Abstract
Sink finger protein 217 (ZNF217) er viktig for celledeling og har vært innblandet i tumorigenesis. Men dens uttrykk og nøyaktige roller i tykk- og endetarmskreft (CRC) er fortsatt uklart. I denne studien demonstrerte vi at ZNF217 ekspresjon ble abnormt oppregulert i CRC vev og assosiert med dårlig total overlevelse av CRC pasienter. I tillegg fant vi at ZNF217 var en antatt mål av mikroRNA (MIR) -203 bruker bioinformatikk analyse og bekreftet at bruk av luciferase reporter analysen. Videre in vitro knockdown av ZNF217 eller tvungen uttrykk for MIR-203 svekket CRC celleproliferasjon, invasjon og migrasjon. Videre kombinert behandling av ZNF217 siRNA og MIR-203 utstilt synergi hemmende effekter. Til sammen våre resultater gir nye bevis på at ZNF217 har en onkogen rolle i CRC og er regulert av MIR-203, og åpner opp muligheten for ZNF217- og MIR-203-rettet behandling for CRC
Citation.: Li Z, Du L, Dong Z, Yang Y, Zhang X, Wang L, et al. (2015) MiR-203 undertrykker ZNF217 Oppregulering i tykktarmskreft og dens onkogenisitet. PLoS ONE 10 (1): e0116170. doi: 10,1371 /journal.pone.0116170
Academic Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 25 september 2014; Godkjent: 03.12.2014; Publisert: 26 januar 2015
Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. prosjektet ble støttet av China National Natural Science Foundation prosjekter (Grant No. 81072406, 81271916, 31270971 og 81301506), forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning i Kina ( Grant No. 20120131110055), og Shandong-provinsen Natural Science Foundation (Grant No. ZR2010HZ004). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den andre og tredje vanligste ondartet svulst i kvinner og menn, henholdsvis, over hele verden, med over 1,2 millioner nye tilfeller og anslagsvis 608,700 dødsfall i 2008 alene [1]. Til tross for nylige fremskritt i diagnostikk og behandling av CRC, den generelle prognosen for CRC pasienter forblir fattige [2]. Derfor er det et presserende behov for å utvikle nye terapeutiske tilnærminger for CRC. For å oppnå dette, er avgjørende en dypere forståelse av molekylære og genetiske nettverk som styrer initiering og progresjon av CRC.
ZNF217 genet er et onkogen nylig klonet i 20
th. Det finner i kromosomet 20q13.2 og koder en Kruppel lignende transkripsjonsfaktor av sink finger protein familie [3]. ZNF217 protein inneholder 8 spådd Kruppel-lignende C2H2 sink finger motiver og en prolinrikt region [4]. Et økende antall studier har vist at medlemmer av Sink finger-protein familien spiller en viktig rolle i utviklingen av en rekke kreftformer [5]. Mange undersøkelser har vist at kopiantall økning på kromosom 20q13.2 er forbundet med spredning av CRC [6] og ZNF217 er oppregulert i tykktarmskreft målt med laser capture microdis delen og multiplex kvantitativ real-time PCR [7].
microRNAs (mirnas) er ikke-kodende, 18 til 24 nukleotid lange, enkelt-trådet RNA som har evnen til å ha en negativ regulere ekspresjonen av gener som er involvert i en rekke cellulære prosesser, inkludert celle proliferasjon, apoptose, migrasjon, invasjon, og stressrespons [8, 9, 10, 11, 12]. Det har vist seg at unormale mønstre av miRNA uttrykk finnes i mange humane karsinomer [13] og er forbundet med patogenesen, progresjon, og naturlige historie på flere krefttyper [11, 14]. Emerging data tyder på at mirnas kan fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener og spiller avgjørende roller i utviklingen av kreft [15]. En studie presenterer bevis som ZNFs er regulert ved post-transkripsjonsnivået i brystkreft med MIR-181a, som direkte retter seg mot de kodende regioner i ZNFs [4].
I denne studien, ved hjelp av bioinformatikk algoritmer og luciferase reporter analysen fant vi at ZNF217 er et mål på MIR-203, en tumor suppressor miRNA. Å utforske mulige roller ZNF217 som en roman prognostisk biomarkør for CRC og regulering av MIR-203 miRNA i CRC vev og paret normal kolorektal vev, utførte vi in vitro-forsøk og bekreftet at 1) ZNF217 kan fremme spredning, invasjon og migrasjon av CRC-cellelinjer og 2) ZNF217 så vel som dets virkninger i CRC-cellelinjer blir nedregulert ved MIR-203, i håp om å ytterligere belyse mekanismen av CRC utvikling og tilveiebringe nye funn for målrettet behandling av CRC.
Materialer og metoder
Vevsprøver
totalt 82 CRC pasienter som gjennomgikk kirurgisk fjerning av svulster for CRC mellom juli 2004 og mars 2009 ved Institutt for generell kirurgi, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan, Kina, ble rekruttert til studien. Alle pasienter «data ble oppnådd fra kliniske og patologiske materialet, herunder alder, kjønn, tumorstørrelse, differensiering, plassering, invasjon og metastase dybde, så vel som tumor-node-metastase (TNM) trinnet. Den postoperative patologisk iscenesettelse av hvert fag ble bestemt i henhold til den syvende utgaven av Union for International Cancer Control (UICC) tumor-node-metastaser (TNM) staging system for CRC. Den resekterte tumorvev og tilstøtende sammenkoblede ikke-cancervev (minst 5 cm fra tumor margin) ble umiddelbart samlet, frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Ingen pasienter fikk kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Qilu Hospital, Shandong University og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle inkluderte pasienter.
Immunohistochemistry farging og evaluering for ZNF217
Immunohistochemistry (IHC) ble brukt til å oppdage ZNF217 uttrykk i parafininnstøpte CRC vev. Parafininnstøpte HCC vev ble skåret som 5 um seksjoner bakt ved 65 ° C i 2 timer, og deparaffinized anvendelse av standardprosedyrer. Etter antigen gjenfinning og vasking med Tris buffer, ble ZNF217 primært antistoff (Biosyntese Bioteknologi CO, LTD, Beijing Kina) brukes til lysbilder og uttrykk for ZNF217 ble gjennomgått av inkubasjon med en peroksidase-konjugert geit anti-kanin antistoff (Zhongshan Goldenbridge bioteknologi, Beijing , Kina) etter produsentens retningslinjer.
ZNF217 farging ble vurdert under et lysmikroskop av to uavhengige etterforskere som var uvitende om kliniske resultater. Farging ble ansett positiv for ZNF217 når en sterk sammenheng var tydelig i cytoplasma. Vev ble scoret semi-kvantitativt ved å telle positive cytoplasma av 10 separate felt på 400 X forstørrelse i de områdene med høyest tetthet av positive cytoplasma. Den aktuelle stillingen cutoff ble innhentet ved hjelp av analyse av mottakeren opererer karakteristiske (ROC) kurver plottet ved å ta prosenten score av svulst eller tilstøtende ikke-svulstvev som uavhengige variabler. Stillingen nærmest både maksimal sensitivitet og spesifisitet, [dvs. punktet (0.0,1.0) på kurven] ble valgt som cut-off poeng. Prøver med flekker poengsum over eller under poengsum cutoff ble klassifisert som positive eller negative, henholdsvis.
Cell kultur og transfeksjon
CRC cellelinjer (HT-29, SW480, og SW620) og menneskelig embryonale nyre (HEK) 293T cellelinje ble kjøpt fra Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og HCT116 cellelinje ble kjøpt fra Shanghai Institute of Biochemistry og cellebiologi (Kina). Alle cellelinjene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Hyaline, UT, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (Gibco, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en inkubator supplert med 5% CO
2.
Transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) etter produsentens protokoll. En endelig konsentrasjon på 50 nM miRNA, 100 nM (siRNA) og deres respektive negative kontroller ble brukt for hver transfeksjon.
Prediksjon av kandidat miRNAs og luciferase reporter analysen
De to mest utbredte og web -baserte bioinformatiske algoritmer (TargetScan og micrornaorg) ble anvendt til å forutsi kandidat mirnas som målretter nukleotidsekvensen av den 3′-ikke-translaterte region (UTR) av ZNF217 mRNA. For å bekrefte deres effektivitet, ble en luciferase reporter analysen utføres ved hjelp av pmiR-REPORTTM vektorer (RiboBio, Guangzhou, Kina) som inneholder villtype (WT) -ZNF217 3′-UTR sekvens eller mutant (MUT) – ZNF217 3′-UTR sekvens . HEK293T celler ble transient transfektert med Mir-203 etterligner /MIR-negativ kontroll og WT-ZNF217 3′-UTR vektor /MUT ZNF217 3′-UTR. Luciferasepreparater aktiviteter ble målt ved hjelp av Dual-luciferase assay kit (Promega, Madison, WI) 48 timer etter transfeksjon i henhold til produsentens instruksjoner.
Real-time RT-PCR og Western blot
Total RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens protokoll. Alle manipulasjoner av RNA ble utført under RNase-frie betingelser. RNA-konsentrasjonen ble målt ved anvendelse av en BioPhotometer pluss (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) ved 260 nm, og det isolerte RNA ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. For analyse av ZNF217 mRNA-ekspresjon. Totalt 1 mikrogram RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av Supersett (Toyobo, Osaka, Japan) og QRT-PCR-analyser ble utført ved hjelp av SYBR Grønn (Toyobo, Osaka, Japan) og en ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems , Foster City, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. ZNF217 mRNA nivået ble normalisert til p-aktin og fold endringer i ZNF217 mRNA uttrykk ble kvantifisert ved hjelp av to
-ΔΔCT relativ kvantifisering metode. Primerne benyttet for RT-qPCR av ZNF217 var fremover, 5′-ATGTTACTCCTCCTCCGGATG-3 «og omvendt, 5′-ACACTTGGCCTGTATCTCA-3». Alle ovennevnte primere var fra BioSune, Shanghai, Kina.
For Mir-203 uttrykk, ble cDNA syntetisert ved hjelp av gen-spesifikke primere (Ribobio, Guangzhou, Kina) og M-MLV RT kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i en 20 pl reaksjon. RT reaksjons reagenser inneholdt en mikrogram RNA mal, 1 ul 10 mM dNTP mix, 2 mL 0,1 M DTT, 4 pl 5 × første-strand buffer, og en mL 40 U /mL RNase inhibitor. Volumet ble justert med RNA-fri H2O. Den reverstranskripsjonsreaksjon ble utført i triplikat for å fjerne eventuelle utliggere. MiR-203 uttrykk ble vurdert ved hjelp QRT-PCR og en ABI PRISM 7500 Sequence Detection System Folde endringer i miRNA uttrykket ble bestemt ved hjelp av to
-ΔΔCT metoden; uttrykket ble normalisert til U6 liten kjerne RNA ekspresjonsnivå. Primerne benyttet for RT-qPCR av MIR-203 ble MIR-203 fremover 5′-GTGAAATGTTTAGGACCACTAGAA-3 «, U6 fremover 5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′ og den universelle revers primer 5»-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3 «.
Totalt proteiner ble hentet fra dyrkede celler ved hjelp av RIPA buffer som inneholder PMSF og kvantifisert ved hjelp av BCA protein assay kit (Beyotime, Haimen, Kina). Totalt 30 pg proteiner ble underkastet SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Etter blokkering, ble membranen inkubert med mus-anti-ZNF217 monoklonalt antistoff (Abcam, Southampton, UK) eller mus anti-β-aktin monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) etterfulgt av inkubasjon med HRP-konjugert sekundært antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Signaler ble bestemt ved en kjemiluminescens deteksjon kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
celleproliferasjonsanalyse
Celleproliferasjon ble målt med en metyl-thiazolyltetrazolium (MTT) assay. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
3 /brønn i 96-brønners plater. Etter å ha dyrket i 24, 48, 72, 96 og 120 timer ble cellene inkubert med 20 ul MTT (5 mg /ml) i 4 timer ved 37 ° C. De dannede krystallene i cellene ble fordampet ved inkubering med 150 ul dimetylsulfoksyd i 10 minutter ved romtemperatur og kvantifisert ved å måle den optiske tettheten ved 490 nm ved bruk av en enzymbundet immunosorbent assay leser (Tecan, Sveits).
Cell invasjon og migrasjon analysen
de invasive og trekkende potensialer av cellene ble evaluert ved bruk av transwell innsatser med porer av 8 mikrometer (Corning). For invasjon assay, 24 timer etter transfeksjon, 3,0 x 10
5-celler i serumfritt medium ble tilsatt til det øvre innsatsforhåndsbelagt med Matrigel matrise. 500 ul 10% FBS-medium ble tilsatt til det nedre kammer. Etter inkubering i 48 timer, ble ikke-invaderende celler fjernes fra den øvre overflaten av transwell membran med en bomullsdott, og den invaderte celler på den nedre membranoverflate ble fiksert i metanol, farget med 0,1% krystallfiolett, fotografert, og tellet . Cellemigrering Analysen ble utført under anvendelse av lignende prosedyrer med unntak av at 2 x 10
5-celler ble lagt i ikke-belagte innsatser. Celler i seks tilfeldige felt på 200 X forstørrelse for hver innsats ble talt opp. Analysene ble utført i tre eksemplarer.
Statistiske analyser
Student t test ble brukt til å analysere forskjeller i ZNF217 uttrykk mellom svulsten og normalt vev. Sammenhenger mellom ZNF217 uttrykk og clinicopathological funksjoner ble analysert av en parametrisk test: Mann-Whitney U test mellom to grupper og Kruskal-Wallis test for tre eller flere grupper. Den χ2 og Fishers eksakte tester ble utført for å bestemme sammenhengen mellom ZNF217 uttrykk og clinicopathological parametere. Total overlevelse kurven ble beregnet ved Kaplan-Meier metoden og overlevelse forskjeller i undergrupper av pasienter ble sammenlignet med log-rank test. Cox regresjon multivariat analyse ble utført for å estimere de uavhengige prognostiske faktorer for overlevelse prediksjon. Korrelasjonen mellom ZNF217 og MIR-203 ble bestemt av Pearsons korrelasjonsanalyse. Statistiske analyser og graf ble utført ved hjelp av SPSS versjon 17.0, Microsoft Excel og GraphPad Prism programvare. P 0,05 ble betraktet som signifikant forskjell.
Resultater
ZNF217 uttrykk er korrelert med clinicopathological funksjonene CRC
IHC analyse av 82 tilfeller av CRC og deres tilsvarende noncancerous vev viste at positive farging for ZNF217 ble sett i cytoplasma av CRC-celler og tilsvarende ikke-kreft mucosa-celler (fig. 1A). De gjennomsnittlige prosentandeler av celler farget positivt for ZNF217 i kreft og tilsvarende ikke-kreft slimhinne var 76,3% og 38,9%, respektivt. Ved å sammenligne prosentandelen av positive celler, ble det fastslått at ZNF217 ekspresjon i kolorektal karsinom var statistisk høyere enn i det tilstøtende ikke-kreft mucosa (P 0,001 Fig. 1B).
(A-venstre ) cytoplasma farging av ZNF217 i CRC celler. (A-Right) Manglende ZNF217 uttrykk i normale colonic epitelceller. (B) Den prosentandelen av positivt fargede celler i kreft og tilstøtende normale vev (* P 0,05, ** 0,01). (C) Kaplan-Meier analyse av total overlevelse i CRC pasienter i henhold til ZNF217 uttrykk nivå. Den ZNF217 positive gruppen (n = 55) viste signifikant kortere overlevelse sammenlignet med den negative gruppen (n = 27; P = 0,0405: log-rank test).
korrelasjonsanalyse viste at ZNF217 uttrykk var positivt korrelert med tumorstørrelse, dybden av invasjonen, og lymfeknute, (P 0,05), men ikke med pasientens alder, kjønn, histologi klasse, og fjernmetastaser (P 0,05; Tabell 1). Videre Kaplan-Meier testen viste at pasienter med positiv ZNF217 farging hadde kortere overlevelse enn de med negative ZNF217 farging (P = 0,028, Fig. 1C).
Reduksjon av ZNF217 uttrykk undertrykker CRC celleproliferasjon, migrasjon og invasjon
for å måle de biologiske egenskapene til ZNF217 i CRC celler, testet vi spredning og bevegelighet hos CRC celler under forutsetning av siRNA mediert knockdown av ZNF217 genet. Først undersøkte vi ekspresjonsnivået av ZNF217 i et panel av CRC-cellelinjer, blant annet HCT-116, HT-29, SW620 og SW480. Resultatene viste at ZNF217 ekspresjonsnivå var høyest i SW480-celler og det laveste i HT29-celler blant alle testede cellelinjer (Fig. 2A). Basert på dette uttrykket mønster, vi valgt derfor SW480 for videre studier. Vi forbigående modulert ZNF217 uttrykk ved trans siRNA i SW480 celler og fant at siRNA-mediert ZNF217 stanse redusert celleproliferasjon (Fig. 2B) og nedskrevne celle migrasjon og invasjon evner (Fig. 2C). Til sammen våre observasjoner indikerte at ZNF217 kan fremme spredning, migrasjon og invasjon av CRC celler
(B) Reduksjon av ZNF217 uttrykk ved trans siRNA-ZNF217 betydelig hemmet spredning (* P 0,05). Og (C ) migrasjon og invasjon av SW480 celler (200 × forstørrelse, * P 0,05) sammenlignet med foreldre og negative kontroller
ZNF217 var direkte rettet av MIR-203
Bruk. online miRNA mål prediksjon databaser (microrna.org og Targetscan), fant vi at ZNF217 var et potensielt mål av MIR-203 (fig. 3A). For å bekrefte dette funnet, bygget vi luciferase journalister av WT og Mut 3′-UTR av ZNF217 og utført luciferase aktivitetsanalyse i HEK293T celler. Resultatene viste at transfeksjon av MIR-203 etterligner vesentlig hemmet ekspresjon av WT MUT men ikke 3′-UTR av ZNF217 i HEK293T-celler (fig. 3B). I samsvar med disse resultatene, transfeksjon av MIR-203 ligner redusert endogen uttrykk for ZNF217 både mRNA og proteinnivåer i SW480 celler (fig. 3C og 3D). Videre, i den analyserte panel av 30 CRC pasienter, observerte vi en invers korrelasjon mellom ZNF217 og MIR-203-ekspresjon i CRC-vev og deres tilstøtende normale vev (figur 4E, r = 0,792, P . 0,01, Fig. 3E). Samlet utgjør disse dataene sterkt antydet at MIR-203 regulerer negativt ZNF217 uttrykk via direkte rettet mot sin 3′-UTR-sekvens.
(A) den antatte MIR-203 bindende sekvenser i ZNF217 3′-UTR. (B) Luciferase aktivitetsanalyse ble utført for HEK293T celler transfektert med pmiR-REPORTTM vektorer som inneholder WT-ZNF217 3′-UTR eller MUT-ZNF217 3′-UTR sekvenser og Mir-203 etterligner. Data er presentert som normalisert ganger endring i luciferase-aktivitet. (C, D) ZNF217 mRNA og protein ble bestemt i SW480 celler transfektert med Mir-203 etterligner eller MIR-negativ kontroll ved henholdsvis QRT-PCR og Western blot,. (E) Inverse sammenheng mellom ZNF217 mRNA uttrykk og MIR-203 nivåer i CRC vev ble analysert ved hjelp av Pearsons korrelasjonsanalyse.
(A) ektopisk uttrykk for MIR-203 ved trans Mir-203 etterligner betydelig redusert spredning av SW480-celler, sammenlignet med foreldre og negative kontroller (* P 0,05). (C) ektopisk uttrykk for MIR-203 særlig hemmet celle migrasjon og invasjon av SW480 celler (200 × forstørrelse, * P 0,05). Omvendt, inhibering av MIR-203-ekspresjon ved å transfektere MIR-203-inhibitorer samtidig (B) fremmet proliferasjon (* P 0,05) og (D) migrering og invasjon av SW480-celler, sammenlignet med foreldre og negative kontroller (200 x forstørrelse, * P 0,05). Figuren er en representant for 3 eksperimenter med lignende resultater.
Effekt av MIR-203 på CRC celleproliferasjon, migrasjon og invasjon
For å validere om MIR-203 kan regulere CRC celleproliferasjon vi utførte en spredning analyse i SW480 celler transfektert med Mir-203 etterligner eller dens negativ kontroll, og fant at økt uttrykk av MIR-203 betydelig hemmet spredning, (fig. 4A), motilitet (fig. 4B), samt invasjon av SW480 celler. Omvendt, nedregulering av MIR-203 i hemmere-transfekterte SW480 celler tilsynelatende fremmet spredning, motilitet og invasjon av SW480 celler (fig. 4C).
Overuttrykte MIR-203 delvis forsterker ZNF217 proliferasjon, migrasjon og invasjon av CRC celler
for ytterligere å utforske ZNF217 mediert-tumorigene effekter er regulert av MIR-203, vi kotransfiserte SW480 celler med ZNF217 siRNA i kombinasjon med Mir-203 etterligner. Vi observerte synergistiske inhibitoreffekter på ZNF217 ekspresjon (Fig. 5A), samt spredning, (fig. 5B), migrering og invasjon (fig. 5C) av SW480-celler ko-transfektert med ZNF217 siRNA og MIR-203 etterligner sammenlignet med SW480 celler transfektert med enten ZNF217 siRNA eller Mir-203 etterligner alene. Samlet utgjør disse resultatene indikerte at funksjonene ZNF217 som en potent onkogen er regulert av MIR-203.
(A) Effektiv undertrykkelse av ZNF217 protein uttrykk ved ZNF217 siRNA og Mir-203 etterligner henhold og combinedly. Merk at ZNF217 uttrykk er mer effektivt undertrykt av kombinasjonsbehandling. Undertrykkelse av ZNF217 samtidig resulterte i (B), signifikant inhibering av cellevekst og (C) migrering og invasjon (200 x forstørrelse) av SW480-celler sammenlignet med negative kontroller. Legg merke til den synergis hemmende effekt av kombinasjonen av ZNF217 siRNA og Mir-203 etterligner, sammenlignet med noen av dem alene (* P 0,05)
Diskusjoner
ZNF217 er et nylig. identifisert medlem av sink finger protein familien. Det i hovedsak fungerer som en transkripsjonsreguleringsfaktor involvere i reguleringen av svulst forekomst og utvikling [16]. ZNF217 besitter en rekke forskjellige strukturelle domener inkludert åtte C2H2 sinkfinger DNA-bindende motiv, så vel som en prolin-rik (16-20%) domene lokalisert på rester 757-1,005. Prolinerich domener har blitt vist å fungere som transkripsjonelle aktivatorer i mange gener som CTF /NF-1 [3]. ZNF217 genet er blitt grundig undersøkt i brystkreft [4, 17], eggstokk-kreft [18, 19, 20], øsofageal karsinomer [21], magekreft [22, 23, 24] og prostatakreft [25, 26] , men ikke i CRC. I tillegg har økt kopiantall av kromosom 20q13.2 blitt funnet å være assosiert med metastase av CRC. Dermed er det spesielt verdt å utforske dens potensielle rolle i CRC utvikling.
I denne studien fant vi at ZNF217 uttrykk på både mRNA og proteinnivåer var betydelig høyere i kolorektale tumorvev enn i sin matchet ikke- tumorvev og dens overekspresjon var assosiert med maligne clinicopathological funksjoner og kort overlevelse av CRC pasienter, noe som indikerer at ZNF217 fungerer som et onkogen i CRC.
De fleste kreftpasienter er døde av komplikasjoner som følge av metastaser. Derfor rettet mot metastatisk sykdom er en sentral anti-kreft strategi. Mange studier har vist at sink finger-proteiner som spiller kritiske roller i prosesser av tumorinvasjon og metastase inklusive ZNF217 kan reguleres ved en rekke forskjellige gener [27, 28]. I denne studien fant vi at knockdown av ZNF217 av siRNA førte til redusert spredning, invasjon og migrasjon av CRC celler in vitro. Disse resultatene avsløre onkogene funksjonene ZNF217 i CRC. Faktisk er det blitt rapportert at tumorceller HO-8910, LNCaP og DU145 [26], så vel som brystcancer vev [4] konstruktivt uttrykker høyt nivå av ZNF217. Krig et al rapporterte at mis-regulering av E-cadherin og som ennå uncharacterized ZNF217 målgener [29] kunne redegjøre for endringer i mobilnettet immortalization, apoptose motstand, motstand mot kjemoterapeutiske midler, og Akt fosforylering i celler med høy ekspresjon nivå ZNF217 . Selv om hundrevis av gener er potensielle mål for ZNF217 og konsensusbindingssteder har blitt foreslått, de spesifikke gener som regulerer ZNF217 uttrykk er lite kjent.
Samler bevis tyder på at avvikende uttrykk for miRNAs er knyttet til utvikling av CRC [ ,,,0],30, 31, 32]. Sofistikerte datamaskinbaserte tilnærminger for miRNA identifisering og målet prediksjon samt validering teknikker for å bekrefte disse spådommene har bidratt sterkt til oppdagelsen av nye miRNAs og deres funksjonelle karakterisering. Derfor lite molekyl formidlet feilregulering av miRNA fremstår som en potensiell ny terapeutisk tilnærming for menneskelige sykdommer, inkludert kreft [33]. Blant humane kreftrelatert mirnas, og MIR-203 tiltrukket seg stor oppmerksomhet, fordi det uttrykkes avvikende i en rekke krefttyper. I vår studie identifiserte vi for at MIR-203 var markert nedregulert i menneskelig CRC og restaurering av Mir-203 uttrykk kan hemme spredning, invasjon og migrasjon av SW480 celler. Tvert imot, transfeksjon av MIR-203 hemmer stimulert proliferasjon, invasjon og migrering av SW480-celler. Disse funnene tyder på at MIR-203 er involvert i metastaseprosesser CRC og er i overensstemmelse med tidligere studier som viser at MIR-203 ble uttrykt ved lavere enn normalt nivå i noen kreftformer [34, 35, 36, 37]. Imidlertid har MIR-203 er rapportert å utøve et onkogen funksjon i nyre og blære kreft [38] og bukspyttkjertelen adenokarsinom [39]. Avvikene i Mir-203 funksjoner i ulike typer kreft kan gjenspeile forskjeller i mobilsammenheng eller alternativt målrettede gener.
Den aktuelle studien gir flere linjer av bevis som ZNF217 er en roman mål av MIR-203 og deres antagonistisk interaksjon spiller en viktig rolle i utviklingen av CRC. Først, luciferase reporter-analysen viste at luciferaseaktivitet under kontroll av den ZNF217 3’UTR kan reguleres ved MIR-203. Dernest ble det observert en invers korrelasjon mellom ZNF217 og MIR-203 nivåer i CRC vev. For det tredje, overekspresjon av MIR-203 trykt ZNF217 nivåer og førte til redusert celleproliferasjon, migrasjon og invasjon i CRC cellelinjer.
I sammendraget, i denne studien viste vi at ZNF217 ofte oppregulert i CRC og en potensiell onkogen for CRC utvikling. I mellomtiden vår forskning beskrevet ZNF217 /MIR-203 kobling og gitt en mulig mekanisme for ZNF217 feilregulering og bidrag til CRC celle invasjon. Disse funnene åpner opp muligheten for å anvende MIR-203 mot kliniske CRC behandlinger.
Takk
Forfatterne er takknemlige for Shao-Feng Yan (Institutt for nevrokirurgi, Qilu Hospital, Shandong University, Jinan , Kina) for å gi siRNA-ZNF217 forfatterne ønsker også å takke Chao Wang for henne teknisk veiledning fra Shandong Provincial Hospital.
