert økning av HGF protein ekspresjon i tumorvev (fig. 5E-5F). Som
in vitro
, c-MET protein uttrykk i inokulerte svulster ikke bli påvirket av MV (Fig. 5E-5F). Forbehandling med RNase Sprak frustrert endringene i HGF uttrykk enten
in vivo
eller
in vitro
, noe som tyder på den avgjørende rollen RNA informasjon levert av MV i HGF induksjon. Siden HGF induksjon er parallelt med aktivering av AKT og ERK1 /2, kan MV utløse aktivering av ERK og AKT 1/2 via HGF induksjon, i det minste delvis.
(A) (B) Gel fotografi og densitometrisk analyse av HGF og c-MET protein uttrykk i 786-0 celler. Ved 48 h etter tilsetning av MV, HGF protein ekspresjon i celler som var 786-0 fremtredende oppregulert mens c-MET ekspresjon gikk ingen signifikant endring. Forbehandling med RNase destruert effekten av MV. Tettheten av hvert band ble bestemt. Verdiene i diagrammet er uttrykt som densitometry prosenter av HGF /β-aktin eller c-MET /β-actin som brettes over kontroll (stiplet linje). *
P
0,05, MV vs. kontroll;
#
P
0,05, RNase-MV vs. MV; (C) HGF genekspresjon i celler 786-0. Etter 48 timers inkubering med 786-0 celler, MV i det vesentlige indusert oppregulering av HGF genekspresjon, frustrert av RNase-behandling. Den Ct (terskel syklus) for hvert gen ble bestemt for hver prøve. Kvantifisering av HGF ble normalisert ved β-aktin. HGF uttrykk i kontrollgruppen ble ansett som den kalibrator (stiplet linje). Den relative ekspresjon av målgenet ble beregnet ved 2
-ΔΔCt. *
P
0,05, MV vs. kontroll;
#
P
0,05, RNase-MV vs. MV; (D) HGF flekker på tumorsnitt. Det var en betydelig intensivering av HGF flekker på tumorsnitt i innstillingen av MV sammenlignet med RNase-MVS eller kontroll; (E) (F) Gel fotografi og densitometrisk analyse av HGF og c-MET-protein-ekspresjon i tumorvevet. MV sterkt indusert HGF protein uttrykk i tumorvev. Som
in vitro
, forbehandling med RNase avskaffet den induktive effekt. *
P
0,05, MV vs. kontroll;
#
P
. 0,05, RNase-MV vs. MV
In vitro
, opphever c-Met hemmer aktiveringen av AKT og ERK1 /2 signalisering i 786-0 celler og cellevekst indusert av MV
Som
in vivo
, MV førte til en markert aktivering av AKT og ERK1 /2 signalisering i 786-0 celler etter 48 timers inkubasjon (fig. 6A og 6B). For verifikasjon av foreningen av HGF induksjon med aktivering av AKT og ERK1 /2, ble c-Met inhibitor tilsettes for å blokkere HGF /c-Met signalveien. Av interesse, med tillegg av c-Met-hemmer, aktivering av AKT og ERK1 /2 signale indusert av MV var i det vesentlige frustrert (fig. 6A og 6B), noe som indikerer at HGF induksjon er en av kritiske bidragsytere til aktivering av AKT og ERK1 /2 signalering. Videre er c-Met-hemmer signifikant forsinket tumorcellevekst stimuleres av MV som vist ved CCK-8 (Fig. 6C).
(A) (B) Gel fotografi og densitometrisk analyse av p-AKT og p- ERK1 /2 protein uttrykk i 786-0 celler. MV førte til markert fosforylering av AKT og ERK1 /2 proteiner etter 48 timers inkubering med 786-0 celler, avskaffet ved c-Met-hemmer. Tettheten av hvert band ble bestemt. Verdiene i diagrammet er uttrykt som densitometri forhold mellom p-AKT /β-aktin, p-ERK1 /2 /β-aktin som brettes over kontroll (prikket linje). *
P
0,05, MV vs. kontroll;
#
P
0,05, MVS + c-Met hemmer vs. MV;
×
P
0,05, c-Met-hemmer vs. kontroll; (C) CCK-8-analysen. Etter 48 timers inkubering med 786-0 celler, tilsetning av c-Met-hemmer sterkt retardert cellevekst indusert av MV. *
P
0,01, MV vs. kontroll;
#
P
0,05, MVS + c-Met hemmer vs. MV;
×
P
. 0,05, c-Met-hemmer vs. kontroll
Mediet betinget av HWJ-MSC har en lignende pro-tumor effekt som MV både
in vivo Hotell og
in vitro
i motsetning til å kontrollere, den betingede medium (CM) av HWJ-MSC førte til tidligere svulst forekomst og større tumorstørrelse (fig. 7A og 7B). CCK-8-analyse viser også at CM sterkt akselerert vekst av 786-0 celler som
in vivo plakater (Fig. 7C). På bakgrunn av disse resultatene, sørger vi for at MV er en av viktige effektorer av HWJ-MSC. Å utforske virkningsmekanismer av MV kan hjelpe til å avsløre hvordan HWJ-MSC utøve den pro-tumor effekt på RCC.
(A) Tumor forekomst. Det var en stor tumor forekomst hos nakne mus behandlet med CM eller MV sammenlignet med kontroll; (B) Tumor volum. I motsetning til kontroll, CM eller MV førte til utviklingen av en større tumor i nakne mus. *
P
0,05, MV vs. kontroll;
#
P
0,05, CM vs kontroll; (C) CCK-8-analysen. Etter 48 timers inkubasjon med 786-0 celler, CM eller MV sterkt fremmet tumorcellevekst. *
P
0,01, MV vs. kontroll;
#
P
0,01, CM vs. kontroll
Diskusjoner
Funksjonen til MV som nye meglere på celle-til-celle kommunikasjon. har blitt vist i flere studier [27] – [29]. En horisontal overføring av funksjonelle mRNA og mi-RNA via MV er involvert i den genetiske utvekslingen mellom celler [30] – [32]. Den genetiske informasjon som overføres av MV er hoved effektor av funksjonelle og feno-typiske forandringer som forekommer i mottakercellene [27], [30], [33]. I dyremodeller av nyreskade, MV etterligne den fordelaktige effekten av MSC. Følgelig MVS utgitt av MSC kan være en avgjørende bidragsyter til sine pro- eller anti-tumor egenskaper. For å utforske den molekylære endringer i tumorceller utløst av MV gjør favør til avdekking av essensen av MSC «handling.
Enkelte forskere har rapportert at MV stammer fra menneskelige MSC utøve anti-tumor effekt i
i vivo Hotell og
in vitro
eksperimentell innstilling [34], [35]. I vår forrige undersøkelse, MV utgitt av HWJ-MSC også forhindret blære tumor cellevekst. RCC er en annen vanlig urologiske tumor. Vi var veldig nysgjerrig på effekten av MV på denne svulsten. In vitro og in vivo eksperimenter ble utført for å løse dette problemet.
Vi lykkes isolerte MV fra HWJ-MSC «supernatant og preget dem. MV var sammensatt av heterogent lipid bi-lags vesikler som spenner 30-500 nm og uttrykt CD9, CD29, CD44, CD63, CD73 og CD105. MV var rik på RNA (1,8 ± 0,3 mikrogram RNA /mg protein) og RNase forbehandling nesten helt ( 90%). Destrueres RNA innhold
Ved bruk av ulike metoder, har vi gjort klar påvirkning av MV på veksten av RCC.
In vitro
, MV fremme veksten av 786-0 som vist ved CCK-8-analyse. I nærvær av MV, dannelse av RCC tumor var hurtigere mens svulststørrelsen var større. I tillegg var det flere prolifererende tumorceller og færre celler i apoptose på histologisk undersøkelse. Endring av cellesyklusen utløses av MV ble også bestemt. MV resulterte i akkumulering av celler 786-0 hovedsakelig i S-fasen i stedet for G0 /G1 fase.
In vivo
, cyclin D1 protein uttrykk i tumorvev var også sterkt oppregulert. Cyklin D1, som en viktig mediator, er involvert i overgangen av cellesyklus fra G1 til S-fasen [36]. Det er tenkelig at MV fremme RCC vekst ved tilrettelegging av tumorcellesyklusprogresjon. Et lignende fenomen er også observert i enkelte dyremodeller av akutt nyre- eller leverskade. Administrasjon av MV frigjøres fra stamceller induserer en cellesyklus gjeninnføring av skadede epitelceller via aktivering av regenererende programmer [37] -. [40]
På den annen side har vi funnet at MV favorisere RCC invasjon.
