Abstract
Flere studier antydet at type 2 diabetes mellitus og insulin resistens er assosiert med økt tykktarmskreftrisiko. Nylig studier tyder på at metformin kan redusere risikoen for kreft hos diabetikere eller ikke-diabetikere med uklare mekanismer. Dette arbeid rettet for å bestemme effekten av metformin på kjemisk-indusert koloncancer i mus. Tykktarmskreft ble indusert ved bruk av 1,2-dimetylhydrazin (DMH, 20 mg /kg /uke, s.c.) for femten uker. Eksperiment I: friske mus ble foret med basal diett i fire uker, og deretter fordelt i syv grupper, (i) saltoppløsning, (ii) DMH, (iii) oxaliplatin, (iv-v): metformin (100 eller 200 mg /kg) og (vi-vii): oxaliplatin + metformin (100 eller 200 mg /kg), respektivt. Eksperiment II: diabetes mellitus type 2 ble indusert ved injeksjon av STZ (30 mg /kg) etter fire uker med høyt fettinnhold mating og deretter ble musene allokert til syv grupper tilsvarende til de som er rapportert i eksperiment I. Undersøkelse av tarmvev ved slutten av forsøket markert økning i angiogene markører og celleproliferasjon og viste en større immunfarging for insulin vekstfaktor i-reseptorer og CD
34 i tykktarmen hos diabetiske mus sammenlignet med ikke-diabetikere. Generelt, metformin downregulated tumor angiogenese og øket antitumoreffekten av oksaliplatin. Totalt sett er dagens resultater viste at metformin beskyttet mot DMH-indusert tykktarmskreft i ikke-diabetikere og diabetiske mus. Dette terapeutiske effekten var, i hvert fall delvis, tilskrives sin anti-angiogene og anti-proliferative mekanismer
Citation. Zaafar DK, Zaitone SA, Moustafa YM (2014) Rolle Metformin undertrykke 1,2- dimetylhydrazin-indusert tykktarmskreft hos pasienter med og uten diabetes Mus: Effekt på tumor Angiogenese og celleproliferasjon. PLoS ONE 9 (6): e100562. doi: 10,1371 /journal.pone.0100562
Redaktør: Rafael Aldabe, Centro de INVESTIGACION en Medicina Aplicada (CIMA), Spania
mottatt: 24 januar 2014; Godkjent: 29 mai 2014; Publisert: 27 juni 2014
Copyright: © 2014 Zaafar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en gruppe sykdommer preget av ut- av-kontroll-cellevekst. Globalt er tykktarmskreft den tredje vanligste diagnosen kreft hos menn og den andre hos kvinner. Tykktarmskreft er den nest største årsaken til kreftdød i utviklede land [1]. Kolorektal kreft begynner i slimhinnen i tarmen og hvis venstre ubehandlet, kan det vokse inn i muskellagene under, og deretter gjennom tarmveggen.
type 2 diabetes mellitus har vært knyttet til økt risiko for kreft [ ,,,0],2]. Spesielt høyere forekomst av lever [3], tykktarm [4] og livmor [5] kreft. En meta-analyse ble utført av publiserte data på sammenhengen mellom diabetes og forekomsten samt dødelighet av tykktarmskreft [4]. Faktorene som ligger til grunn den økte risikoen er postulert men aldri helt klarlagt i den medisinske litteraturen.
Angiogenese er prosessen med å generere nye kapillære blodårer. Uregulert angiogenese kan forårsake forskjellige sykdommer [6], slik som tumorvekst og metastase [7]. En voksende svulst trenger kapillærer for å gi næring og oksygen. Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), en viktig formidler av vaskulær permeabilitet og angiogenese, potenserer mikrovaskulær hyperpermeabilitetsprosesser, som kan gå forut for og følge med angiogenese [8]. VEGF ble funnet å være høyere i sera fra barn og voksne med type 1 diabetes mellitus, [9] og spiller en viktig rolle i vaskulære sykdommer, inkludert vekst av tumorer i diabetes mellitus [10]. Akselerert progresjon av kreft ble observert i henhold til diabetikere og /eller hyperglykemiske tilstander hos mus [11].
Det er en sammenheng mellom insulin og kreft, induserer hyperinsulinemi proliferative vev abnormaliteter fordi insulin har en sterk anabol effekt, noe som resulterer i stimulerte DNA-syntese og celledeling [12]. Denne effekten kan også forklares ved tverr aktivering av insulin-lignende vekstfaktor-I (IGF-I) reseptorfamilien [13]. IGF signaleringssystemet spiller en viktig rolle i human kreft og IGF-reseptor (IGF-R) er et attraktivt mål medikament mot hvilken en rekke av nye anti-tumormidler blir utviklet [14]. Epidemiologiske studier har vist en kobling mellom forhøyet IGF nivå og utvikling av faste tumorer slik som kolon, bryst og prostatacancer [15]. Det er uklart om IGF-I er en årsaksfaktor ved kolorektalkreft [16].
Metformin er vurdert, i tillegg til livsstilsendring, som et første-linje behandling modalitet for type 2 diabetes mellitus [16]. Av interesse, tidligere store case-control studier viser at diabetespasienter som behandles med metformin hadde en lavere forekomst av kreft enn de som ble behandlet med andre diabetiker narkotika [17] – [19]. Diabetiker pasienter med brystkreft behandlet med metformin opplevd høyere patologiske komplett responsrater med neoadjuvant kjemoterapi enn gjorde de som ble behandlet med andre diabetes medisiner [20]. Diverse mekanismer for kreft risikoreduksjon har vært en teori [21].
Den aktuelle studien var designet for å sammenligne alvorlighetsgraden av eksperimentelt indusert tykktarmskreft hos pasienter med og uten diabetes mus. Videre ble rollen som metformin i behandling DMH-indusert tykktarmskreft undersøkes hos pasienter med og uten diabetes mus med fokus på dens effekt på tumor angiogenese og celledeling. Derfor, noen av mekanismene for den antatte antitumor aktivitet av metformin kan bli markert.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle de eksperimentelle protokoller ble godkjent av Forskningsetisk Utvalget ved fakultet for farmasi, Suezkanalen University.
forsøksdyr
Menn sveitsiske albino mus som veide 28-35 g ble levert av Modern veterinærkontoret for forsøksdyr (Kairo, Egypt). Musene ble huset i grupper på ti i polyetylen bur under kontrollerte laboratorieforhold og normalt mørk /lys syklus. Musene ble akklimatisert seg en uke før du starter eksperimentet. Vann og fôringredienser ble gitt ad libitum i løpet av studieperioden.
Narkotika og kjemikalier
Metforminhydroklorid ble vennlig levert av Sigma Pharmaceutical Co. (Quesna, Egypt) og oppløst i destillert vann. Oksaliplatin (oksaliplatin, Hospira Inc., IL, Australia) ble nylaget hver uke. Streptozotocin (STZ) og 1,2-dimetylhydrazin (DMH) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (MO, USA). STZ ble nylaget i citratbuffer (0,1 M, pH = 4,5) men; DMH ble fortynnet med fosfat-bufret saltløsning. De fôringredienser som smult og sukrose ble anskaffet fra kommersielle kilder. Sitronsyre og natriumsitrat ble levert av ADWIC Selskapet kjemikalier (Kairo, Egypt).
Induksjon av diabetes og estimering av insulinresistens ved å HOMA-IR-indeksen
Mus i eksperiment II ble matet med en høy-fett diett (HFD) som ble fremstilt ved blanding av 20% sukrose (vekt /vekt) og 10% smult (vekt /vekt) i basal diett (BD) i fire uker. Deretter ble musene fastet over natten og deretter mottok en enkel injeksjon med STZ (30 mg /kg, i.p.) [22] i et volum på 5 ml /kg (Fig.1). Syv dager etter STZ administrasjon, ble musene fastet over natten og blodsukkernivået ble bestemt ved bruk av One Touch Ultra Mini glukosemåler (USA). I tillegg ble en blodprøve tatt ut fra hver mus fra orbital sinus for å oppnå serumprøvene som ble holdt ved -80 ° C og deretter benyttet for bestemmelse av seruminsulinnivå ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) Sett for insulin ( Biorbyt, UK) i henhold til produsentens protokoller. Insulinresistens ble estimert ved hjelp homeostasemodellberegningen for insulinresistens (HOMA-IR) indeks som bruker formelen tidligere beskrevet av Mathew et al. [23], HOMA-IR indeks = [fastende glukose (mmol /L) x fastende insulin (uU /ml)] /22,5).
DMH ble administrert som (20 mg /kg /uke, sc) . Metformin (100 eller 200 mg /kg /dag) ble gitt oralt. Oksaliplatin ble administrert ukentlig i en dose som tilsvarer 4 mg /kg /uke (i.p.). BD: basal diett, HFD: fettrik diett, DMH: 1,2-dimethyhydrazine. Alle forsøksgruppene fikk DMH før de angitte behandlingene unntatt saltvann grupper.
Induksjon av tykktarmskreft
For induksjon av tykktarmskreft, mus ble injisert subkutant med DMH (20 mg /kg /uke, kroppsvekt) for femten uker [24]. Behandling med DMH i gang en uke etter STZ injeksjon (ie) etter estimering av blodglukose og fortsatt i femten uker (fig. 1).
Behandlin
behandling med metformin ble startet etter slutt i løpet av DMH (dvs. i begynnelsen av uken 21). Metformin behandling (100 eller 200 mg /kg) [25] ble fortsatt i de neste fire uker, til musene ble avlivet ved slutten av det terapeutiske perioden (slutten av uke 24) (fig. 1). Mus ble overvåket daglig for en hvilken som helst ubehag og veies hver tredje dag for å kontrollere tumorvekst. For kombinasjonsterapier, oksaliplatin behandling (4 mg /kg, ip) ble gitt på dag 7, 14, 21 og 28 i tillegg til den daglige metformin behandling.
Eksperimentelle grupper
Den aktuelle studien ble utført på to separate sett av mus; syv grupper hver. Hver gruppe startet med ti mus.
Experiment I.
Det ble gjennomført på sunne (
ikke-diabetiker
) mus. Mus ble foret med basal diett i fire uker, og deretter fordelt i syv grupper, (i) Saline, (ii) DMH, (iii) DMH + oksaliplatin, (iv): DMH + metformin (100 mg /kg), (v) : DMH + metformin (200 mg /kg), (vi): DMH + oxaliplatin + metformin (100 mg /kg) og (vii):. DMH + oxaliplatin + metformin (200 mg /kg)
eksperiment II.
Det ble gjennomført på
diabetiske
mus. Type 2 diabetes mellitus ble indusert ved å injisere et lavt på STZ (30 mg /kg) etter fire ukers foring med HFD som nevnt tidligere, og deretter ble musene inndelt i syv grupper tilsvarende de som er vist i eksperiment I (fig. 1).
Begrunnelse for dose og tidsplan for metformin behandling
En typisk menneskelig behandling dose av metformin er 1000-2500 mg, vanligvis gitt to ganger daglig. I den foreliggende undersøkelse ble metformin (100 og 200 mg /kg) som benyttes, og dette kan oversettes til den menneskelige tilsvarende dose ved hjelp av Reagan-Shaw-metoden [26]. I henhold til formelen human ekvivalent dose (mg /kg) = dyr dose (mg /kg) x dyr (km) /human (km). Km for en 60 kg voksne mennesker er lik 37 og for en 20 g mus er lik 3. Således human tilsvarer murin dose på 100 og 200 mg /kg er 486 og 973 mg for en gjennomsnittlig størrelse på 60 kg voksent menneske. Derfor er alle de valgte doser i foreliggende studie er plassert innenfor sikkerhets terapeutiske området registrert hos mennesker.
Videre er den foreliggende undersøkelsen bestemmes den terapeutiske periode for å være 4 uker for å teste den antitumoreffekt av metformin. Dette var forenlig med de terapeutiske perioder som er rapportert i tidligere studier. For eksempel Ramandeep et al. (2011) studerte virkningen av en tre-ukers behandlingsregime av metformin (100 og 200 mg /kg /dag, p.o.) i å undertrykke ovarial cancer [27]. En kortere varighet er designet av Liu et al. (2013); forfatterne bestemmes virkningen av metformin (250 mg /kg, i.p.) for femten dager mot renal cell carcinoma in vivo xenotransplantater [28]. En annen studie testet effekten av metformin (600 mg /kg /dag) i 21 dager etter inokulering av B16 melanomceller [29].
Oksaliplatin ble brukt til å være en adjuvant behandling med 5-fluorouracil i kolorektal karsinom behandlings , og det er en moderat effektivt medikament for behandling når det brukes alene, som oksaliplatin har produsert responsrate på 12% til 24% hos pasienter med tidligere ubehandlet avansert kolorektal kreft, og 10% til 11% hos pasienter med residiverende eller refraktær avansert kolorektal kreft . I fase II-studier, oksaliplatin kombineres med 5-fluorouracil, med eller uten folinsyre, var forbundet med responsrate på 60%. Derfor ble det antatt at det milde til moderate effekt i behandling av denne type kreft vil tillate forventet effekt av metformin å bli identifisert [30].
Blodprøvetaking og prøveopparbeidelse
På slutten av eksperimentet ble musene bedøvet med tiopental natrium (50 mg /kg, ip) og drept ved halshugging. Blodprøver ble tatt ved hjertepunktur og sentrifugert ved 2000 x
g
i 15 minutter, – i løpet av 30 min etter oppsamling av blodprøver. Deretter sera ble separert og oppsamlet i to rene Eppendorf-s-rør og oppbevares ved -20 ° C inntil anvendt for ELISA-analyser. I tillegg ble vevsprøver fra tykktarmen dissekert og fiksert i fosfatbufret formalin (4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer, pH = 7,2) over natten og deretter innstøpt i parafin voks. Alle parafininnstøpte seksjoner ble kuttet ved 4-mikrometer tykkelse og venstre for å tørke over natten. Seksjonene ble deretter deparaffinized, rehydrert og klargjort for histopatologiske farging med hematoxylin og eosin (H E). Flekken for rutinemessig undersøkelse gjennom lyset elektrisk mikroskop [31]
Fastsettelse av serum IGF-1 og VEGF med ELISA kits
Serum IGF-1 ble bestemt ved hjelp av musen IGF-1 ELISA kit (Biorbyt, UK), mens VEGF ble bestemt ved hjelp av musen VEGF ELISA kit (Sun Red Biotechnology Company, Shanghai, Kina); begge ble bestemt i henhold til instruksjonene fra produsenten. Reaksjonene ble vurdert ved å måle den optiske tettheten ved hjelp av en automatisert ELISA-leser ved 450 nm
Histopatologisk undersøkelse av tykktarmen vev
Vev seksjoner farget med H . E ble undersøkt ved hjelp av et lysmikroskop. Hver vev seksjon ble først sett på lav effekt (× 10 forstørrelse). Mens ble scoring utført blindt av en erfaren patolog på en høyere makt (× 40 forstørrelse). Tumorceller i tykktarmen ble evaluert ved å bruke et morfometrisk punkt-telleprosedyre. Gradering ble gjennomført i henhold til graden av dysplasi av celler som er et avvik fra normal struktur, hyperplasi som øker enn den normale størrelse av cellene, inflammatoriske reaksjoner i slimhinnen som er kjennetegnet ved inflammatoriske celler infiltrasjon inflammatoriske celler aggregering i fokal måte , lymfoid spredning, opphopning av blodkar og fibrose. 0 = fri fra dysplasi, hyperplasi og betennelsesreaksjoner, 1 = ingen dysplasi eller hyperplasi men mild inflammatorisk reaksjon presenterer, 2 = moderat inflammatorisk reaksjon med eller uten dysplasi, 3 = alvorlig betennelsesreaksjon med dysplasi eller hyperplasi eller begge deler, 4 = en svært bryte betennelsesreaksjon med fibrose og dysplastisk og hyperplastisk aktivitet.
Immunohistochemistry og bildeanalyse
I korthet ble immunostainig utført ved hjelp av streptavidin-biotin-immunoperoxidase kompleks metode med 4-mikrometer tykke seksjoner som har blitt deparaffinized og oppvarmet i 0,01 M citrat-bufferoppløsning (pH = 6) i 15 min for antigen gjenfinning. Seksjonene ble deretter inkubert over natten med kanin polyklonale antistoffer mot IGF-reseptor type 1 (IGFR-1) (Biorbyt, UK), mus monoklonale antistoffer mot CD
34 (Bio SB, Santa Barbana, USA) og kanin polyklonale antistoffer mot ki- 67 (Abcam, Cambridge, UK) ved 4 ° C. Etter konjugering med streptavidin-biotin-peroksidasekompleks (bredt spektrum LAB-SA deteksjonssystem, Invitrogen), ble 3,3-diaminobenzidin (DAB, Sigma-Aldrich, MO, USA) anvendt som et kromogen og Mayers hematoxylin ble brukt som en counterstain . Deretter ble vevssnitt undersøkt ved hjelp av et lysmikroskop og photomicrographs ble tatt og analysert ved hjelp av ImageJ programvare utviklet av National Institute of Health (Bethesda, Maryland, USA). Kort fortalt, den positive DAB fargede området, som representerer positive området, i hvert digital mikrofotografiet ble automatisk atskilt fra hematoxylin, som representerer det totale arealet, ved hjelp av farger deconvolution plugin. Bilder ble deretter behandlet i binær fargebilde (sort og hvit). Prosentandelen av positivt farget område (representert ved den sorte farge) ble så bestemt. Immunoreaktivitets for IGFR-I, CD
34 og Ki-67 ble evaluert i ti påfølgende avsnittene representant til hele vev seksjon i hver.
Statistisk analyse
Alle resultater ble ordnet og uttrykk som gjennomsnitt ± SEM For parametere med Gaussian distribusjon, sammenligninger mellom grupper ble utført ved hjelp av toveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukey sin
post-hoc
test som to uavhengige variabler er i samspill. Mens parametere med ikke-gaussisk fordeling, som for eksempel histologiske score, ble utført ved Kruskal-Wallis test (ikke-parametrisk ANOVA) etterfulgt av Dunnetts test for multiple sammenligninger. Overlevelseskurver ble plottet for de eksperimentelle gruppene i de to eksperimenter og antall overlevende mus ble sammenlignet ved bruk av Chi-square-test. Uparet student
t
test ble brukt til å oppdage forskjellen mellom to grupper når det passer. Dataanalyse ble utført ansette statistikkpakke for samfunnsvitenskap, versjon 17 (SPSS Software, SPSS Inc., Chicago, USA). Alle
P
verdier rapportert er tosidige og
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Resultatene fra dagens eksperiment viste at injeksjon av DMH induserte 30% dødelighet hos ikke-diabetikere mus versus 40% dødelighet hos diabetes mus. Behandling med oksaliplatin og /eller metformin ikke endre antallet overlevelse i ikke-diabetiske mus (fig. 2). Men i diabetiske mus, monoterapi med metformin (200 mg /kg) økte antall overlevende mus i forhold til diabetiker /DMH gruppen (90% vs. 60%,
P
. 0,05, fig 2) . Overlevelseskurven indikerte at noen dødelighet ble registrert i løpet av DMH behandlingen (uke 6-20) imidlertid; flest dødelighet ble registrert ved terapeutisk perioden (uke 21-24).
Antall overlevende mus i ikke-diabetikere grupper (øverst til venstre panel) og hos diabetikere grupper (panel øverst til høyre) ved forskjellig tid peker samlet i løpet av eksperimentet. Det nedre diagram viser den endelige antall av de overlevende musene ved slutten av eksperimentet (slutten av uke 24). Mus [bortsett fra saltgruppe] ble injisert med 1,2-dimetylhydrazin (DMH) ukentlig i 15 Nr å indusere tykktarmskreft så behandlet med oksaliplatin og /eller metformin (100 eller 200 mg /kg) i 4 uker. Data er uttrykt som absolutte antall (av ti) og analysert ved hjelp av khikvadrattest på
P
0,05. * Signifikant forskjellig fra saltgruppe.
#Significantly forskjellig fra DMH gruppe.
$ signifikant forskjellig fra oksaliplatin gruppe.
≠ signifikant forskjellig fra metformin (100 mg /kg) gruppe.
× signifikant forskjellig fra metformin (200 mg /kg),
n = 10 ved begynnelsen av eksperimentet
.
I slutten av uke 4 var gjennomsnittlig baseline kroppsvekt av alle mus i eksperiment II var betydelig høyere enn det som registreres i eksperiment i (35,71 ± 2,9 vs. 30,16 ± 2,78,
P
0,05). Men ved slutten av studien (slutten av uke 24), måling av prosent endring i kroppsvekt markert ingen forskjell mellom mus både i eksperiment I og II (tabell 1A 0,05). I forsøk I, monoterapi med metformin (100 eller 200 mg /kg), så vel som dens kombinasjoner med oksaliplatin ikke produsere en endring i den beregnede HOMA-IR-indeks sammenlignet med deres saltløsning kontroll. I motsetning til i eksperiment II, disse farmakoterapier redusert den beregnede HOMA-IR-indeksen i forhold til diabetiker /saltvann kontroll (tabell 2A B).
Videre serum IGF-I nivå i diabetisk /saltvann gruppe var større (omtrent ni ganger) enn den som ble målt i ikke-diabetiske /saltvannsgruppe (4578 ± 454 vs. 536 ± 54,
P
0,05, tabell 2). Den nåværende Resultatene viste at gjentatt DMH injeksjon resulterte i en reduksjon i serum-IGF-I nivå sammenlignet med saltvannskontroll i begge forsøk I og II. I ikke-diabetiske mus, monoterapi med oksaliplatin eller metformin (100 eller 200 mg /kg) ga en ytterligere reduksjon i serum IGF-I nivå sammenlignet med ikke-diabetikere /DMH gruppe, men kombinasjonen 1 og 2 ikke produsere en lignende nedgang i serum IGF-i nivå. På den annen side, diabetiske mus behandlet med metformin (100 eller 200 mg /kg), så vel som kombinasjonen en gruppen viste en signifikant økning i serum-IGF-I nivå sammenlignet med diabetes /DMH gruppe (tabell 2).
De foreliggende resultater viser at serum VEGF nivået i ikke-diabetiske /DMH gruppen var ikke signifikant høyere enn ikke-diabetiske /saltvann-gruppen (612 ± 54 vs. 516 ± 46, fig. 3). I den ikke-diabetiske mus, alle de gjennomførte farmakologiske midler i stand til å redusere VEGF-nivået sammenlignet med ikke-diabetiske /DMH kontroll (Fig. 3). Videre monoterapi med metformin (200 mg /kg) eller dens kombinasjon med oxaliplatin (kombinasjon 2) viste lavere serum VEGF nivå sammenlignet med monoterapi med oksaliplatin (
P
. 0,05, figur 3).
Effekt av oksaliplatin og /eller metformin (100 eller 200 mg /kg) på serum-IGF-i (panel A) og serum VEGF (panel B). Mus [bortsett fra saltgruppe] ble injisert med 1,2-dimetylhydrazin (DMH) ukentlig i 15 Nr å indusere tykktarmskreft så behandlet med oksaliplatin og /eller metformin (100 eller 200 mg /kg) i 4 uker. DMH: 1,2-dimetylhydrazin, IGF-I: insulin vekstfaktor-I, VEGF: vaskulær endotelial vekstfaktor. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. og analysert ved hjelp av to-veis ANOVA etterfulgt av Tukey sin
post-hoc
test på
P
. 0,05 * signifikant forskjellig fra salt gruppe.
#Significantly forskjellig fra DMH gruppe.
$ signifikant forskjellig fra oksaliplatin gruppe.
≠ signifikant forskjellig fra metformin (100 mg /kg) gruppe.
× signifikant forskjellig fra metformin (200 mg /kg),
n = 5-6
.
Viktigere, serum VEGF nivå var større i diabetiker /saltvann gruppen sammenlignet med ikke-diabetiker /saltvann gruppe (680 ± 60 vs. 516 ± 46,
P
0,05, fig. 3). I forsøk II, gjorde diabetiker /DMH gruppe ikke viser en betydelig endring i serum VEGF nivå i forhold til diabetiker /saltvann gruppe. Videre monoterapi med metformin (100 eller 200 mg /kg) og dens kombinasjon med oxaliplatin produsert en reduksjon i serum VEGF nivå sammenlignet med diabetes /DMH gruppen, men monoterapi med oksaliplatin ikke klart å produsere en lignende effekt (Fig. 3B). Videre VEGF-nivået var lavere i mus behandlet med metformin (100 mg /kg) og i kombinasjon 2 gruppe sammenlignet med mus behandlet med oksaliplatin monoterapi (fig. 3-b).
Etter markberedning på mus, var lesjoner generelt ikke visualisert ved grov undersøkelse. Men histologisk undersøkelse avslørte at tykktarmsslimhinnen viste hyperplastiske og dysplastiske epiteliale lesjoner og avvikende krypten foci. Distale tarmslimhinnen med avvikende krypten foci var vanskelige å bli identifisert fra normal slimhinne. Histopatologiske endringer ble detektert ved høy forstørrelse; Det var en diffus forstyrrelse av kolon mukosa. Videre er intramucosal foci ble cellene hypercellular, som består av et stort antall uorganisert epitelceller; kjernene var store og hyperchromatic. Isolerte øyene preneoplastiske celler som ble avledet fra epitel ble observert med karakteristisk leukocyttisk infiltrasjon. Krypter ble arrangert i en tett pakket måte (fig 4A).
a) Mikrofotografier fra de eksperimentelle gruppene. Kolon av ikke-diabetiske /saltholdige mus som viser normal histopatologisk struktur av slimhinnen med kjertelstrukturen (g) og den underliggende submucosa og muskulære laget x 40. Colon av diabetisk /saltvann mus som viser fokus lymfoid aggregering i slimhinnen (pil) med avskalling av mucosal epitel og kjertelstruktur × 40. Colon fra ikke-diabetiker /DMH gruppe viser cystisk utvidelse av kjertelstruktur med mild dysplastiske fôr epitelceller og lunger i blodkar (pil) × 80. Colon av diabetiske /DMH mus som viser fokus lymfoid celleproliferasjon erstatte slimhinnen × 40. Colon av ikke-diabetikere /DMH mus behandlet med oksaliplatin som viser fokusområdet disfiguration med betennelsesceller infiltrasjon i slimhinnen × 80. Colon av diabetiske /DMH mus behandlet med oksaliplatin viser inaktive fôr epitel med flate kjerner og noen betennelsesceller infiltrasjon i mellom × 80. Tykktarm av ikke-diabetiske /DMH mus behandlet med metformin (100 mg /kg) Viser midt lymfoid hypoplasi i slimhinnen x 80. Kolon av diabetiske /DMH mus behandlet med metformin (100 mg /kg) viser enormt antall inflammatoriske celler infiltrasjon i lumina propria av slimhinnen med hyperplasi og dysplasi i slimhinnen epitel av kjertelstrukturen x 40. Colon av ikke-diabetikere /DMH mus behandlet med metformin (200 mg /kg) som viser betennelsesceller infiltrasjon og fibrose i lamina propria mellom kjertlene × 80. Kolon av diabetiske /DMH mus behandlet med metformin (200 mg /kg) som viser degenerering av kjertel foring epitel med tap av kjernene x 80. Tykktarm av ikke-diabetiske /DMH mus behandlet med en kombinasjon av oksaliplatin og metformin (100 mg /kg) som viser lymfoid proliferasjon i slimhinnen x 80. Kolon av diabetiske /DMH mus behandlet med en kombinasjon av oksaliplatin og metformin (100 mg /kg) som viser aktiv kjertel struktur med foring epitel av runde kjerner x 40. Tykktarm av ikke-diabetiske /DMH mus behandlet med en kombinasjon av oksaliplatin og metformin (200 mg /kg) som viser inflammatoriske celler infiltrering inn mellom kjertelstrukturen x 80. Kolon av diabetiske /DMH mus behandlet med en kombinasjon av oksaliplatin og metformin (200 mg /kg) viser et enormt antall lymfoide celle erstatte lamina propria i slimhinnen x 40. (X 40 = 240,19 m og x 80 = 238,2 nm. B) En stolpediagram som viser en histopatologisk poengsum i tykktarmen vev av ikke-diabetikere og diabetiske mus. Mus [bortsett fra saltgrupper] ble injisert med 1,2-dimetylhydrazin (DMH, 20 mg /kg /uke) for femten uker for å indusere tykktarmskreft så, behandlet med oksaliplatin og /eller metformin (100 eller 200 mg /kg) for ytterligere fire uker. Resultater er uttrykt som midlere og analysert ved hjelp av ikke-parametrisk Kruskal-Wallis test (ikke-parametrisk ANOVA) etterfulgt av Dunnetts test for multiple sammenligninger. * Signifikant forskjellig fra saltgruppe.
#Significantly forskjellig fra DMH gruppe.
$ signifikant forskjellig fra oksaliplatin gruppe.
≠ signifikant forskjellig fra metformin (100 mg /kg) gruppe.
× signifikant forskjellig fra metformin (200 mg /kg) gruppe,
n = 5-6
.
Statistisk analyse viste en signifikant forskjell i histologisk poengsum mellom diabetiker /DMH gruppe og ikke-diabetiske /DMH gruppe (fig. 4B). I ikke-diabetiske mus, ingen av de gjennomførte midler reduserte histopatologisk stillingen sammenlignet med DMH kontroll (Fig. 4B). Usannsynlig, i diabetiske mus, alle de gjennomførte farmakologiske midler hell lindret den histopatologiske skår i forhold til DMH kontroll (Fig. 4B).
Figur 5A viser photomicrographs for immunhistokjemisk farging for IGFR-I i tykktarm vevsprøver. Analyse av data viste en forskjell i immunofarging for IGFR-I mellom diabetiker /DMH gruppe og ikke-diabetiske /DMH-gruppen (245 ± 15,6 vs. 210 ± 10,9, fig. 5B). I forsøk I, statistisk analyse viste at ikke-diabetiske /DMH gruppe viste større immunoreaktivitet for IGFR-I sammenlignet med ikke-diabetiske /saltvannsgruppe. Videre kan kombinasjonsterapier produserte en signifikant reduksjon i ekspresjonen av IGFR-I sammenlignet med DMH kontroll (Fig. 5B). I forsøk II, diabetiker /DMH gruppen viste større immunoreaktivitets for IGFR-I forhold til diabetiker /saltvann gruppe. Monoterapi med oksaliplatin eller metformin (200 mg /kg), så vel som de to kombinasjonsterapi ga en signifikant reduksjon i immunoreaktiviteten for IGFR-I i kolon vev sammenlignet med DMH kontroll. Viktigere, viste kombinasjonen en gruppe forskjeller fra sine tilsvarende monoterapi (Fig. 5B).
A) Mikrofotografier for kolon vev immunohistochemically farget for IGF-R1 (skala bar = 238,2 mm). B) En stolpediagram som viser den optiske tettheten for IGF-R1 farging i ikke-diabetikere og diabetiske mus. Mus [bortsett fra saltgrupper] ble injisert med 1,2-dimetylhydrazin (DMH) ukentlig i 15 Nr å indusere tykktarmskreft så behandlet med oksaliplatin og /eller metformin (100 eller 200 mg /kg) i 4 uker. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. og analysert ved hjelp av to-veis ANOVA etterfulgt av Tukey sin
post-hoc
test på
P
0,05. * Signifikant forskjellig fra saltgruppe.
#Significantly forskjellig fra DMH gruppe.
$ signifikant forskjellig fra oksaliplatin gruppe.
≠ signifikant forskjellig fra metformin (100 mg /kg) gruppe.
× signifikant forskjellig fra metformin (200 mg /kg),
n = 5-6
.
Figur 6-A viser photomicrographs for immunhistokjemisk farging for CD
34 i tykktarm vevsprøver. Det var en signifikant forskjell i immunreaktivitet for CD
34 mellom diabetisk /DMH gruppe og ikke-diabetiske /DMH-gruppen (260 ± 12,2 vs. 213 ± 6.71, fig. 6B). I forsøket jeg, immunoreaktivitets for CD
34 i oksaliplatin, metformin (100 mg /kg) gruppe og kombinasjonen 1 2 grupper var lavere enn den ikke-diabetiske /DMH kontroll (Fig. 6B). Viktigere er kombinasjonen en gruppe viste lavere CD
34 farging sammenlignet med tilsvarende tabletter. I forsøk II, alle gjennomførte behandlinger redusert optisk tetthet for CD
34 i forhold til diabetiker /DMH kontroll. Videre kombinasjonsterapi viste betydelig nedgang i farging for CD
34 i tykktarm vev sammenlignet med de tilsvarende monoterapi (Fig. 6B).
A) Mikrofotografier for kolon vev immunohistochemically farget for CD
34 (skala bar = 238,2 mm). B) En stolpediagram som viser den optiske tettheten for CD
34 farging i ikke-diabetikere og diabetiske mus. Mus [bortsett fra saltgrupper] ble injisert med 1,2-dimetylhydrazin (DMH) ukentlig i 15 Nr å indusere tykktarmskreft så behandlet med oksaliplatin og /eller metformin (100 eller 200 mg /kg) i 4 uker. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M.
