Abstract
Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er en biologisk prosess med metastatisk kreft. Men en effektiv kreftbehandling som direkte rettet mot EMT programmet ennå ikke er oppdaget. Nylige studier har indikert at mesenchymale til epitelial overgang (MET), det motsatte fenomenet EMT, er observert i fibroblaster under dannelse av induserte pluripotente stamceller. I denne studien undersøkte vi effekten av omprogrammering faktorer (RFS) på plateepitelkarsinom (SCC) celler. RFS-introdusert kreftceller (RICS) demonstrerte de forbedrede epiteliale egenskaper i morfologi med endret ekspresjon av mRNA og microRNAs. Bevegeligheten og invasive aktiviteter RICS
in vitro
ble betydelig redusert. Videre xenotransplantater av rics ikke oppviste noen lymfeknutemetastase, mens metastase ble påvist i paren SCC-inokulerte mus. Dermed konkluderte vi med at RICS gjenvunnet epiteliale egenskaper gjennom MET og viste redusert kreft
in vitro Hotell og
in vivo
. Derfor kan forståelsen av MET prosessen i kreftceller ved innføring av RFS føre til utformingen av en ny anticancer strategi
Citation. Takaishi M, Tarutani M, Takeda J, Sano S (2016) Mesenchymale til epitel Transition indusert av omprogrammering faktorer Demper malignitet av kreftceller. PLoS ONE 11 (6): e0156904. doi: 10,1371 /journal.pone.0156904
Editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, USA
mottatt: 23 desember 2015; Godkjent: 20 mai 2016; Publisert: 03.06.2016
Copyright: © 2016 Takaishi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. M. Takaishi ble støttet av det japanske utdanningsdepartementet, vitenskap, sport og kultur (https://www.jsps.go.jp/english /e-grants/index.html). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en livstruende tilstand med økende dødelighet når det metastasizes. Selv om mekanismene for kreft metastase ikke er ennå ikke fullt ut forstått, er det kjent at oppkjøpet av invasive egenskaper er drevet av epitelial til mesenchymale overgang (EMT) [1, 2]. Kreft i henhold EMT er preget av et tap av intervoksninger, en gevinst på cellemotilitet, og økt invasiv aktivitet. En viktig karakteristikk av EMT er den funksjonelle tap av vedheftningen krysset protein, E-cadherin (CDH1), gjennom flere mekanismer, inkludert genmutasjon, hypermethylation, og undertrykkelse av dets promoter [1, 3, 4].
undertrykkende transkripsjonsfaktorer for CDH1 omfatter (a) Snail familie (SNAI1 og SNAI2) [5, 6], (b) Twist familie (TWIST1 og TWIST2) [7, 8] og (c) ZEB familie (ZEB1 /dEF1 og ZEB2 /SIP1) [9-11]. Disse transkripsjonsfaktorer kan samhandle med E-boksen element i
CDH1
arrangøren, som fører til nedregulering av sitt uttrykk. Den over-ekspresjon av disse EMT-induserende gener blir ofte observert i de metastatiske kreftceller [1, 3, 4]. Tvert imot, det nedregulering av EMT-induserende genekspresjon gjen
CDH1
uttrykk og fører til dempningen av kreft gjennom en mekanisme som refereres til som mesenchymale til epitel overgang (MET), motsatt av programmet EMT [1, 12-14].
microRNAs (mirnas) er små ikke-kodende RNA som regulerer deres målgener uttrykk på post-transkripsjonsnivået og er kjent for å spille viktige roller i ulike typer kreft. Det har blitt rapportert at EMT-induserende transkripsjonsfaktorer, som undertrykker
CDH1
uttrykk, er negativt regulert av mirnas (MIR-200 familien, MIR-203, og MIR-205, etc.) [15 -17].
i løpet av genereringen av induserte pluripotente stamceller (iPSCs) fra murine fibroblaster ved innføring av fire reprogrammerings-faktorgener, Oct3 /4, Sox2, Klf4, og Myc, cellene gikk gjennom MET [ ,,,0],18, 19]. Mens iPSCs har blitt generert fra de primære celler, har nyere studier utforsket mulighetene for å omprogrammere de ondartede cellene, inkludert leukemi, sarkom, melanom og andre typer kreftceller til å stille ut en IPSC-lignende tilstand
in vitro product: [ ,,,0],20-25]. De omprogrammeres ondartede celler viste en pluripotent lignende tilstand med en endret differensieringsprogram som førte til tap av tumorgenisitet. Men det var usikkert om kreft ble svekket gjennom MET-mediert mekanisme med omprogrammering faktorer.
Dermed er målet med denne studien er å vise at de SCC cellene reduseres malignitetspotensiale
in vitro
og
in vivo
gjennom MET ved innføringen av omprogrammering faktorer uten pluripotent lignende tilstand. Disse funnene er svært relevant for å utvikle nye og effektive terapeutiske strategier for kreftbehandling.
Materialer og metoder
Generering av iPS celler ved hjelp piggyBac transposon system
Normal human epidermal keratinocytter ( NHEKs) isolert fra forhud ble hentet fra Kurabo (Osaka, Japan) og ble dyrket i Epilife II (Invitrogen) supplert med Humedia-KG (Kurabo). pCMVmPBase og plasmider som inneholder piggyBac transposon bærer omprogrammering faktorer (POU5F1 (OCT3 /4), SOX2, KLF4, cMYC, og LIN28) [26, 27] ble transfektert inn i NHEKs med NEON transfeksjon system (Invitrogen). De transfekterte NHEKs ble umiddelbart inokulert på mater celler i Primate ES Cell Medium (ReproCell, Yokohama, Japan) supplert med bFGF (4NG /ml), Y-27632 (10 mm), CHIR99021 (3 mm), PD0325901 (0,5 mm) og SB431542 (5 mm), alle disse reagenser var fra Wako rene kjemiske Industries (Osaka, Japan). Mediet ble endret til fersk en annenhver dag. ES celle som koloniene ble vist på dagene 10-14, og ble plukket og ekspandert videre på ca. dag 21. For å undersøke hvorvidt IPS-celler avledet fra NHEKs har ES-lignende fenotype ble cellene farget med alkalisk fosfatase-substrat-sett (Vector Laboratories, Burlingame, CA), og med anti-Nanog antistoff (Abcam, Cambridge, UK). De iPS celler ble inokulert i testiklene av SCID-mus (CLEA Japan, Tokyo, Japan) under anestesi og musene ble avlivet for å skjære testiklene på dag 60 etter at cellen transplantasjon. Testiklene ble fiksert med formalin og behandlet for parafin seksjon for histopatologiske undersøkelser.
Cellelinjer
Menneske SCC cellelinjer, HOC313 og TSU [28, 29], var begavet av Dr. Kamata, Institute of Biomedical Health Sciences, Hiroshima University, Japan. De OSC-19 celler og NCCIT celler ble kjøpt fra den japanske Innsamling av forsknings Bioressurser Cell Bank (Ibaraki, Japan). Alle cellelinjene ble holdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika
Innføring av omprogrammering faktorer
PiggyBac transposon vektor og transposase-ekspresjonsvektoren ble ko-transfektert til Subkonfluente SCC celler ved hjelp Fugene 6 (Roche, Basel, Sveits) reagens. To dager etter transfeksjon, ble puromycin ved sluttkonsentrasjoner på 1 ~ 5 pg /ml tilsatt til cellekulturmediet for utvalget. Cellene ble holdt i DMEM supplert med 10% FBS og antibiotika.
Cell morfologisk vurdering
forandringer i cellemorfologi ble evaluert ved beregning av lengden til breddeforhold for hver celle under et mikroskop ved hjelp 20 celler per gruppe.
kvantitativ real-time RT-PCR
de totale RNA ble ekstrahert ved hjelp av en RNAeasy kit (Qiagen, Venlo, Nederland) og ble reverstranskribert ved hjelp av tilfeldige heksamer og hevet III (Thermo Fisher Scientific). Hver cDNA ble utsatt for kvantitativ PCR ved hjelp av strøm SYBR Grønn PCR Master Mix på Sequence Detection Systems 7300 (Thermo Fisher Scientific). Relative mRNA-ekspresjon ble normalisert til ekspresjon av hypoxanthin guanin fosforibosyl transferase (HPRT). Primere som brukes i denne studien har vært oppført i S1 tabell.
Påvisning av microRNAs
De totale RNA ble fremstilt fra de dyrkede celler ved hjelp av en miRNeasy mini kit (Qiagen). I henhold til produsentens instruksjoner, ble hver mal cDNA utarbeidet med en miScript II RT kit (Qiagen) og uttrykk for microRNAs ble analysert ved hjelp av en miScript SYBR Grønn PCR kit sammen med miScript Primer analyse (Qiagen). Dette ble etterfulgt av en normalisering av miRNA med SNORD61.
MTS analysen
I alt 96-brønners plater ble ansett for studien som inneholdt 1000 celler hver, som ble sådd. En og to dager senere, MTS-reagens (Promega, Madison, WI, USA) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i to timer. Deretter absorbansen verdier ble også bestemt ved 490 nm ved hjelp av et spektrofotometer.
Immunofluorescent flekker
Celler dyrket på kammer lysbilder (Thermo Fisher Scientific) ble løst enten med 4% paraformaldehyde i PBS løsning på 4 ° C eller 100% metanol ved -20 ° C, og blokkert med serumfritt blokkerende løsning (Dako, Glostrup, Danmark). Primære antistoffer ble inkubert ved 4 ° C natten over, fulgt av vasking i PBS og inkubering med sekundære antistoffer konjugert med Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific). Kjernene ble farget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI). De primære antistoffer som brukes har vært oppført i S2 tabell. Fluorescens bilder ble tatt med et mikroskop med en CCD kamera system. (DP-71, Olympus, Tokyo, Japan)
Immunohistochemistry
parafin-embedded seksjoner hentet fra xenotransplants var deparaffinized og inkubert i 10 mM citratbuffer (pH 6,0) i 10 minutter ved 105 ° C. Snittene ble inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C, etterfulgt av vasking i PBS og inkubering med de respektive sekundære antistoff (Dako). Signalene ble visualisert ved bruk av 3,3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB). Kjerner ble kontra med hematoksylin. De primære antistoffer som brukes i denne undersøkelsen er oppført i Tabell S2.
flowcytometri
Cellesuspensjonen ble inkubert med anti-TRA-1-60 (Millipore), TRA-1-81 (Millipore ) eller muse-IgM (Bioledend) som isotype kontroll i 30 minutter på is og etterfulgt av inkubasjon med Alexa 488 fluor konjugert anti-muse-IgM-antistoff. Cellene ble analysert på en LSRFortessa flowcytometer (BD Biosciences) ved hjelp FlowJo programvare (FlowJo, Ashland, Oregon).
Elektronmikros
Fullt konfluente celler i 35 mm skåler ble fiksert med 2% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,3) og post-fiksert med 1% osmiumtetroksyd, etterfulgt av 5% sukrose i 0,1 M fosfatbuffer. Propylenoksyd ble anvendt for å oppløse de kulturskåler for å oppnå celle arkene. De ultra-tynne snitt ble observert ved hjelp av en Hitachi H-7100 elektronmikroskop (Hitachi Internett-teknologier, Tokyo, Japan).
Western blot analyse
cellelysater ble utarbeidet etter radioimmunpresipitasjonsmålinger analysebuffer (RIPA buffer, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) eller urea-løsning (9 M urea, 2% Triton-100, 5% 2-mercaptoethanol), separert på 4-15% stigning gels (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) og blottet på polyvinyldifluorid (PVDF) membraner (Bio-Rad). En ECL Prime kit (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) ble anvendt for signaldeteksjon. Antistoffene som brukes er oppført i S2 tabell. ImageJ (NIH) ble anvendt for kvantifisering av signalene.
In vitro
sårheling assay
Fullt konfluente celler i seks brønners plater ble behandlet med mitomycin C (10 ug /ml) i tre timer, etterfulgt av bunnen av såret ved hjelp av en gul mikropipette spissen og vasking med en forvarmet medium. Sårtilheling av migrerende celler ble observert ved hjelp av et fasekontrastmikroskop og ble fotografert ved de angitte tider. Avstanden av cellemigrering over såret ble målt over tid.
celle invasjon assay
In vitro
celle invasjon ble evaluert ved bruk Boyden kammere i nærvær av Matrigel belegg ( Corning, Corning, NY, USA). En total på 25 x 10
3-celler ble podet inn i de øvre kamrene i 24-brønners plater og inkubert i 24 timer. Cellene festet til membranen mellom de øvre og nedre kammer ble farget med toluidinblått og tellet under et mikroskop.
xenotransplantasjon av humane SCC-celler i de nu /nu-mus
For ortotopisk modell, de dyrkede foreldre eller omprogrammering faktorer innført OSC-19-celler, som ble suspendert i PBS ved en tetthet på 1,0 x 10
7 celler /ml. Under isofluran anestesi, 2,0 x 10
5 levedyktige celler ble inokulert i lingual margin av kvinnelige syv uker gamle BALB /c-nu /nu-mus (Japan SLC, Hamamatsu, Japan). Kroppsvekt av musene ble målt tre ganger per uke for å overvåke tilstanden til eksperimentelle sluttpunkt. Tungene og drenerende lymfeknuter ble dissekert fra avlives mus på dag 21. tunger ble fiksert med formalin og behandlet for histologisk analyse. Tumor områder i tungen vev ble beregnet under et mikroskop ved hjelp av programvare (DP2-BSW, Olympus). Total RNA ble ekstrahert fra cervical lymfeknuter, og genuttrykket av menneskelig cytokeratin 18 ble vurdert gjennom kvantitativ real-time RT-PCR. For fjernt organ metastasemodell, foreldre OSC-19-celler og RICS var suspendere i en tetthet på 1,0 x 10
6 celler /ml og 2,0 x 10
5-celler ble transplantert via halevenen til hunn nu /nu mus. Dag 47 etter transplantasjon cellen, ble musene avlivet og etterfulgt av obduksjon. Kranial flik av høyre lunge ble anvendt for mRNA-ekstraksjon og etterfulgt kvantitativ sanntids RT-PCR for å påvise gen ekspresjon av human cytokeratin 18. Venstre lunge, lever, nyre og milt ble fiksert med formalin og bearbeidet for histologisk analyse. Det ble sikret at alle forsøk med mus strengt overholdt de institusjonelle retningslinjer som er satt for å minimalisere nød til dyrene. Studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité i Kochi Medical School.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med Prism programvare (GraphPad, CA, USA) ved hjelp av en uparet Student
t
test og Fishers eksakte test.
Resultater
Innføring av omprogrammering faktorer (RFS) i SCC Cells Gjenoppretter Epitelial morfologi, men gir ikke den pluripotency
å introdusere RFS, brukte vi piggyBac transposon vektor, der
POU5F1 product: (
OCT3 /4
),
SOX2
,
KLF4
,
cMYC
, og
LIN28
ble inkludert [26, 27]. Ved hjelp av denne, kan vi lykkes generere iPS-celler (fig 1B) fra normal human epidermal keratinocytter (fig 1A). IPS cellene uttrykte alkalisk fosfatase (Fig 1 C) og Nanog (fig 1D), noe som indikerer stemness. De utviklet teratomas
in vivo Kjøpe og viste tre bakterie elementer, nemlig epitel (Fig 1 F), neural epitel (Fig 1G) og brusk (Fig 1 H). For å undersøke effekten av RFS på kreftceller
in vitro
, brukte vi tre menneskelige SCC linjer: HOC313, TSU, og OSC-19 celler. Blant dem, de to cellelinjer, HOC313 og TSU, hadde en fibroblast-lignende spindel form med øket Snail1 og redusert E-cadherin ekspresjon, noe som indikerte at SCC-celler gjennomgikk EMT [30]. Ved hjelp av dette transposon vektorsystem, ble SCC linjer introdusert RFS, som ble evaluert av western blotting (Fig 2C). Påfallende, RF-introdusert kreftceller (RICS) fra alle SCC linjene viste en drastisk morfologisk endring fra spindel til mangekantet form (figur 2A). Evaluering av celle lengde /bredde-forhold mellom foreldre SCCS og RICS åpenbart bestemt reduksjon i sistnevnte (figur 2B), noe som tyder på at MET ble også indusert i SCCS, som vist i fibroblast under induksjon av konsulentene ved RF [18, 19]. Det bør bemerkes at rics fra begge cancerlinjer ikke uttrykte TRA-1-60 og TRA-1-81, overflatemarkører for pluripotente celler, mens en teratom linje NCCIT uttrykt dem ved Western blotting (figur 2D) og flowcytometri (Fig 2E og 2F). Dette resultatet antydet at RICS ikke overta pluripotency selv etter innføringen med RFS. For å studere effekten av MET indusert av RFS vi brukte HOC313 celler og OSC-19 celler for videre etterforskning.
(A, B) Fase kontrast bilde av normale humane epidermale keratinocytter (NHEK) (A) og iPS -celler generert fra NHEK ved innføringen av piggyBac transposon vektorer (b). Barer, 200 mikrometer i A B. (C, D) IPS celler har alkalisk fosfatase aktivitet (C) og uttrykke Nanog (D), noe som tyder stemnss av menneskelig keratinocyte avledet iPS-celler. Barer, 100 mikrometer i C D. (E) teratomas ble utviklet da de iPS-celler ble inokulert i testiklene av SCID-mus. Bar, 400 mikrometer. (F-H). De teratomas havn tre bakterie lag elementer, epitel (F), nevrale epitel (G) og brusk (H), som indikerer pluripotency av iPS celler. Barer, 100 mikrometer i F, G og H.
(A) Foreldre menneskelige SCC celler (til venstre) fra HOC313 og TSU viser fibroblast-lignende morfologi; imidlertid omprogrammering faktorer innført celler (RICS, høyre panel) utviser kantet, epitel-lignende morfologi. RICS fra OSC-19 cellene vise mer hi celle koloni enn foreldrecellene. (Skala bar, 100 um) (B) Cellular morfologi er kvantifisert ved lengde til breddeforhold av hver celle fra minst 20 celler fra hver foreldre SCC-celler (åpne sirkler) og tøy av (lukkede sirkler). Forholdet mellom rics tilnærmet til en, noe som indikerer dem som epitel, mangekantformede celler. **
P
0,01 av Student
t
-test. (C) innført reprogrammerings faktorene ble undersøkt ved western blot-analyse. P, Foreldre celler. R, RICS. β-Actin (ACTB) ble brukt som lasting kontroll. (D-F) Ekspresjon av TRA-1-60 og TRA-81 ble undersøkt ved western blotting (D) og flowcytometri (E, F). De representative data og middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter flowcytometri er vist i E og F, respektivt. Hypoxantin-guanin fosforibosyl (HPRT) ble brukt som lasting kontroll i (D). Blå linjer; de spesifikke antistoffer, røde linjer; isotype kontroll mus IgM i (E). NCCIT, en human teratom cellelinje, ble brukt som en kontroll i (DF).
Mesenchymale-Epitelial Transition Forekommer i RICS
neste utforsket endringer i uttrykket av epitel og mesenchymale signatur gener i RICS fra HOC313 og OSC-19 celler ved hjelp av QRT-PCR. Epitel signatur gener, inkludert
CDH1
,
DSC 2
,
DSP
,
TGM1
, og
JUP
var signifikant oppregulert i begge RICS sammenlignet med de respektive foreldre celler (figur 3A og 4A). Oppregulering av
ITGA6 Hotell og
ITGB4
i RICS fra
HOC313
celler og
KRT14
i RICS fra OSC-19 celler ble også observert. Imidlertid ekspresjon av en av de epitel-spesifikke transkripsjonsfaktor, grainyhead-lignende protein 2 homolog (GRHL2) ble ikke endret mellom parentale celler og tøy av i begge SCC linjer.
(A, B) Endring av genekspresjon profil i RICS fra HOC313 celler, epitelceller markørgener (A) og mesenchymale markørgener (B). Ekspresjon av mRNA ble normalisert med HPRT, og den relative mengde av hvert gen er vist. Nedbørssøylene, foreldre celler. Røde barer, RICS. Barer representerer gjennomsnitt ± SD fra minst tre uavhengige forsøk. **
P
0,01. Student
t
-test. (C) Western blot-analyse. P, Foreldre celler. R, RICS. (D) Signalene fra den vestlige analyse ble kvantifisert ved hjelp ImageJ. Signaler var normalisert med HPRT. Brett endring i RICS fra foreldrecellene var representert, mener ± SD og mener forholdet mellom tre uavhengige eksperimenter. (E) Immunofluorescent farging av foreldre HOC313 celler og RICS med anti-pankeratin (KRTs), og β-catenin (CTNNB1) antistoffer. (F) elektronmikro. Pilene viser desmosom lignende strukturer. Scale bar, 0,2 mikrometer. (G) uttrykk for miRNAs i RICS (røde søyler) i forhold til foreldre HOC313 celler (blå søyler). miRNA ble normalisert med SNORD61. Barer representerer gjennomsnitt ± SD fra minst tre uavhengige forsøk. **
P
0.01 av Student
t
-Test.
(A, B) Endring av genekspresjon profil i RICS fra OSC-19 celler, epitelceller markørgener (A) og mesenchymale markørgener (B). Ekspresjon av mRNA ble normalisert med HPRT, og den relative mengde av hvert gen er vist. Nedbørssøylene, foreldre celler. Røde barer, RICS. Barer representerer gjennomsnitt ± SD fra minst tre uavhengige forsøk. *
P
0,05, **
P
0,01. Student
t
-test. (C) Western blot-analyse. P, Foreldre celler. R, RICS. (D) Signalene fra den vestlige analyse ble kvantifisert ved hjelp ImageJ. Signaler normalisert med HPRT. Brett endring i RICS fra foreldrecellene var representert, mener ± SD og mener forholdet mellom tre uavhengige eksperimenter. (E) Immunofluorescent farging av foreldre OSC-19-celler og RICS med anti-pankeratin (KRTs), anti-E-cadherin (CDH1), og anti-desmocollin2 (dsc2) antistoffer. (F) elektronmikro. Pilene viser desmosom eller desmosom-lignende strukturer. Scale bar, 0,2 mikrometer. (G) Lengde på desmosomes eller desmosom-lignende strukturer på elektronmikros. Mean ± SD av de 30 stedene. **
P
0,01 av Student
t
-test. (H) desmosomes eller desmosom-lignende struktur med tonofilaments ble regnet blant de 30 stedene. (I) uttrykk for miRNAs i RICS (røde søyler) i forhold til foreldre OSC-19 celler (blå søyler). miRNA ble normalisert med SNORD61. Barer representerer gjennomsnitt ± SD fra minst tre uavhengige forsøk. **
P
0,01 av Student
t
-test.
Omvendt RICS fra HOC313 celler viste en betydelig redusert uttrykk av mesenchymale signatur gener (figur 3B), inkludert
TGFB1
TGFBR2
,
SNAI1
,
SNAI2 Hotell og
ZEB2
. OSC-19 RICS viste redusert genekspresjon av C
DH2
,
TGFB2
,
TGFBR2
,
VIM Hotell og
COL1A2 product: ( figur 4B). Blant de mesenchymale markørgener,
TGFBR2
ble ofte nedregulert i RICS fra to linjer. Western blot analyse oppdages økte nivåer av CDH1, JUP (γ-catenin), dsc2, og KRTs i RICS, som ble forbundet med epitel fenotype (figur 3C og 3D og 4C og 4D). Som samsvar med q-RT-PCR, tap av SNAI2 og gevinst på KRT14 ble også observert av Western blot i HOC313 RICS og OSC-19 RICS, henholdsvis. Tilsvarende er prosessen med å immunfarging viste at OSC-19 rics hadde en markert økning av keratin, CDH1 og dsc2 (figur 4E). Økt uttrykk av keratin ble også observert i HOC313 RICS (Fig 3E). Endret lokalisering av CTNNB1 foreslått økt celle til celle adhesjon i HOC313 RICS (Fig 3E). Videre elektronmikroskopi viste modnet desmosom med tonofilaments i HOC313 RICS mens foreldre celler utstilt ufullstendige desomosome-lignende strukturer, der høy elektrontetthet området ble sett på som vender to cellemembraner (Fig 3F). I OSC-19 RICS, desmosomes var større enn de i foreldrecellene og de fleste av dem utstilt modne tonofilaments, mens foreldrecellene viste umoden desmosom uten tonofilaments (Fig 4F og 4H). Kollektivt, RICS viste tilbakekomst av desmosomale veikryss, som er den viktigste karakteristisk for velorganiserte epitelceller, noe som tyder MET.
Vi neste undersøkt microRNAs (mirnas), som angivelig rettet EMT-induserende molekyler. De HOC313 RICS viste økt nivå av MIR-200 familiemedlemmer (MIR-200a, -200b, -200c, -141 og -429), MIR-203, og MIR-205 (Fig 3G), som kan ned-regulere Snai og ZEB familier [15-17]. De OSC-19 RICS viste økt nivå av MIR-203 og MIR-205, selv om MIR-200 familiemedlemmer ikke ble endret (Fig 4I). Dette antydet at innføringen av RFS førte til ekspresjon av EMT-undertrykke mirnas med noen forskjellige profiler mellom SCC-celler. Sikkert, RFS indusert MET i den menneskelige SCC cellelinjer på transkripsjons og post-transkripsjonsnivåer.
omprogrammering faktorer påvirker cellemotilitet av SCC
in vitro
Meget uttrykt RFS i RICS (fig 2C) kunne ha påvirket celleproliferasjon [31], derfor
in vitro
celleproliferasjon av RICS ble åpnet. MTS-analyse viste ingen signifikant forskjell i celleformering mellom rics og foreldreceller (figur 5A og 5E). Kreftceller henhold EMT ervervet økt cellular motilitet som førte til invasjon og metastasering. For å vurdere om RFS reversere cellemotilitet av SCC, brukte vi en
in vitro
sårheling analysen. Cellen migrering av rics fra HOC313 og OSC-19 ble markert svekket i forhold til de parentale celler (figur 5B, 5C, 5F og 5G). Som sammenlignet med foreldreceller, ble migrering evne rics redusert til 25% og 40% i HOC313 rics og OSC-19 rics, respektivt. Celle invasivitet
in vitro
ble evaluert ved bruk Boyden kammere i nærvær av Matrigel belegg. Antallet rics, som migrerte gjennom membranen, var betydelig mindre enn for foreldreceller (Fig 5D og 5H). Disse resultatene indikerer at både cellemotilitet og invasivitet
in vitro
ble påfallende svekket i RICS.
HOC313 foreldre celler og RICS (AD), OSC-19 foreldre celler og RICS (EH ). (A, E) Celleproliferasjon ble studert ved MTS-analyse. Relativ proliferated celle nummer i 24 timer ble vist. Middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. NS, Ingen signifikant forskjell. (B, F)
In vitro
sårheling analysen viste at cellemigrasjon ble markert svekket i RICS i forhold til foreldre celler. (Scale bar, 500 um). Representative data er vist fra tre uavhengige forsøk. Tidspunktene for evaluering er indikert. (C, G) Migrering avstand fra RICS (rød strek) er betydelig redusert sammenlignet med foreldreceller (blå strek). Verdiene viser middelverdi ± SD.
n
= 3. **
P
0,01 av Student
t
-test. (D, H) Celle invasiv aktivitet ble redusert i rics (røde søyler) i forhold til den parentale celler (blå søyler) ved hjelp av Boyden kammere belagt med Matrigel. Verdiene viser middelverdi ± SD.
n
= 3. **
P
0,01 av Student
t
-test.
Redusert
in vivo
Ondartethet i RICS
For å studere effekten av MET indusert av RFS på demping av SCC malignitet, brukte vi OSC-19 celler, siden de ble kjent for å metastasere til cervical lymfeknuter når implantert i språklige margin på nakne mus [32]. Som vist i studien utført av Maekawa
et al
. [32], 2,0 × 10
5 av foreldrenes eller RIC celler ble transplantert inn i tunger nakne mus for å verifisere om RICS viste endret
in vivo
ondartet atferd. Deretter ble det tumordannelse i tungene og metastasering til de drenerende lymfeknutene evaluert på dag 21. Tumor avledet fra rics uttrykt LIN28, en av RFS (figur 6A). De viste også høyere uttrykk av dsc2 enn foreldre celler (figur 6a), noe som indikerer at RICS bevart forbedrede epiteliale funksjoner utgangspunktet observert
in vitro plakater (fig 4A og 4C). Størrelsen av tumorer dannet av rics (
n
= 15) var signifikant mindre enn det som dannes av de parentale celler (
n
= 15), noe som indikerer at dempningen av
in vivo
vekst av rics (figur 6A og 6B). Metastaser av foreldre OSC-19 celler overfor de cervikale lymfeknuter ble påvist ved nærvær av humant keratin18 ekspresjon ved hjelp av RT-PCR og funnet i 6 av 15 parentale celler inokulert mus, mens ingen metastaser ble funnet i RIC-inokulert gruppe ( fig 6C,
P
0,01 ved Fishers eksakte test). Spesielt, i mus som var inokulert med paren SCC-celler, størrelsene av tumormasser korrelert med sannsynligheten for metastase (lukkede sirkler i figur 6B). Faktisk, tumor områder i tunger mus huser metastatisk kreft og ingen metastaser var 4,83 ± 1,65 mm
2 og 1,90 ± 1,85 mm
2, henholdsvis (
P
0,01 av Student t -test). I kontrast, gjorde RIC-deriverte svulster ikke spre selv når de vokste så stor som svulster metastasized foreldre celler (figur 6B). Videre, for å undersøke metastatisk evne av cellene til fjerntliggende organer, ble foreldre OSC-19-celler og RICS transplantert inn i nakne mus via halevenen (2 x 10
5 celler /mus). Cellen transplantert hårløse mus levd uten symptom før den eksperimentelle endepunktet, dag 47 etter celle transplantasjon. Ingen tumorvekst ble sett i thorax eller abdominal organer makroskopisk. I tillegg ble ingen tegn på tumorvekst observert i lunge, lever, milt og nyre (data ikke vist). Med uttrykket av cytokeratin 18, selv om det var meget lavt nivå, ble påvist fra lungevev i 2 av 4 prøver av OSC-19 parentale celler-inokulerte mus, mens ingen signal ble påvist i alle prøver fra rics-inokulerte mus (fig 6D). Dette tyder på tilstedeværelsen av lunge micrometastasis av OSC-19 foreldre celler. Dermed RICS utstillings mindre ondartet potensial enn foreldrecellene
in vivo
(A) Representative bilder av histologi (H E). Og immunhistokjemisk farging for LIN28 og dsc2 i tumormassene tunger 21 dager etter inokulering av foreldre OSC-19 celler og RICS. Tumorområdet i en tunge vev var omgitt av en stiplet linje (venstre paneler av H E fargings og 100 mikrometer i immunofarging. (B) Tumor vekst i tunger nu /nu mus på dag 21 etter inokulering av foreldre celler (sirkler) og RICS (firkanter). Lukkede symboler betegne mus stiller metastaser til lymfeknuter. Søylene viser gjennomsnittlig tumorområdet (mm
2).
n
= 15 (kumulativ resultatene av tre uavhengige forsøk.
n
= 5, hver gruppe). *
P
0,05 av Student
t
-test. (C) Påvisning av menneskelig keratin 18 mRNA fra lymfeknuter fra foreldre celle-inokulert mus, men ikke fra RICS-inokulert mus. Uttrykk for menneskelig keratin18 i lymfeknuter ble oppdaget ved hjelp QRT-PCR og ble normalisert med musen HPRT unntak av de positive kontroller, som er normalisert med menneskelig HPRT. Lymfeknutemetastaser skjedde i seks av 15 mus inokulert med foreldre SCC celler i tunger, i skarp kontrast til ingen metastaser i RIC-inokulert mus. C; kontrollere lymfeknuter uten xenotransplantasjon, P; foreldre OSC-19 celler, R; RICS fra OSC-19. Ekspresjonsnivået av human keratin 18 var omtrent lik for de to cellelinjene. (D) Påvisning av menneskelig keratin 18 mRNA fra lunge av nu /nu mus.
