Abstract
Bakgrunn
microtubule legemidler er effektive anti-kreft agenter, primært på grunn av deres evne til å indusere mitotisk stopp og påfølgende celledød. Men noen kreftceller er egentlig resistent eller kjøpe en motstand. Mangel på apoptose følgende mitotisk stopp er antatt å bidra til medikamentresistens som begrenser effektiviteten av de mikrotubul-målsøkende anti-kreft medikamenter. Genetiske eller farmakologiske midler som selektivt letter apoptose av mitotiske arrestert celler presentere muligheter til å styrke den terapeutiske effekten.
Metodikk og hovedfunnene
Vi rapporterer et naturlig produkt Celastrol rettet mot tubulin og letter mitotisk celledød forårsaket av mikrotubulidynamikk narkotika. Først i et lite molekyl screening-forsøk, identifiserer vi Celastrol som en inhibitor for nøytrofil kjemotakse. Påfølgende time-lapse imaging analyser viser at hemming av mikrotubulidynamikk-mediert cellulære prosesser, inkludert cellemigrasjon og mitotisk kromosom justering, er de tidligste hendelsene påvirket av Celastrol. Uorden, ikke depolymerization, av mitosetråder vises ansvarlig for mitotiske defekter. Celastrol direkte påvirker de biokjemiske egenskaper av tubulin heterodimer
in vitro Hotell og reduserer proteinnivå
in vivo
. På cellenivå, induserer Celastrol en synergistisk apoptose i kombinasjon med konvensjonelle mikrotubulidynamikk målretting narkotika og manifesterer en effekt mot Taxol-resistente kreftceller. Til slutt, etter time-lapse bildebehandling og sporing av mikrotubulidynamikk medikamentbehandlede celler, viser vi at Celastrol fortrinnsvis induserer apoptose av mitotiske arrestert celler i et caspase-avhengig måte. Denne selektive effekten er ikke på grunn av hemming av generell celleoverlevelses trasé eller mitotiske kinaser som har vist seg å forbedre microtubule legemiddelindusert celledød.
Konklusjoner og Betydning
Vi gir bevis for ny mobil trasé som, når opprørt, selektivt induserer apoptose av mitotiske arrestert kreftceller, identifisere en potensiell ny strategi for å forbedre den terapeutiske effekten av konvensjonelle mikrotubulidynamikk målretting anti-kreft narkotika
Citation. Jo H, Loison F, Hattori H, Silberstein LE, Yu H, Luo HR (2010) Natural Product Celastrol destabiliserer Tubulin heterodimer og Forenkler Mitotisk celledød utløst av microtubule målretting kreftmedisiner. PLoS ONE 5 (4): e10318. doi: 10,1371 /journal.pone.0010318
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 17 november 2009; Godkjent: 04.03.2010; Publisert: 23 april 2010
Copyright: © 2010 Jo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. H. Jo er støttet av National Institutes of Health (NIH) Opplæring Grant HL066987. H. Luo støttes av NIH tilskudd HL085100, AI076471, HL092020, og GM076084 og en stipendiat Grant fra American Cancer Society. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mikrotubuli (MTS), trådformede polymerer av alfa- og beta-tubulin heterodimer, er viktige cytoskjelett strukturer som styrer grunnleggende cellulære prosesser som celledeling, migrasjon, intracellulær transport og signalering (for vurdering [1]) . MTS er dynamiske i naturen og stadig gjennomgå faser av svinn og re-vekst, en prosess som kalles «dynamisk ustabilitet». Denne dynamiske egenskapen ligger til grunn for det store flertallet av MT-baserte cellulære prosesser [1]. De samlede Dynamikken MTS variere i forskjellige celletyper og cellulære sammenhenger og reguleres på flere nivåer, inkludert post-translasjonelle modifikasjoner av tubulin selv og interaksjoner med et stort utvalg av MT bindende proteiner [2], [3], [4] , [5], [6].
Under fysiologiske betingelser, det mest dramatiske reorganisering av MTS oppstår ved angrep av mitose når de interfase MTS er depolymeriseres og repolymerized for dannelse av mitotiske spindler. Den rom-tid-sammenstillingen og dynamiske oppførsel av mitotiske spindler er kritisk viktig for riktig justering og segregering av kromosomene dupliseres, svikt som fører til celledød eller genomisk instabilitet (for oversikt [7]). Mitotiske spindler er spesielt følsomme for forskjellige naturlige og syntetiske MT stoffer som svekker deres montering og funksjon, noe som fører til mitotisk stopp og påfølgende celledød. På grunn av denne aktiviteten, blir MT medikamenter mest brukte for å behandle kreft hos mennesker. Men noen kreftceller er egentlig motstandsdyktig og narkotikautsatte kreftceller ofte få en motstand.
Discovery og utnyttelse av strukturelt forskjellige nye typer antimikrotubulær midler kan overvinne slike problem. For eksempel har den kliniske nytten av strukturelt forskjellige MT stabilisatorer for å overvinne den Taxol-resistens blitt rapportert [8], [9], [10]. De komplementære fremgangsmåter kan omfatte en kombinert inhibering med andre cellulære faktorer, som for eksempel mitotiske kinaser og motor proteiner [11]. Ikke desto mindre, gitt de grunnleggende funksjonene til MT’er i forskjellige cellulære prosesser, noe grad av cytotoksisitet til normale celler synes uunngåelig.
Det har blitt rapportert at den relative motstand av forskjellige humane kreftcellelinjer på vanlige antimitotiske midler er korrelert med mangelen på celledød i stedet for mitotisk stopp [12]. Dette funnet er i samsvar med både kliniske observasjoner og dyremodelleksperimenter som er identifisert graden av celledød etter behandling Taxol bestemmes den samlede resultatet av sin effekt [13], [14]. Derfor genetiske eller farmakologiske midler som selektivt letter apoptose av mitotisk arrestert celler (dvs. prolifererende kreftceller) presenterer muligheter for å styrke effekten av MT narkotika, med liten innvirkning på narkotikautsatte inter celler (dvs. ikke-delende normale celler).
i løpet av lite molekyl screening innsats (upublisert resultat), identifiserte vi et naturlig produkt Celastrol, tradisjonelt kjent for sine anti-inflammatorisk og anti-kreft aktiviteter, som en hemmer av nøytrofile chemotaxis. Ved å ansette en rekke eksperimenter som inkluderer time-lapse avbildning av celle migrasjon og kromosom justering samt biokjemiske og cellebiologiske tilnærminger, vi avdekket at hemming av MT funksjoner var en av de tidligste cellulære hendelser påvirket av romanen tubulin-targeting aktivitet av Celastrol. Vi videre vist at denne unike aktiviteten kan utnyttes til å indusere apoptose av Taxol-resistente kreftceller, og for å selektivt lette mitotiske celledød av MT narkotika arrestert kreftceller. Disse resultatene gir en molekylær forklaring for den anti-inflammatoriske og anti-kreft-aktivitet av Celastrol, og presentere en potensiell strategi for å forbedre den mitotiske celledød indusert ved konvensjonelle mikrotubul-målsøkende anti-kreft medikamenter.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP og generering av taxol-resistente cellelinje
Både HEK293 og HeLa-cellelinjer ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC), og ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin og streptomycin under 5% CO
2.
for å generere en Taxol-resistente cellelinje, HeLa-celler som stabilt uttrykker EGFP smeltet til Histone 2B ble generert. Disse celler ble deretter sådd ut i 60 mm kulturskål (1 x 10
6) i nærvær av 0,5 nM av Taxol. Etter 72 timer ble de levende celler oppsamlet og re-belagt, i nærvær av den samme konsentrasjon av medikamentet. Denne prosedyren ble gjentatt minst tre ganger for en gitt medikamentkonsentrasjon. Konsentrasjonen av Taxol ble gradvis økt til en sluttkonsentrasjon på 5 nM. De resistente celler utpekt som H2B-TXR ble opprettholdt og formert i nærvær av 5 nM Taxol.
Reagenser og antistoffer
Celastrol ble kjøpt fra EMD Biosciences og alle andre kjemikalier med mindre spesifiserte var fra Sigma Aldrich og Tocris Bioscience. Mus monoklonale antistoffer for gamma-Tubulin (T3320), alfa-Tubulin (T6199), og beta-Tubulin (T4026) var fra Sigma Aldrich; Kanin polyklonale antistoffer for alpha Tubulin (ab18251) og beta-Tubulin (ab6046) var fra Abcam. HRP-konjugert anti-kanin og anti-mus sekundære antistoffer var fra Amersham Biosciences; alle andre antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology.
nøytrofile rensing og EZ-taxiscan chemotaxis analysen
Menneske perifert blod nøytrofile ble renset som tidligere beskrevet [15]. EZ-taxiscan kammer (Effector Cell Institute, Tokyo, Japan) ble satt sammen med en 260 mikrometer brede x 4 um tykke silisiumbrikke i henhold til produsentens instruksjon. Inhibitoren-behandlede, nøytrofile celler (3 x 10
6 /ml) ble blandet i RPMI (0,1% BSA) og lastet til det nedre kammer (3000 celler per brønn). En mikroliter av fMLP (100 nM sluttkonsentrasjon) ble tilsatt til det øvre kammer. De trekkende nøytrofile mot det øvre kammeret ble fotografert hvert 30. sekund i 20 minutter. Filmen ble analysert ved hjelp av DIAS programvare (Solltech, Oakdale, IA) for å beregne hastigheten.
Western blot og immnunostaining.
Klargjøring av totale cellelysater, Western blot og andre standard molekylærbiologiske teknikkene var hovedsakelig den samme som tidligere beskrevet [16]. For analyse av mitotiske kjerner ble cellene fiksert i nærvær av 3% PFA (forvarmet) i 5 minutter før DAPI farging. For farging av mikrotubuli, ble cellene sådd ut i en 35 mm-glassbunn fatet (Mattek Corp.) og fast i 5 minutter i pre-avkjølt (-20 ° C) metanol. Etter vasking tre ganger i PBS-Triton X-100 (0,05%), ble de fikserte cellene permeabilisert i 30 minutter i 5% normalt geiteserum inneholdende 0,3% Triton X-100. Den fortynnede antistoff (1:2000 for primær og 1:1000 for sekundært antistoff) i den samme oppløsning ble tilsatt og inkubert i 3 timer ved værelsestemperatur. Etter vasking tre ganger i PBS-Triton X-100, ble Alexa fluor fargestoff-konjugert sekundært antistoff tilsatt og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Fargingen ble visualisert under fluorescerende mikroskop (Olympus IX71) og bildet ble tatt med 100 X objektiv. For å undersøke defekter i posisjoneringen av to centrosomes i forhold til underlaget i Celastrol-behandlede mitotiske celler, to bilder med forskjellige fokalplanene, fokusert på gamma-tubulin farging av hver pol, tatt sammen med alfa-tubulin farging i spindlene (Figur S1B).
Biokjemiske analyser for tubulins
eksponentielt voksende HEK293 celler ble samlet og vasket en gang i PBS. Cellepelleten ble fryst på tørr is i 15 minutter, og lysert i analysebufferen inneholdende 0,3% CHAPS, 200 uM GTP, og protease-inhibitor cocktail (Sigma Alderich) i PBS. Lysatet ble holdt på tørris i 15 minutter og tint ved romtemperatur. Tint, ble cellelysatet umiddelbart sentrifugert ved 14000 rpm i 5 minutter ved 4 grader. Bare den ferskt tilberedte cellelysat (2-4 ug /ml) ble anvendt i
in vitro
oligomerisering assay, typisk i et 50 ul reaksjonsvolum. Etter pre-inkubering i nærvær av medikament i 10 minutter på is, ble lysatet inkubert ved 37 ° C i 15 til 60 minutter. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av et like stort volum av 2 X LDS buffer og kokt i 5 minutter før SDS-PAGE. For analysen med renset tubulin (mer enn 99% fra Cytoskjelett, Inc) ble tubulin oppløsningen fortynnet til en konsentrasjon på 10 ug /ml i analysebuffer, og reaksjonen ble utført i det vesentlige den samme som den cellelysat. For immunoutfelling ble HEK293-celler lysert i den samme buffer som ovenfor (vanligvis 1 ml per 60 mm kulturskål). Lysatet ble fjernet ved sentrifugering og inkubert på is i 10 minutter i nærvær av forskjellige stoffer. Den polyklonale a-tubulin-antistoff (ab18251, Abcam) ble tilsatt (5 ug antistoff pr 1 mg protein per prøve) og inkubert i en time i kjølerommet før tilsetning av protein G /A-agarose oppslemming (30 ul per prøve) . Etter inkubasjon i ytterligere 2 timer, ble immunecomplex vasket tre ganger i iskald analysebuffer ved 4 ° C før SDS-PAGE.
caspase aktivitet, celle levedyktighet, og proteasome aktivitetsanalyse
den kolorimetriske kaspase aktivitetsanalyse ble utført ved anvendelse av det rå celleekstrakt i nærvær av caspase substrat, Ac-DEVD-pNA (Biomol International). De legemiddelbehandlede celler ble oppsamlet og vasket en gang i PBS. Celler ble lysert på is i 10 minutter i en buffer som inneholdt 0,1% CHAPS, 50 mM HEPES (pH 8,0), 12,5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA og 5 mM DTT ferskt tilsatt. Lysatet ble sentrifugert i 5 minutter ved 14 000 rpm ved 4 grader. Den klarede lysat (ca. 200-400 ug protein) ble blandet med Ac-DEVD-pNA (200 uM sluttkonsentrasjon) i 100 pl reaksjonsvolum i en 96-brønners analyseplate. Platen ble inkubert ved 37 ° C, og enzymaktiviteten ble målt ved å avlese absorbans ved 405 nm for hver 1 time ved hjelp av plateavleseren (TriStar LB 941, Berthold Teknologier). Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-assay som tidligere beskrevet [16]. For å måle proteosomet aktivitet, HEK293-celler (1 x 10
6) ble behandlet med hver kjemikalier (5 pM) i 1 time, og lysert på is i 15 minutter i 200 ul lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM beta-Glycerophosphate, 1% Triton-X100). Når du har fjernet celleavfall ved sentrifugering ved 4 grader, ble ekstraktet utsatt for proteasomal aktivitetsanalyse bruker Proteasome-Glo ™ chymotypsinlignende Assay (Promega).
Time-lapse levende celle bildebehandling
for cellemigrering analysen ble HeLa-celler som uttrykker EGFP Histone H2B (HeLa-H2B) sådd ut i en 35-mm kulturskål (4 x 10
5) og dyrket i 48 timer. Skrape ble gjort ved bruk av tuppen i midten av tallerken og vasket en gang i forvarmet Leibovitz største L15-medium supplert med 0,5% FBS. Etter 10 minutter av healing i samme medium, ble stoffet tilsatt og time-lapse film ble tatt hvert 15. minutt i 150 minutter ved hjelp av IPLab programvare. Migrasjonen området ble bestemt ved å subtrahere det areal som opptas av celler ved tiden 150 minutter med den på tidspunkt 0 minutter for hvert medikament. Den relative migrering område ble beregnet ved normalisering mot kontrollen (DMSO-behandlet) gruppe. For mitotisk kromosom justering, ble HeLa-H2B celler sådd ut i en 35 mm-glassbunn fatet ved 20% konfluens og dyrket i 48 timer. Mediet ble erstattet med Leibovitz s L15-medium supplert med 0,5% FBS. Umiddelbart etter tilsetning av hvert legemiddel, ble prophase cellene identifisert under fluorescerende mikroskop og time-lapse film ble tatt hvert 5. minutt i 90 minutter. For apoptotisk død av mitotiske stansede celler, HeLa-H2b celler vokser eksponentielt (eller omkring 70% konfluens) i 35 mm-fatet ble erstattet med 2 ml Leibovitz s L15 (0,5% FBS) medium inneholdende 10 nM vinblastin og dyrket i 4 timer. Etter tilsetning av hvert legemiddel, ble det time-lapse film tatt hvert 15. minutt i 4 timer. Den apoptotisk død bare «forhånds arrestert» mitotiske celler, som er identifisert av runde morfologi ved tid 0, ble scoret og betegnet som «mitotisk død» (se figur S4). Den ikke-mitotisk celledød ble definert som de adherente og flate celler (medikament-eksponerte interfase-celler) døde i løpet av de neste to rammer (i løpet av 30 minutter). Den apoptotisk død «nylig arrestert» mitotiske celler i løpet av time-lapse imaging ble ikke telles. For å fastslå effekten av Celastol på mitotiske celler, vi synkronisert og beriket mitotiske HeLa-H2B celler ved «dobbel-tymidin block» [17]. I korthet ble cellene dyrket til 20-30% konfluens og dyrket i 19 timer i nærvær av tymidin (2 mM) og inkubert i 10 timer uten tymidin. Den andre blokken ble utført ved å dyrke i 17 timer med tymidin (2 mM). Cellene ble vasket og inkubert i 5 timer uten tymidin, og mediet ble erstattet med Leibovitz s L15 (0,5% FBS) medium. Cellene ble dyrket i ytterligere 4 timer før du legger Celastrol, og skjebnen til mitotiske celler ble sporet av time-lapse film.
Resultater
Celastrol hemmer cellemigrasjon
Celastrol er en av de aktive forbindelser avledet fra plante ekstrakter, som tradisjonelt brukes for å behandle de inflammatoriske symptomene [18]. Rekruttering av immunceller til området av betennelse foran en kaskade av cellulære hendelser som fører til betennelsesreaksjoner, og hemming av denne rekrutteringen kan dempe betennelsesprosesser. Under et lite molekyl screening, ble Celastrol identifisert som en inhibitor av fMLP-indusert nøytrofil-kjemotakse (upublisert resultat). Celastrol har blitt vist å inhibere aktiviteten proteasomal og modulering av varmesjokkprotein (HSP) 90 svei [19], [20], [21]. Derfor, undersøkte vi effekten av kjente inhibitorer av disse reaksjonsveier, 17AAG til HSP90, og MG132 til proteosomet, under samme eksperimentelle omgivelser. Sammenlignet med kontrollcellene, Celastrol-behandlede nøytrofile viste en ca 50% reduksjon i migrere fart mot en gradient kilde fMLP (Movie S1 og S2). Imidlertid, ingen påvisbar effekt ble observert i nærvær av andre kjemikalier. I tillegg Gedunin, som har vist seg å inhibere HSP90 pathway lik Celastrol [20], viste også ingen hemmende effekt (figur 1A og B). Dessuten, når de ble testet i hele cellelysatet assay Celastrol viste en meget liten inhibitorisk aktivitet mot proteasomet (figur 1B). Således er effekten av Celastrol på neutrofil kjemotakse ikke forårsaket av inhibering av proteasomal aktivitet.
(A-B) Celastrol hemmer fMLP-indusert nøytrofil kjemotakse. (A) nylig isolerte humane perifere blodneutrofiler ble forbehandlet med hvert kjemikalie i 30 minutter, og deretter underkastet fMLP-medierte kjemotaksi i 20 minutter ved hjelp av EZtaxiscan. Den første og den siste bilder av videoene ble vist for hvert medikament. fMLP (100 nM), Celastrol (2 uM), 17AAG (4 uM), MG132 (10 uM), og Gedunin (20 pM) ble anvendt i den angitte kombinasjon. (B) Venstre panel er kvantifisering av migrerende hastighet på hver behandling. Høyre panel er hele cellelysatet analyse av den proteasomal aktivitet som ble behandlet med hvert medikament i 1 time. Konsentrasjonen av alle kjemikalier var 5 um. (C-D) Celastrol reduserer epiteliale kreftcelle motilitet. (C) Den konfluente HeLa-celler ble skrapet ved hjelp av et tips. Etter 10 minutter av utvinning, ble hvert medikament tilsatt og time-lapse bildene ble tatt hver 15 minutt i 150 minutter. De representative stillbilder fra den første (tid 0) og de siste tids (150) tidspunkter ble vist. For prøven av «Celastrol-wash»,-celler ble forbehandlet med Celastrol i 3 timer før skrape; og time-lapse film ble tatt i et rusfritt medium. (D) Kvantifisering av cellemigrering. Det relative migrering området over kontroll (DMSO-behandlet) ble presentert. * Indikerer p. 0,05 av student T-test
Deretter utforsket vi om dette funnet kan bli utvidet til andre celletyper. En fersk studie viste at Celastrol hemmet TNF alfa-indusert tumorcelle invasjon gjennom hemming av genekspresjon kontrollert av NF-κ B pathway [22]. Men på grunn av en lengre varighet av legemiddeleksponering i denne studien, om ikke Celastrol direkte berørt bevegeligheten av epitelceller kunne ikke fastslås. Følgelig, undersøkte vi den direkte effekten av Celastrol på tumorcellemigrasjon ved hjelp av en sårtilheling analysen. Den konfluente Hela celler ble skrapet, og time-lapse bilder av migrasjon mot de sårede området ble tatt. I samsvar med dens virkninger på nøytrofile chemotaxis, Celastrol effektivt hemmet cellemigrasjon, i gjennomsnitt 60% reduksjon over tid løpet av 150 minutter (Movie S3 og S4). For å utelukke muligheten for at dette hemmende effekt skyldes den generelle celle toksisitet, vi pre-behandlede celler med Celastrol for 3 timer. Ved fjerning av medikamentet, ble migrasjon kapasiteten av celler fullt gjenopprettet, noe som indikerer denne inhiberende effekt var reversibel og er ikke forårsaket av generell toksisitet (figur 1C og D). Lignende med det som ble observert i nøytrofiler, inhibering av enten proteasom-reaksjonsveien eller HSP90 ikke hadde noen hemmende virkning under denne eksperimentelle tilstand (figur 1C og D). Disse resultatene indikerer tilstedeværelse av cellulære mål (r) av Celastrol, ufølsomme overfor hemming av proteasomet eller HSP90 svei.
Celastrol svekker mitotisk progresjon ved inhibering av kromosomet oppstilling
Den dynamiske og koordinert regulering av cytoskjelettet nettverk, for eksempel aktin filamenter og mikrotubuli, er avgjørende for å migrere celler. De inhiberende virkninger på cellemigrering i både nøytrofile kjemotakse og epitelial sårhelende antyder en mulighet for at Celastrol kan forstyrre cytoskjelettet nettverket. Under mitose, MT dynamikk spiller avgjørende roller i innretting og segregering av kromosomer. Derfor undersøkte vi om unormalt i andelen av mitotiske faser på Celastrol behandling. Mens DMSO-behandlet HeLa-celler viste en tilsvarende andel av prometafase, metafase, og anaphase /telophase kromosomer, over 70 prosent av kromosomene i Celastrol-behandlede celler vises «prometafase-lignende» fenotyper (figur 2A). For ytterligere å bekrefte dette resultatet, utførte vi en prometafase-arrestasjon og frigjøringsforsøk (figur 2B). Vi først arrestert celler på prometafase av nocodazol behandling, og de arresterte cellene ble samlet ved å trykke på plate. Ved fjerning av nocodazol, blir de mitotiske spindler gjen montert, som innretter kromosomene til den metafase planet for de etterfølgende mitotiske progresjonene oppstår. Denne frigjøringsforsøk ble foretatt i nærvær av forskjellige kjemikalier for å vurdere deres virkninger på de mitotiske spindel funksjoner. I kontrollgruppen, har nesten halvparten av de arresterte cellene kommet til anaphase under 30 minutters-release (inkubasjonstiden) perioden. Imidlertid, i nærvær av Celastrol, ble hoveddelen av celler arrestert i prometafase, mens hemming av HSP90 hadde ingen effekt. Den proteasomhemmingen MG132 litt akkumulert celler i metafase (figur 2B). For ytterligere å validere disse observasjonene, utførte vi en levende avbildning av mitotiske celler (Figur 2C og D). Umiddelbart etter tilsetning av hvert kjemikalie, de prophase celler, som er identifisert av de kondens kromatider, ble fotografert mens de gjennomgår kromosom justering og segregering (Movie S5 og S6). I kontrollgruppen, de prophase cellene kommet til anaphase innen 60 minutter. Men i nærvær av Celastrol, de klarte ikke å komme videre og bodde i en prometafase lignende tilstand. I samsvar med resultatene fra prometafase-arrest og slipp eksperiment, hemming av HSP90 hadde ingen åpenbare feil. Det er bemerkelsesverdig at en langvarig inhibering av HSP90 vil påvirke mitotisk progresjon ved å svekke de centrosomal funksjonene [23], [24], [25]. Men under denne korte periode av inhibering tilstand, ble ingen åpenbar defekt detekteres. Som forventet, hemming av proteasomet forsinket progresjon til anaphase, siden dens aktivitet er nødvendig for kromosom separasjon (figur 2C og D).
(A) HEK293-celler ble behandlet med Celastrol (2 pM) i 1 time før fiksering og farging med DAPI. Mitotiske celler ble talt opp og scoret i henhold til deres kromosom morfologi. Andelen av hver mitotisk trinn i løpet av det totale antall talte celler ble presentert. (B) HeLa-celler ble behandlet med nocodazol (100 nM) i 6 timer. De stansede celler ble samlet opp ved å trykke på platen, vasket i PBS, og sådd ut i et serumfritt medium. Etter 15 minutters feste (tid 0), ble hvert medikament tilsatt og inkubert i 30 minutter før fiksering og farging med DAPI. Gjennomsnittlig antall celler i hvert trinn fra quadruplicates ble vist. «ND» indikerer den ikke-mitotisk eller døde celler. (C) HeLa-celler som over-uttrykker EGFP-H2B protein ble behandlet med angitte legemidler. Umiddelbart etter narkotika tillegg ble prophase celler identifisert og time-lapse bildene ble tatt hvert 5. minutt i 90 minutter. Den forstørrede stillbilder fra de representative filmene ble vist. (D) Oppsummeringen av time-lapse filmer for mitotisk kromosom justering i C). Graden av mitotisk progresjon av prophase celler i 60 minutter i nærvær av hvert kjemikalie ble bestemt på grunnlag av kromosomalt form, og er indikert med horisontale linjen. Tallene angir antall celler undersøkt. De representative kromosom figurer av kontrollcellene på forskjellige mitotiske faser ble vist i nedre panel som referanse.
Celastrol disorganizes mitosetråder
For å bedre forstå effektene av Celastrol på cellenivå undersøkte vi om strukturen av MT ble berørt i behandlede celler. Overraskende, ved en konsentrasjon på Celastrol (2-4 uM) som hemmet cellemigrering og kromosom innretting, har vi funnet en forholdsvis intakt MT struktur i interfase-celler (figur 3A og B). Imidlertid ble en signifikant uorden mitotisk spindel sett i mitotiske celler (figur 3 A og B). Under prometafase, de mitosetråder og de tilhørende motor proteiner hjelpe Juster kromosomer ved metaplanet. På dette trinn, bortsett fra det centrosomal lokalisering, gamma-tubulin er også lokalisert til spindlene for å hjelpe deres sammenstilling [1]. I epitel-celler, er den mitotiske spindel montert i parallell med underlaget [26]. I samsvar med denne rapporten, i de fleste av kontroll HeLa-celler (95%, n = 25), to centrosomes som visualisert ved gamma-tubulin farging ble observert i det samme fokalplan 100 x objektivlinse (figur 3A og figur S1A). Men i Celastrol-behandlede celler, spindelen lokalisering av gamma-tubulin var signifikant avskaffet (93%, n = 42/45) og planet for to poler i forhold til underlaget var sterkt forvrengt, slik at to centrosomes neppe i det samme fokus planet (78%, n = 35/45), eller å plassere dem ved siden av hverandre (22%, n = 10/45) (figur 3B og fig S1B). Disse feilene viste seg å være annerledes enn de som er forårsaket av vinblastin, en MT depolymerizer, eller Taxol en MT stabilisator, som i hovedsak påvirker polymerisering /depolymerization av MT (figur 3C og D). Denne observasjonen tyder på at Celastrol disorganizes de mitosetråder bruker en annen mekanisme.
Representanten farging av mikrotubuli (alfa- tubulin) og sentrosomen (gamma-tubulin) av inter og spindel morfologi mitotiske HeLa-celler behandlet for en time med de angitte narkotika; Celastrol (4 mm), vinblastin (10 nM), og Taxol (10 nM).
Celastrol forårsaker strukturelle defekter av tubulin
in vitro Hotell og reduserer nivået
i vivo
De Celastrol-induserte funksjonelle defekter MTS kan være forårsaket av hemming av mange cellulære faktorer. Vi har testet en mulighet for at tubulin seg selv kan være et direkte mål. Bortsett fra sin veletablerte polymerisasjon
in vitro
, noe som krever en høy konsentrasjon (over 1-2 mg /ml) og GTP, manifesterer tubulin heterodimer en rekke andre biokjemiske egenskaper, inkludert GTP-uavhengig oligomerisering , intra- og intermolekylær disulfid-binding, ikke-disulfidbinding tverrbinding, og ikke-enzymatisk spaltning [27], [28], [29], [30], [31]. Vi undersøkte om Celstrol kan påvirke noen av disse biokjemiske egenskaper. Som tidligere rapportert, inkubering av renset tubulin førte til oligomerisering (eller høymolekylære komplekser) påvisbar på et ikke-reduserende tilstand (figur 4A). De fleste, men ikke alle av disse oligomerer forsvant i en reduserende tilstand (figur S2A). Mengdene av gjenværende tubulin oligomerer var variable i hvert forsøk, og kan representere SDS-resistente og ikke-disulfid tverrbundet tubulins [31]. Tilsetningen av GTP, som stabiliserer tubulin struktur, men ikke ATP, økt nivå av oligomerer i begge HEK293-cellelysatene og rensede tubulins, noe som indikerer denne oligomerisering kan kreve en viss grad av strukturell stabilitet (figur S2B). Ved hjelp av denne analysen med HEK293 cellelysat, har vi funnet at Celastrol hemmet dannelsen av tubulin oligomerer, mens 18 beta-glycyrrhetic syre (18-βGCA), en triterpene strukturelt ligner på Celastrol, viste en mye svakere hemmende effekt (figur 4A). En tilsvarende inhiberende effekt ble også observert når renset tubulin ble anvendt (figur S3).
(A) HEK293-cellelysatene ble inkubert i nærvær av den angitte mengde av Celastrol eller 18-beta GCA i 15 minutter før SDS-PAGE i ikke-reduserende tilstand. Membranen ble blottet med alfa-tubulin (øverst) eller beta-tubulin-antistoff (nederst). (B) Cellelysatene fra kontroll HEK293-celler ble fremstilt og likt delt i fire forskjellige rør, og immunoutfelling ble utført med et polyklonalt alfa-tubulin-antistoff i nærvær av DMSO eller indikert mengder Celastrol. Etter SDS-PAGE, ble immunkomplekset utslettet med monoklonalt museantistoff mot alfa-, beta-, eller gamma-tubuln. Mengden av alfa-tubulin (øvre panel) tjener som en lasting kontroll. (C) Den immunpresipitering og Western blot ble utført som beskrevet i B) i nærvær av forskjellige kjemikalier. (D) HEK293-celler ble behandlet med angitte mengder Celastrol i 1 time, og hele cellelysater ble analysert for de angitte cellulære proteiner. De samme Lysatene ble utslettet med fosfor-CDK substrat antistoff (høyre panel).
Denne hemmende effekt kan skyldes destabilisering (dvs. utfoldelsen) av tubulins i nærvær av Celastrol. Dersom dette er tilfelle, så Celastrol kan forstyrre den dimere interaksjonen mellom alph- og beta-tubulin. For direkte å teste denne muligheten, vi først fremstilt cellelysater fra kontroll HEK293-celler, og den alfa-tubulin ble immunoutfelt med et polyklonalt antistoff i nærvær av forskjellige mengder av Celastrol. Graden av beta og gamma-tubulin i den resulterende immunecomplex ble undersøkt. Intriguingly, ble mengden av beta-tubulin redusert i en Celastrol-doseavhengig måte, mens det av gamma-tubulin forble stort sett upåvirket (figur 4B). Når de ble testet under samme eksperimentelle tilstand, den andre MT stoffer viste ingen slik effekt (figur 4C), som indikerer at Celastrol kan påvirke den strukturelle integritet av tubulin heterodimeren.
biogenese av tubulin heterodimer er strengt regulert, og den skadede tubulins er utsatt for nedbrytning eller resirkulering bane som involverer tubulin-spesifikke kofaktorer [32].
