Abstract
Enten stromal komponenter rette for vekst, invasjon, og formidling av kreftceller eller undertrykke neoplastiske lesjoner fra ytterligere ondartet progresjon er en vedvarende gåte i tumorbiologi. Konseptualisere et dynamisk bilde av tumorigenesis kompliseres av inter-individuell heterogenitet. I innlegget genomiske era, rakne slik kompleksitet er fortsatt en utfordring for kreft biolog. Mot å etablere en funksjonell sammenheng mellom mobilcrosstalk og differensial kreft aggressivitet, identifiserte vi en signatur av ondartet brystkreft epitel respons på stromal signalering. Nærhet til fibroblaster resulterte i genet transkripsjon endringer i 2 ganger for 107 sonder, kollektivt betegnet som fibroblast Utløst Gene Expression i Tumor (FTExT). Hazard ratio spådd av FTExT klassifikator for fjernt tilbakefall hos pasienter med brystsvulster middels og høy klasse ble signifikant sammenlignet med rutinemessige kliniske variabler (datasett 1, n = 258, HR – 2,11, 95% KI 1,17 til 3,80, p-verdi 0,01 ; datasett 2, n = 171, HR – 3,07, 95% KI 1,21 til 7,83, p-verdi 0,01). Biofunctions representert ved FTExT inkludert inflammatorisk signalering, frie radikaler, dvs, celledød, og celledeling. I motsetning til gener av «spredning klynge «, som blir overuttrykt i aggressive primære svulster, ble FTExT gener entydig undertrykt i slike tilfeller. Som bevis for at våre samsvarende funn, som kan kobles stromal-epitelial crosstalk og tumor atferd, viser vi en særegen differensial i stromal innvirkning på prognose definerende funksjonelle endepunkter av cellecyklusprogresjonen, og motstand mot terapi-indusert vekst og apoptose i lav vs høy klasse kreftceller. Våre eksperimentelle data slik avdekke aspekter av «parakrint cooperativity» som er utelukkende betinget av at histopathologically definert grad av samspill svulst epitel, og vise at epitelial respons til svulsten mikromiljøet er en deterministisk faktor bak klinisk utfall. I lys av dette, kunne tidlig demping av epitel-stromal crosstalk forbedre forvaltningen av tilfellene utsatt for å være klinisk utfordrende
Citation. Luciani MG, Seok J, Sayeed A, Champion S, Goodson WH, Jeffrey SS, et al. (2011) Distinctive respons til stromal Signa Følger Histologisk Grade Programmering av kreftceller. PLoS ONE 6 (5): e20016. doi: 10,1371 /journal.pone.0020016
Redaktør: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay, Instituto Nacional de kreft, Brasil
mottatt: 9 februar 2011; Godkjent: 08.04.2011; Publisert: May 19, 2011
Copyright: © 2011 Luciani et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health i henhold til tildelings R01CA109325. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
det er allment antatt at lokale mikromiljøet av vertsvevet er en aktiv deltaker i hele kreftutvikling og progresjon [1]. I dette miljøet, kan interaktive utveksling mellom stroma og kreftceller påvirker overlevelse, vekst og spredning [2]. Autokrine stromale kjemokiner, og parakrine TGFp signaler er velkjent pro-tumorigene mediatorer [3] – [8]. I brystsvulster, fibroblaster utgjør vanligvis den mest tallrike celletype i stroma, ofte referert til som «reaktive stroma «, sterkt anriket på, type I og VI kollagen, laminin, entactin, heparan-sulfat proteoglykaner og fibrin [9]. Tumor-avledet fibroblaster fra forskjellige organer vise betydelig variasjon i transkripsjonelle profiler [10], og betydelige variasjoner forekommer i stromal-genekspresjon i løpet av svulster i samme organ, ofte i forbindelse med clinicopathologic parametere. For eksempel overekspresjon av CD10, og PDGFß-reseptoren i brystkreft stroma er karakteristisk for høy histologiske grad [11], [12]. Fibroblast-assosiert signaturer og deres kliniske sammenheng med utfall hos kreftpasienter [13], [14], tyder på at en endret tumor stroma er et resultat av «crosstalk samvirke «med karsinomceller.
A omfattende innsats for å avsløre de fundamentet for stromal-epitelial crosstalk innenfor solide tumorer kunne bistå i identifiseringen av et bredere spekter av målrettbare molekylære faktorer som bestemmer pasientens utfall. Det er tenkelig at aggressive fenotyper av tumorceller ofte representere en lokal respons på signaler microenvironmental [15]. Men til tross for forbigående
in vitro
induksjon, har stromal-epitelial crosstalk langvarig funksjonelle effekter på tumorigenicity og metastatisk potensial av celler podet inn i forsøksdyr [16]. I jakten på spesifikke fenotypiske effekter,
in vitro
interaksjoner mellom fibroblaster og bryst epitelceller tidligere forsøkt var begrenset til spontant udødeligbrystkreftcellelinjer jevnt avledet fra aggressive høy klasse svulster og metastatisk effusions [17] – [19 ], eller fra ikke-ondartet humant brystvev [20]. Tolkning av slike data er beheftet med mangelen på en bred, sykdom basert spektrum av surrogatmodeller av human kreft. Dermed entydige konklusjoner om en sammenheng mellom klinisk heterogenitet og funksjonell biologi underliggende stromal-epitelial signale forblir unnvikende. En kritisk forutsetning for å analysere samspillet mellom ulike cellulære undergrupper innenfor svulstvev er tilgjengeligheten av levende interaktive komponenter fraksjonert fra frisk kirurgisk kast vev i mengder tilstrekkelige for robust datainnsamling og hypotesegenerering. Likeledes, for å oppnå translasjonelle innsikt gjennom eksperimentelle simulering, er det av avgjørende betydning å innlemme en cellulær repertoar som gjengir bredden av kliniske variasjon bidro med epitel og stromale elementer i tumorvevet. Ved å legge til rette for direkte crosstalk mellom nye primærtumorcellelinjer bredt alt clinicopathology [21] og flere uavhengige prøver av ikke-ondartede eller svulstvev-avledet fibroblaster, har vår studie rettet mot en bedre forståelse av kreft biologi og dens anvendelse på følgende måter. Først blir et sett av gener identifisert, hvis ekspresjon er konsekvent endres gjennom parakrine interaksjoner. Deretter er rollen av en slik stromally indusert tumorcellerespons i å fremme sykdommens alvorlighetsgrad illustreres gjennom sin sammenheng med klinisk utfall. Endelig er en direkte funksjonell basis for varierende klinisk resultat assosiert med tumor respons til stromal signale demonstrert ved endringer i cellesykluskinetikk, apoptotisk flukt, ROS reduksjon, og nøytralisering av de veksthemmende virkninger av hormonkreftterapi. Vår demonstrasjon av klasse-assosiert variabilitet i dynamisk omprogrammering av kreft epitel ved stromal mikromiljøet øker omfanget av klassisk kreft patobiologi, og foreslår nye mål for svulster ildfaste til nåværende behandlinger. Videre kan påvisning av mønstre av parakrint responsen på tidlige stadier avsløre tilbøyeligheten for progresjon fra premaligne, og preinvasive sykdom til avanserte lesjoner
Resultater
Identifikasjon av FTExT – a. Genekspresjon profil som viser ondartet celle respons til stromal aliserte
en differensiell ekspresjon profil mellom primære brysttumorcellelinjer alene (T ingen), og de som er dyrket i nærvær av brystkreft fibroblaster (T + TF) ble definert av en betydelig gen liste bestående av 482 probe sett med en justert p-verdi 0,05, hvor 7 uavhengige primær tumorcellelinjer ble betegnet som T, og primærtumor avledet fibroblaster som TF. Expression profiler for 3/7 cellelinjer ble kjøpt med 2 uavhengige fibroblaster prøver. En heatmap, i stor grad reflekterer transkripsjonen undertrykkelse av tumor-fibroblast coculture (figur 1A) inneholder 107 probe sett, med 2 ganger endring i genekspresjon (tabell S1). Denne gruppen av gener, som viste betydelig negativ fold-endring i kreftceller, og utpekt som fibroblast Utløst Gene Expression i Tumor (FTExT), ble ytterligere undersøkt. Oppregulert probe sett innenfor den betydelige genet listen ikke tilfredsstiller våre kriterier for fold endring, og ble ikke ansett for videre studier. Beriket kategorier av biologiske funksjoner i forbindelse med FTExT gener ble bestemt ved oppfinnsomhet Pathway Analysis, og primært involvert inflammatorisk respons, celleproliferasjon, celledød, og fri-radikal fjernende (figur 1B, og fig S1).
A. Hierarkisk clustering av primær brystkreft cellelinjer som kontroll monokultur, og i coculture med tumor-avledet fibroblaster. Merk uavhengige klynger portretterer karakteristiske stromally indusert uttrykk mønstre i kreftceller som reflekteres av 482 betydelige probe sett. B. beriket kategorier av bio-funksjoner representert ved 107 probe sett, med 2 ganger endring i genekspresjon, utpekt som FTExT. Barer er gruppert og farget i henhold til bio-funksjonskategorier. Hver søyle representerer en berikelse test p-verdi på en bio-funksjon. C. Analyse av 482 betydelige probe-sett i gjennomsnitt over flere epiteliale cellekulturer avledet fra maligne (rød) og ikke-ondartet brystvevet (grønn) i nærvær (y-aksen) eller fravær (x-aksen) av stromal coculture. Den svarte stiplede linjen representerer x = y. Tumorceller vise større avvik fra denne linjen, det vil si mellom kontroll og coculture mens uttrykk mønstre av cocultured ikke-ondartede epitelceller viser minimalt avvik fra kontroll. D. Scatter tomt på relative transkripsjonsnivåer av 11 FTExT gener målt ved QPCR i et uavhengig sett med 6 primære brystkreftcellelinjer cocultured med en av 4 tumor-avledet fibroblast (TF) prøver. Data representerer
ACTB
normalisert uttrykk for test genet i cocultured tumorceller i forhold til kontroll. . Note spekter av uttrykk for hver test gen
Andre måter å evaluere mangfoldet av stromal innflytelse, inkludert: (1) komparativ analyse av tumor-avledet betydelig genet liste (482 probe sett) med tabelldata fra stromal-epitelial cocultures isolert fra 8 uavhengige ikke-ondartede bryst vevsprøver. Genuttrykksmønster var karakteristiske mellom cocultured ondartet vs ikke-ondartede bryst epitelceller (figur 1C). Mens ikke-ondartede epitelceller cocultured med tilsvarende ikke-ondartede fibroblaster vises relative ensartethet i respons, ble bredt heterogenitet observert i tumor avledet stromal-epitelial cocultures (2) QPCR analyse av 11 FTExT gener i et uavhengig sett med 6 primære tumor-avledet epiteliale cellelinjer cocultured med 4 tidligere utestet tumor-avledet fibroblaster. I likhet med de ovennevnte matrise data, bekreftet en gen-av-genet kvantitativ analyse induksjon av endringer i test genekspresjon i forhold til husholdningsgenet,
ACTB
, innenfor cocultured tumorceller (fra 4 matchet, og 2 uovertruffen cocultures) (figur 1D).
FTExT variasjon og assosiasjon med klinisk utfall av primær brystkreft
for å bestemme den kliniske relevansen av fenotypiske endringer direkte forårsaket av stromal crosstalk, klassifisering makt FTExT (107-probe-sett) ble testet i forbindelse med matrisedata fra 2 uavhengige brystkreft datasett. Fjernmetastaser overlevelse (DMFs) ble brukt som et endepunkt for pasientenes prognose. I GSE6532 datasett [22], svulster med dårlig prognose vises betydelig større FTExT gen undertrykkelse i forhold til de med god prognose (n = 401, p = 0,031, Figur 2A – venstre panel). Lagdel makt FTExT omfattet svulster i alle klassetrinn. Videre klassifikator forbedret underklassifikasjon av undergruppe består bare av middels og høy klasse svulster videre (n = 258, p = 0,011, Figur 2A – panel til høyre). Med andre ord, FTExT identifisert pålitelig pasienter som gjorde det dårlig i situasjoner der tradisjonell histopatologi basert prognostication ble begrenset i forhold til å gi et nøyaktig anslag. Reproduserbarheten for FTExT klassifikator resultatene ble ytterligere demonstrert i en uavhengig datasett [23] – GSE11121 på tvers av alle karakterer (n = 200; p = 0,013, Figur 2B – venstre panel), så vel som i en separat analyse av middels og høy grad av brystkreft (n = 171, p = 0,013, Figur 2B – panel til høyre). Spesielt i alle analysene, FTExT var en bedre uavhengig prediktor for utfallet av middels og høy klasse tilfeller sammenlignet med konvensjonelle prognostiske parametere, slik som, svulst klasse, ER status, lymfeknute positivitet og tumorstørrelse (tabell 1).
A.
Datasett 1 (GSE6532) –
FTExT klassifikator spår god kontra dårlig resultat for endepunktet av fjernmetastaser overlevelse (DMFs) (n = 401,
venstre panel
). FTExT basert stratifisering av pasienter diagnostisert med grad 2 (middels) og 3 (høy) svulster (n = 258,
høyre panel
). B.
Datasett 2 (GSE11121) Anmeldelser – FTExT prediksjon av DMFs i et uavhengig datasett (n = 200,
venstre panel
). Bekreftelse av FTExT basert stratifisering av pasienter diagnostisert med grad 2 og 3 svulster (n = 171,
høyre panel
).
Vår samlede coculture genuttrykk data og FTExT analyse av primærtumor datasett vist at dette stromally indusert profilen ble manifestert som et kontinuum. På den ene ytterligheten var relativt uendret genekspresjonsmønster karakteristisk for ikke-ondartede cocultures, skiftende til minimal undertrykkelse av FTExT gener innenfor primærsvulster forbundet med god klinisk utfall, mens på den andre ytterligheten ble sterkt undertrykt uttrykk profiler innen svulster overdragelse dårlig pasient utfall.
Induksjon av et bredt spekter av funksjonelle endringer i ondartede celler ved hjelp av stromale fibroblaster crosstalk
i et forsøk for å vise den biologiske betydning av stromally induserte fenotyper som en determinant for klinisk resultat, som anvendes vi ny primære brysttumor cellelinjer av forskjellig histologisk klasse [21] i en rekke funksjonstester. Reflekterer beriket biofunction analyse av FTExT gener, ble robuste analyser prioritert, hvor målbare endepunkter kan benyttes, og som kan lett gjennomføres i lys av begrensninger i tilgjengeligheten av begrenset levetid stromal kulturer. Spesielt endringer i funksjonelle endepunktene for store cellular programmer som hyperactivated spredning kinetikk; oksidativt stress nøytralisering; og apoptotisk celledød unndragelser ble undersøkt i tumorceller cocultured med fibroblaster avledet fra ondartet eller nonmalignant menneskelig brystvev.
(1) omprogrammeret cellesyklus distribusjon av kreftceller
Ten uavhengige primær brystkreft cellelinjer under kontroll og TF-coculture betingelser ble merket med BrdU og analysert ved FACS. Cellecyklus endringer indusert av coculture er oppsummert i tabell 2. Dot plott av representative cellelinjer er vist i figur 3A. Dataene viste karakteristiske karakteren avhengige cellesyklus profiler. Som svar på stromal cellesignalisering, karakter 1 (CCdl22, CCdl68) og grad 2 (CCdl1570) tumorcellelinjer utvunnet vises enten (a) ingen signifikant endring i cellesyklusfordeling sammenlignet med ikke cocultured kontroller, eller (b) indusering av cellesyklus arrest i G2 /M-fase, noe som indikerer aktivering av en post-replicative /DNA-reparasjon sjekkpunkt. I motsetning til grad 3 tumorceller (CCdl54, CCdl257, CCdl675), inkludert en høy karakter ductal carcinoma
in situ plakater (DCIS) avledede cellelinje (CCdl1797) og ytterligere grad 2 tumorlinjer (CCdl66, CCdl329, CCdl1599) viste en signifikant økning i S-fasen befolkning, en indikasjon av (a) DNA-syntese /replikasjonsfeil på grunn av steiling av replikasjonsgafler, eller (b) en hurtigere celleproliferasjon hastighet. Spesielt, spesifisiteten av tumorcelleresponsen var vanlig mellom uavhengige fibroblast prøvene.
A. Cellesyklus analyse av primære brysttumorcellelinjer i coculture med 2 uavhengige fibroblast prøver, TF1, og TF2. Sektordiagrammer oppsummere FACS data. Tallene representerer prosent celler i S-fasen av cellesyklusen. Hver verdi er gjennomsnittet av tre eksemplarer datapunkter. Representative FACS dot tomter er vist for kontroll (til venstre for tilsvarende kakediagram) og TF2-cocultured celler (høyre av tilsvarende kakediagram). Merk varierende effekter av stromal coculture på tumorceller sykling. B. Måling av S-fase kinetikk over tid i representative klasse 1 og klasse 3 cellelinjer i nærvær av TF1 og TF2 celler. Legg merke til kontrast effekter av stromale celler på replikasjon frekvensen av cellelinjer er vist. Feilstolpene representerer standardavviket av gjennomsnittet av triplikate verdier. Fibroblast-indusert reduksjon i BrdU merkede celler i klasse 1 kreftceller, og en tilsvarende økning i klasse 3 tumorceller var signifikante på alle tidspunkter (p 0,005 og p 0,001, henholdsvis)
(2) Dramatiske endringer i frekvensen av tumorcellevekst.
for å bekrefte at en økt S-fase brøkdel svar på stromale signalering i klasse 3 tumorceller faktisk representerte en raskere spredning hastighet i forhold til klasse en cellelinjer, ble representanter for hver gruppe i coculture med 2 uavhengige TF prøver pulset med BrdU på flere tidspunkter i løpet av en 1 timers periode. FACS målinger av BrdU-inkorporering cellefraksjon med tiden tilgjengelig et pålitelig estimat av hastigheten av DNA-syntese i tumorceller med og uten eksponering for fibroblast signalering. Spredning kinetikk av klasse 1 (CCdl22) cocultures ytterligere bekreftet en tidligere observert fibroblast-indusert G2 /M arrest. Cellesyklus-stans ble opprettholdt under hele forsøks tidsforløp, som fører til en markert reduksjon (opp til 70%) i andelen av BrdU-inkorporering celler (figur 3B). I slående kontrast, i klasse 3 (CCdl675) cocultures, en dramatisk økning på minst 47% og opp til 60% skjedde i frekvensen av replikering basert på bakken av vekstkurver sammenlignet med kontrollceller. Induksjon av en langsommere eller raskere spredning rate i klasse 1 og klasse 3 kreftceller, henholdsvis, var konsistent mellom uavhengige fibroblast prøvene.
(3) Stroma-assistert beskyttelse fra apoptotisk celledød.
for å evaluere hvorvidt stromal signale forbedrer overlevelse og formering av cocultured tumorceller, den ESR1 antagonist, 4-hydroxy tamoxifen (OHT), som er kjent for å utøve sin anti-tumoreffekter ved oksidativt stress induksjon og påfølgende apoptose, ble anvendt for å initiere celledød i cellelinjer , noe som viste en økning i prosent S-fase som reaksjon på coculture. Cellelinjer avledet fra både klasse 2 (CCdl329 og CCdl1599) og klasse 3 (CCdl675) svulster ble evaluert. En eksperimentelt utledet apoptotisk indeks som sammenligner en enkel konsentrasjon på 10 uM OHT uten OHT kontroll aktiveres en standardisert målemetode hvor de relative beskyttende virkningene av stromal coculture kunne måles ved Annexin V-farging. Først en sammenligning mellom referanse apoptose i tumorcellelinjer (CCdl675, CCdl329 og CCdl1599) dyrket alene eller som cocultures med 3 uavhengige fibroblast kilder (en reduksjon mammoplasty-avledet, betegnet som EF, og to tumor avledet eller TF) viste en stromally indusert beskyttende virkning (figur 4A). Den apoptotiske fraksjonen ble redusert med 30-60% i klasse 2 cellelinjer (CCdl1599 – p 0,002; CCdl329 – p 0,001), og med 85% i klasse 3 celler (CCdl675 – p 0,005). Viktigere er den dramatiske økning i OHT-indusert celledød ble også undertrykket ved forutgående eksponering av alle tre tumorcellelinjer til fibroblast coculture. Stromale fibroblaster både ondartede og nonmalignant avledning var like effektive i å få fram apoptose undertrykkelse i tumorceller (p 0,001) (figur 4B). Mens det er mulig at variasjonen i den cellulære respons på OHT tydelig i coculture er stort sett et speilbilde av differensial ESR1 aktivitet, våre data antyder sterkt at vekstinduserende parakrin signalisering på tumorceller som potensielt kan endre følsomheten for hormonbehandling og spille en rolle i Kjøpet av en resistent fenotype.
A. Reduksjon i referanse apoptotisk fraksjon målt som Annexin V-positive celler ved FACS-analyse. Tre uavhengige tumorcellelinjer ble cocultured med ikke-ondartet (EF), og tumor-avledede (TF1) og (TF2) fibroblaster, og sammenlignet med tumor alene kontrollkulturer for endringer i den apoptotiske indeksen. Representative FACS profiler til grunn for de grafiske sammendrag og prosent Annexin-V positive celler er vist. Legg merke til betydelig reduksjon i den apoptotiske fraksjon av alle 3 tumorlinjer (* p 0,005). B. Resistens mot OHT-indusert apoptotisk død i tumorceller cocultured med EF og TF prøvene sammenlignet med narkotika-behandlede tumor alene kontroll. Merk bemerkelsesverdig undertrykkelse av OHT-indusert celledød ved coculture. C. Nøytralisering av cellulære ROS-nivåer målt som C400 midlere fluorescensintensitet (MFI) ved FACS-analyse. Resultatene er uttrykt som prosent reduksjon i forhold til utgangspunktet fluorescens av kontrolltumor kulturer vs. cocultures. Representative FACS profiler som representerer de grafiske sammendrag og MFI verdier vises. Merk nedgang i OHT-indusert C400 MFI av alle kreft linjer (* p 0,005). D. coculture indusert overstyring av OHT-mediert G1 arrest i tumorceller. Note reduksjon i prosent OHT-indusert økning av G1 befolkningen i cocultured tumorcellelinjer (* p 0,005). Hvert datapunkt er et gjennomsnitt av triplikate verdier i alle paneler av figuren. Barer er fargekodet i paneler B og D for å representere følgende: grå -untreated kontroll, svart – OHT-behandlet kontroll, hvit – OHT behandling av EF coculture, blå – OHT behandling av TF1 coculture, rød – OHT behandling av TF2 coculture.
(4) Reduksjon av oksidativt stress i tumorceller.
Den midlere fluorescensintensitet av C400-farging tjente vel som en indikator av endogene ROS-nivåer, skjønt de er generelt lav i tumor cellelinjer sammenlignet med inflammatoriske celletyper. En markert nedgang i OHT-indusert ROS akkumulering i tumorcellelinjer (CCdl1599, CCdl329, og CCdl675) cocultured før medikamentell behandling (Figur 4C). Den gjennomsnittlige reduksjonen i ROS med coculture var 34% (p 0,0001). Alle tre cellelinjer var konsekvent i sin grad av respons på maligne og ikke-ondartede vev-avledet fibroblaster.
Cell syklus analyse viste en OHT-indusert G1 fase arrest i alle tumorcellelinjer testet, som varierte fra 35% til 73% økning i denne fraksjonen (p 0,001). I tillegg kan en mild akkumulering i G2 /M-fraksjon var også tydelig i 2/3 tumorcellelinjer (p 0,02) i nærvær av det terapeutiske hormon-antagonist. I cocultures av 2/3 tumorcellelinjer (CCdl1599, CCdl675), G1-arrestert brøkdel falt betydelig til tross OHT eksponering (p 0,001) (figur 4D). Den beskyttende effekt av fibroblast coculture var ikke like uttalt i den CCdl329 linje siden det vist relativ resistens mot OHT behandling som indikert ved den laveste økningen i G1 fraksjonen – noe som antyder at G1 /S sjekkpunktet kan være defekt i disse cellene. Interessant, til tross for induksjon av bare en mild G1 arrest, CCdl329 celler var lydhør overfor OHT-indusert apoptose (figur 4B). Slike differensial svar til OHT foreslå andre kilder til variasjon i brystsvulster, noe som ytterligere endre utfallet av tumor-stroma interaksjoner, og gjenspeiler flere kilder til heterogenitet.
Til sammen viser vår data som fibroblast coculture tilrettelagt en parallell reduksjonen i 3 uavhengige, men nært beslektede parametre av OHT-indusert skade: ROS akkumulering, G1 arrest, og apoptotisk celledød i en aggressiv undergruppe av primære brystkreft avledet cellelinjer. Imidlertid, til tross for tumor fremme reaksjonsevne som vises av disse cellelinjene, markert variasjon var tydelig. CCdl329 celler effektivt unngått OHT-indusert apoptose, selv om G1 arrest i nærvær av medikamentet ble bare delvis overvunnet av coculture. I motsetning CCdl675 celler var relativt mangelfull i surmounting den apoptotiske byrde tross den observerte ROS reduksjon og en slående nedgang i G1 og G2 /M arrestert brøkdel, i samsvar med våre observasjoner av mangelfull reparasjon kulminerte i økt genomisk ustabilitet (data som skal brukes i andre ).
stromal fibroblast indusert funksjonell effekten er reversibel
til slutt, for å vurdere om den er reversibel særegne og determinisendepunktene stromally indusert vekst aggressivitet, tumorceller ble analysert over en kortsiktig periode for reversering av cellesyklus endringer, og induksjon av celledød, etter coculture forholdene ble avviklet (figur 5A). Fjerning av stromal påvirkning fra klasse 3 (CCdl675) cocultures snudd den slående S-fase økning over kontrollen i løpet av 48 timer testperioden. Imidlertid forbedring i apoptotisk celledød ble ikke påvist i denne perioden (data ikke vist), noe som bekrefter at coculture indusert økning i BrdU-merkede fraksjon av tumorceller representerte et større sykling befolkning, i stedet for akkumulering i S-fase på grunn av replication- arrestere og gaffel steiling. I tilfelle av den sistnevnte mulighet, vil opphør av coculture har ført til cellesyklusutvikling i tumorceller huse en unreplicated sett av kromosomer, som kulminerte i mitotisk katastrofe og celledød. I klasse 1 tumorceller (CCdl22), som svarte til coculture ved å vise en gjennomsnittlig økning på 64% i G2 /M arrestert befolkningen i forhold til kontroll (p 0,001), cellesyklus re-entry ble observert ved fibroblast fjerning. Imidlertid, ettersom kulturen nådde konfluens i løpet av den eksperimentelle tidsrom, ble en etterfølgende G0 /G1 arrest tydelige i både kontroll og cocultured klasse 1-celler, sterkt tyder på at (a) disse tumorcellene var sannsynlig DNA-reparasjon dyktig, som fjerning av stromale effektorer vinnes G2 checkpoint, og at (b) den vekstpotensial var intakt, men som reagerer på negativ regulering av parakrine signalering. Hadde den G2 /M sjekkpunkt ikke vært reversible, men på grunn stedet for utbruddet av mitotisk stopp i cocultures, ville det ha resultert i apoptotisk celledød, påvisbart som en betydelig økning i den subG1 populasjonen i løpet av testperioden.
EN. Sammenlignende cellesyklus profiler av klasse 1 og klasse 3 tumorceller etter 7-dagers fibroblast coculture, etterfulgt av en 48 timers periode uten coculture. Merk markert reduksjon i G2 befolkningen i klasse 1 cellelinjen ved opphør av coculture forhold. Både kontroll- og testpopulasjoner vise tegn på G0 /G1 arrest på grunn av kultur samløpet. I klasse 3 svulst linje, returnerer post coculture celle sykling å kontrollere profiler. Nummererte pie chart segmenter viser prosentandelen av celler i G1 og S-fasen. SubG1: gul; G1: green; S: red; G2 /M: blå. B.
FTExT modell
:
gjennom anvendelse av levende interaktiv cocultures av stromale fibroblaster og primærtumor-avledet epitel av varierende histologisk grad, FTExT tilbyr ny innsikt i biologiske grunnlaget for grade- forbundet lagdeling av primær brystkreft. Det foreslås at cellelinjer avledet fra godt differensierte svulster assosiert med god klinisk prognose rekapitulere sine funksjonelle egenskaper i nærvær av stromale fibroblaster
in vitro
. Tilsvarende tumorceller avledet fra dårlig differensierte maligne lesjoner beholde den kontekstuelle evne til å reagere på den samme parakrin innflytelse på tilsvarende måte som kreft aggressivitet og ugunstig pasient utfall. Slike autentiske modellsystemer er et viktig verktøy for å fremme målene for forskning på kreft biologi.
Totalt sett de eksperimentelle funnene i denne studien er konsistente og støttende av differensial kliniske utfall data avledet gjennom samsvar FTExT profilering analyse av primær brystkreft. Sammen gir de en roman konseptuelt rammeverk for signifikant sammenheng mellom FTExT uttrykk mønster i moderat og dårlig differensiert eller grad 2 og 3 svulst henholdsvis, og rollen av stroma i induksjon av rask vekst og dårlige kliniske utfall. I motsetning til sjekkpunkt induksjon i godt differensierte eller klasse 1 kreftceller mediert av stromal signale tilsvarer den observerte genuttrykk mønster av primære svulster, som jf et godt klinisk resultat (figur 5B).
Diskusjoner
Mot et fullstendig bilde av kreftutvikling og progresjon, en omfattende avgrensning av underliggende kilder bidrar til manifestasjon av ondartede fenotyper og deres heterogenitet, er kritisk. I tidligere studier har vi entydig identifisert iboende fenotyper reflekterer histologisk tumor variasjon, men uavhengig av kontekstuelle påvirkninger, slik som stromal induksjon [21]. Ved å ansette eksperimentell coculture i forbindelse med nye primærtumorcellelinjer, her vår tilnærming har identifisert FTExT, en programmert reaksjon på stromally utskilt faktorer. I stedet for en stromal påvirkning som jevnt fremmer eller hemmer alle svulster, våre data viser betydningen av variabel epitel respons på sykdom utfall. Sammen med samsvarende analyser av klinisk vev, til slike fokuserte ennå bredt omfang undersøkende strategier definere funksjonelle rammen av kreft fenotyper kan vesentlig forbedre og presisjon av druggable mål identifikasjon.
FTExT profil genereres gjennom eksperimentell coculture skildrer stromal regulering av viktige biologiske programmer, hvilket antyder en viktig rolle for stroma-assistert fremming av tidlige kjennetegnene ved kreft som omfatter omgåelse av reguleringskretser, slik som immunovervåkning, oksidativt stress, og metabolsk mangel [24], i tillegg til kjennetegnene ved fremskreden kreft [25]. Følgelig ble det FTExT uttrykk profil funnet å være assosiert med en dårlig klinisk utfall i to uavhengige datasett, som representerer over 600 tilfeller. I samsvar med denne samsvarende kliniske data, har vi ytterligere demonstrert at nedstrøms funksjonelle effekter av stromally indusert transkripsjons endringene var dramatisk variabel mellom primærbrystkreftceller av avvikende histopathologic avledning. I aggressive brystkreftceller, ble kreftfremmende effekter tydelig som en økt evne for oksidativt stress nøytralisering, apoptose unndragelser, og rask celle sykling.
