Abstract
gemcitabin, et effektivt middel i behandling av kreft i bukspyttkjertelen, har gjennomgått svikt i mange tilfeller etter flere sykluser med behandlingen på grunn av fremveksten av resistens. Kombinasjon av kosttilskudd forbindelser med klinisk validerte narkotika har dukket opp som en effektiv terapeutisk tilnærming for å behandle bukspyttkjertelsvulster, ildfaste til gemcitabin terapi. For å optimalisere en mulig synergistisk kombinasjon av gemcitabin (GCB) med kosten molekyler, Betuilnic syre (BA) og Thymoquinone (TQ), frittstående IC
50 dose av GCB, BA og TQ ble beregnet for bukspyttkjertelkreft cellelinjer . Fast IC
50 doseforhold av kosten molekyler i kombinasjon med redusert IC
50 dose av GCB ble testet på GCB motstandsdyktig PANC-en og sensitive MIA PACA-2 celler for synergi, additiv respons og antagonisme ved hjelp calcusyn. Kombinasjon indeks (CI) viste at forbehandling av BA og TQ sammen med GCB synergi hemmet kreft celle spredning i
in vitro
eksperimenter. Pyruvat kinase (PK) M2 isoform, et lovende mål involvert i kreftcelle metabolisme, viste nedregulering i nærvær av TQ eller BA i kombinasjon med GCB. GCB med BA handlet fortrinnsvis på kreft mitokondrier og utløste mitokondriell permeabilitet overgang. Pre-eksponering av cellelinjene, MIA PACA-2 og PANC-1, for å TQ i kombinasjon med GCB indusert apoptose. Dermed blir effekten av BA eller TQ i kombinasjon med GCB hemme celleproliferasjon, indusere apoptose og ned-regulere uttrykk for PKM2, reflekterer løftet i bukspyttkjertelkreft behandling
Citation. Pandita A, Kumar B, Manvati S, Vaishnavi S, Singh SK, Bamezai RNK (2014) synergistisk kombinasjon av gemcitabin og kosten Molecule induserer apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler og Down Regulerer PKM2 Expression. PLoS ONE ni (9): e107154. doi: 10,1371 /journal.pone.0107154
Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: May 24, 2014; Godkjent: 13 august 2014; Publisert: 08.09.2014
Copyright: © 2014 Pandita et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Forsøk har vært madeto forbedre effekten av klinisk validerte narkotika i kombinasjonsregime for å forbedre deres reaksjon mot ildfaste svulster, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [1]. Foruten 5-Flurouracil, gemcitabin (GCB), en mye brukt kjemoterapeutisk stoff for kreft i bukspyttkjertelen, har vist feil etter flere runder med behandling på grunn av fremveksten av resistens [2], [3]. Behandling av bukspyttkjertelen svulster som er motstandsdyktig overfor gemcitabin terapi er en utfordring for onkologer. Arbeidet, som i andre kreftformer, for å målrette de viktige prosesser, slik som kreftfremkallende metabolisme, celledeling, differensiering, apoptose, i bukspyttkjertelkreft utvikling, har vakt interesse i kosten fytokjemikalier for potensiell kreft chemoprevention. En mekanistisk kobling mellom kosthold og kreft i bukspyttkjertelen kommer fra sin lange anerkjent sammenhengen [4]. Et slikt diett middel, som kan brukes i kombinasjon med GCB for behandling av kreft i bukspyttkjertelen, er Betulinic syre (BA), en naturlig forekommende penta-cyklisk-triterpene med en rekke biologiske aktiviteter, inkludert potente antitumoregenskaper [5]. BA er inneholdt i den ytre barken av forskjellige planter i hele planteriket, inkludert hvite bjeffet bjørketrær [6], med anti-inflammatorisk, anti-virus, og anti-neoplastiske aktiviteter [7]. Anticancer aktivitet av BA har vært knyttet til dens evne til direkte å utløse mitokondriemembranen permeabilization, en sentral begivenhet i den apoptotiske prosess, heve det håp å omgå motstanden mot konvensjonelle kjemoterapeutika [6]. Thymoquinone (TQ), en annen potensiell kreft-nutraceutical agent, er en bioaktive stoffet stammer fra svart frø (
Nigella sativa
) olje. I folklore medisin, har forbruket av TQ frø vært forbundet med ulike terapeutiske fordeler i bronkial astma, dysenteri, hodepine, gastrointestinale problemer, eksem, høyt blodtrykk og fedme [8]. I sammenheng med kreft, blir TQ rapportert å utvise anti-proliferative virkninger på cellelinjer, avledet fra bryst, tykktarm, eggstokk, strupehodet, lunge, myeloblastisk leukemi og osteosarkom [9] – [15]; og anti-metastase effekt i humanpancreatic kreft. Det har vist seg å undertrykke migrering og invasjon av PANC-1-celler på en doseavhengig måte, [16] og ned-regulere NF-kappa B og MMP-9 uttrykk. Tidligere studier har også vist den biologiske aktiviteten av thymoquinone (TQ) i kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro
. Dette har vist sin chemo-sensibiliserende effekt etter pre-eksponering av celler til TQ (25 umol /L) i 48 timer, etterfulgt av gemcitabin eller oksaliplatin, noe som resulterer i 60% til 80% veksthemming sammenlignet med 15% til 25% . av inhibering med gemcitabin eller oxaliplatinalone [17]
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP, hovedsakelig avhengig av omprogrammering av deres metabolske behov, forbruker mer glukose og fremstille en stor mengde av laktat til og med i en vel-oxygenized miljø; prosessen betegnes som aerob glykolyse eller «Warburg-effekten» [18], [19]. Mens normale differensierte celler maksimere ATP produksjon av mitokondriell oksidativ fosforylering av glukose i henhold normoksisk forhold, kreftceller genererer mye mindre ATP fra glukose ved aerob glykolyse. Til tross for å være mindre effektiv i ATP produksjon, er glykolyse en mye mer hurtig prosess i kreftceller [20], [21]. Her pyruvat-kinase (PK) katalyserer det siste reaksjonen med overføring av en høy-energi fosfatgruppe fra fosfo-enolpyruvate (PEP) til ADP, ATP-produksjon og pyruvat som reduseres til laktat ved laktatdehydrogenase (LDH) i cytosol. Pyruvat-kinase (PK) består av fire isoformer, hvorav PKM2 uttrykker hovedsakelig i kreftceller [22]. Disse er: kolon [23], nyrecelle [24], lunge [25] og andre. PKM2 har vist seg å virke som en markør for: nyrecellekarsinom (RCC) [26], [27], testikkelkreft [28], brystkreft [29], urologiske tumorer [30], lungekarsinom, cervikal cancer, og gastrointestinale svulster [31]; og med en mulig deteksjon i avføringen til pasienter med mage og kolorektal kreft [32]. I senere tid har massespektrometri ytterligere demonstrert en dominerende nærvær av PKM2 i:. RCC, blærekarsinom, hepatocellulært karsinom, kolorektal kreft, lunge-karsinom, og follikulære thyroid adenom [33]
I denne studien undersøkte vi effekten av BA eller TQ med GCB, selvstendig og i kombinasjon, på menneskelige adenokarcinomceller, MIA PACA-2 og PANC-en, for å indusere celledød. Underliggende mekanismen av sin handling, spesielt med hensyn til PKM2 uttrykk og aktivitet og mitokondriell permeabilitet overgangen ble vurdert.
Materialer og metoder
cellelinjer, vedlikehold og reagenser
Menneskelig bukspyttkjertelen cancercellelinjer, PANC-1 og MIA PACA-2 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Celler ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. Glutamin, HEPES eller natrium pyruvat kosttilskudd, ble tilsatt for å opprettholde riktig cellevekst. Betulinsyre (BA), Thymoquinone (TQ), Gemcitabin (GCB), dimetyltiazol-2-yl-2, 5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT), Rodhamine-123 (Rh-123), propidium jodid (PI) og andre kjemikalier (Sigma Chemical Co, USA); sammen med Annexin-V-FITC apoptose deteksjon kit (Cayman Chemical Company), antistoffer mot: Pro-Caspase-3, Beta-aktin, PKM2, poly-ADP-ribose-polymerase (PARP) (Cell Signaling), ble anskaffet og brukt i studien.
Behandling profil og Celleviabilitet analysen
PANC-en og MIA PACA-2-celler ble dyrket i T-75 kolber. Etter at 80% konfluens ble cellene trypsinert og sentrifugert ved 100 x g i 5 min. Cellepelleten ble suspendert i DMEM-medium; og 2 x 10
5 celler /brønn utlevert i Nunclon-96-brønners flatbunnede plater til å feste i 24 timer. Celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av BA, TQ og GCB, alene og i kombinasjoner. I kombinasjons eksperimenter ble cellene først behandlet og sensibilisert med BA eller TQ i 24 timer, etterfulgt av eksponering til GCB for neste 24 timer, og inkubert i CO
2 inkubator ved 37 ° C. For celleviabilitet assay, MTT-oppløsning (20 ul av 2,5 mg /ml i DMEM) ble tilsatt til hver brønn og kulturplater forsiktig omrørt, etterfulgt av inkubering i CO
2 inkubator ved 37 ° C i 3 timer. Supernatanten ble aspirert og MTT-formazon krystaller oppløst i 150 ul DMSO. Platene ble igjen inkubert ved 37 ° C og omrørt i 10 minutter på en plateryster. Absorbansen av DMSO oppløst MTT-formazon krystaller ble målt ved 570 nm. Chemo-sensitivity verdier ble uttrykt som% celleviabilitet av den medikamentkonsentrasjon som inhiberte 50% cellevekst; og IC
50-verdier beregnet fra konsentrasjon-virkningsforhold, ved hjelp av Graph Pad prisme versjon 5.00.
Analyse av kombinerte virkninger av rusmidler
Drug synergi ble bestemt av isobologram og combination- indeks metoder, avledet fra median effekt prinsippet om Chou og Talalay [34], med CalcuSyn programvare (Biosoft, versjon 2.1). Data innhentet fra den vekstinhibitoriske forsøk ble anvendt for å utføre slike analyser. Den isobologram metoden er en grafisk fremstilling av den farmakologisk interaksjon; og er dannet ved å velge en ønsket fraksjonert påvirket celledrap (Fa). En rett linje ble trukket til å koble Fa poeng plottet mot eksperimentelt brukes fast forhold kombinasjoner av narkotika (GCB) og kosttilskudd molekyl (BA eller TQ) på X- og Y-aksen for å generere isobologrammer. Kombinasjon datapunkter som falt på linjen representerte en additiv legemiddelinteraksjons; mens, datapunkter som var under eller over linjen representert synergi eller antagonisme, henholdsvis. Kombinasjonen-indeks (CI), en numerisk verdi, ble beregnet ved formelen [35]: hvor, C
A, x og C
B, x, var konsentrasjonen av legemiddel A anddrug B, som brukes i kombinasjon for å oppnå x% legemiddeleffekt. IC
x, A og IC
x, B var konsentrasjonene av enkelte agenter for å oppnå samme effekt.
Kombinasjonen-indeks (CI) metoden er en matematisk og kvantitativ representasjon av et to -drug farmakologisk interaksjon. Ved hjelp av data fra veksthemmende eksperimenter og datastyrt programvare, ble CI-verdier generert over en rekke Fa nivåer 0,05 til 0,90 (5% -90% veksthemming). En CI av en angitt en additiv effekt mellom de to agentene, mens en CI En eller CI En indikert, synergisme eller antagonisme, henholdsvis.
Flowcytometrisk analyse for påvisning av apoptose
1 × 10
5 celler /ml /brønn MIA PACA-2 og PANC-en var behandlet med BA, TQ, og GCB alene og i kombinasjon i 48 timer. Cellene ble vasket og farget med Annexin-V-FITC antistoff og PI, i henhold til produsentens instruksjoner. Flow-cytometri prikkplott analysen ble utført, og cellene skannes for fluorescens intensitet i FL-1 (FITC) og FL-2 (PI) kanaler. Den fraksjon av cellepopulasjonen i forskjellige kvadranter ble analysert ved hjelp av kvadrant statistikk. Celler i nedre høyre kvadrant, representert apoptose; og i øvre høyre kvadrant, nekrose eller post apoptotisk nekrose [36].
Måling av mitokondriell membranpotensiale
1 × 10
5 celler /ml /brønn MIA PACA-2 og PANC-1-cellene ble behandlet med BA, TQ, og GCB alene og i kombinasjon i 12-brønners plate i 48 timer. I det siste 1 time inkubasjon før opphør av eksponering, ble cellene farget med rhodamin-123 (5 ug /ml). Cellene ble vasket i PBS og sentrifugert ved 100 x g i 5 minutter og suspendert i PBS. For å detektere endringer i mitokondrie trans-membranpotensialet (ψ), som et resultat av mitokondriell forstyrrelse, ble en nedgang i fluorescens-intensitet analysert strømnings cytometrically på FL-1channel [37].
Fremstilling av hel-celle-lysat og immunoblotting
Celler (2 x 10
6/6 ml medium /60 mm vevskulturskål) som utsettes for BA, TQ, og GCB alene og i kombinasjon etter 48 timers behandling, ble høstet etter trypsinering og vasket med PBS.The pellet oppnådd ble lysert med iskald lyseringsbuffer (50 mMTris pH 8,0, 150 mMNaCl, 5 mM EDTA, 1% volum /volum Nonidet P-40, 1 mM PMSF og 1% (v /v) protease-inhibitor cocktail), og holdt i 30 minutter på is med mellomliggende tappe etter hvert 5. minutt. Lysatene ble sentrifugert ved 12 000 g i 10 min ved 4 ° C og supernatanten oppsamlet for immunblotting [38]. Supernatanten så samlet ble kvantifisert ved hjelp bicinchoninic syre analysen (BCA assay) kit fra Thermo Scientific. For Western blot-analyse, ble 50 ug totalt protein løst på SDS-PAGE på 60 V og deretter elektro overført til PVDF-membran over natten ved 4 ° C under en 30 V strøm. Ikke-spesifikke protein binding ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann, inneholdende 0,1% Tween-20 (TBST), i 1 time ved romtemperatur. Blottene ble probet med respektive primære mus /kanin /geite-anti-human-antistoffer i 2 timer og vasket tre ganger med TBST. Blottene ble deretter inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff i 1 time, vasket igjen tre ganger med TBST og signaler detektert ved hjelp av ECL pluss kjemi-luminescens kit på en røntgenfilm [38].
PKM2 aktivitetsanalyse
PKM2 aktivitet ble målt spektro-fotometrisk (UV-1800, Shimadzu, Japan), ved bruk av NADH /laktat-dehydrogenase (LDH) som er koplet assay som tidligere beskrevet [39].
Statistisk analyse
data~~POS=TRUNC av forsøkene utført i triplikat ble uttrykt som middel +/- SD, med mindre annet er angitt. Sammenligninger ble gjort mellom kontroll og behandlede grupper, bruker Enveis ANOVA (Dunnett eller Tukey) og P-verdier. 0,01 ble betraktet som signifikant
Resultater
In vitro
kombinasjonsstudier av gemcitabin med betulinsyre og thymoquinone
chemo-følsomhet i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, MIA PACA-2 og PANC-en, mot narkotika GCB og kosttilskudd molekyler, BA eller TQ, ble reflektert i cellevekst inhibering, beregnet av IC
50 (50% veksthemming) i 48 timer; og sammenlignet først med verdiene oppnådd i et kontrollcellelinje, FR2. IC
50-verdier oppnådd fra uavhengig behandling i de tre cellelinjer, MIA PACA-2, PANC-1 og FR2, er gitt i detalj i tabell 1 (BA: 25 ± 0,9 uM, 23,5 ± 3,5 uM, 50 ± 1 pM; TQ 36 ± 0.28 uM, 23 uM ± 2 og 77 ± 2 uM; GCB 1 ± 0,66 uM, 5,5 ± 2,5 uM og mindre enn 0,025 uM). Resultatene ble analysert med Enveis Annova-Dunnett viser en signifikant (p-verdi 0,01) virkning hos behandles, på en doseavhengig måte (figur 1). Basert på disse resultatene, ble et fast stoff ratio valgt (GCB: BA eller GCB: TQ) over en rekke medikamentkonsentrasjoner og brukes i videre eksperimenter (figur 2). Kombinasjonsindeks (CI) ble anvendt for å analysere og bekrefte synergisme ble observert etter forbehandling av celler med kost molekylet, etterfulgt av eksponering til GCB i 48 timer (GCB: BA og GCB: TQ). De CI verdier, som gir et kvantitativt mål på graden av interaksjon, ble beregnet ved hjelp av CalcuSyn programvare, ved Fa-verdier på 0,50, 0,75 og 0,90 (tabell 2). Isobologrammer konstruert for disse verdiene, som representerer henholdsvis 50%, 75% og 90% veksthemming, både for MIA PACA-2 og PANC-1-celler (figur 3) og Fa-CI tomt, er anordnet som i fig S1. Tabell 3 viser de CI verdier ved Fa av 0,50 til 0,90 for kosten molekyler (BA eller TQ) og narkotika (GCB). En sammenligning av monoterapi (BA, GCB, TQ) med kombinasjonen (CI
(GCB: BA) og CI
(GCB: TQ)) viste en signifikant forskjell ved p-verdi 0,01. ED verdiene for isolobologram for MIA PACA-2 og PANC-1 er oppført i tabell S1. I MIA PACA-2-celler, sensibilisert med BA og fulgte med GCB eksponering, CI
(GCB: BA) verdier oppnådd ved doser (6.25:0.082 og 25:0.33) var 0,519, 0,889. Med TQ, CI
(GCB: TQ) i doser (4.5:0.082; 9:0.15 og 36:0.66) viste verdiene 0,721, 1,050, 0,681. Men i PANC-en CI
(GCB: BA) ved (5:1.3 og 20:5.2) doser viste 0,766, 0,429 og med TQ CI
(GCB: TQ) i doser (6.25:1.3 og 25:5.3), var verdiene 0,736, 0,371. CI verdier av 1; 0,5 og 1, representert synergisme, sterk synergisme og antagonistisk effekt, henholdsvis. Synergismen ble observert over et bredt område av konsentrasjoner i begge de undersøkte bukspyttkjerteltumorcellelinjer. Synergistic legemiddelkombinasjonen dvs. CI (kombinasjonen indeksen) CI
(GCB: BA) (25 + 0,33) og CI
(GCB: TQ) (36 + 0,66) i MIA Paca-2cell linje og CI
(GCB: BA) (20 + 5,25) og CI
(GCB: TQ) (25 + 5,25) i PANC-1, som representerer Fa verdi 0,75 (viser 75% hemming), ble brukt i resten av analysene . Imidlertid er normale cellelinjen ble brukt i studien (FR2), for sammenligning som en kontroll, viste inhibering ved Fa verdi på 0,75 til 0,90. Våre resultater viste at virkningen av kosten molekyler (BA eller TQ) i normale celler ble observert ved en høy konsentrasjon; mens bare en minimal dose av GCB var nødvendig for inhibering av celleproliferasjon. Ved kombinasjonsstudier, den totale eksponeringen av gemcitabin til kreftcellene var bare for 24 timer.
IC
50
verdi ble beregnet på
Menneske bukspyttkjertelen adenokarsinom
cellelinjer (A) MIA Paca-2 (B) PANC-en og (C) Normal cellelinje FR2: for individuell behandling av gemcitabin, Thymoquinone og Betulinic syre i 48 timer (** , viktig som compaired for å kontrollere at p-verdi. 0,01, n = 3) i mellom de tre cellelinjene
(A) MIA PACA-2 og (B) PANC-1-cellene ble utsatt for graderte konsentrasjoner av Betulinic syre, Thymoquinone eller gemcitabin, enten alene eller i kombinasjon med en fast doseforhold av Betulinic syre sammenlignet med Gemcitabin og Thymoquinone vs. Gemcitabin i 48 timer. (Gemcitabin
ha eksponering i 24 timer bare i tilfelle kombinasjon), gemcitabin (ruter), etter
Betulinic syre og Thymoquinone
(sirkel) gemcitabin + betulinsyre og gemcitabin + Thymoquinone (trekant). (Mono terapi ( BA, GCB, TQ) Versus Kombinasjoner (CI
(GCB: BA), CI
(GCB: TQ).) (**, signifikant forskjell ved p-verdi 0,01, n = 3)
(A og B) Viser isolobolograms analyse av kombinasjonen av gemcitabin, Betulinic syre eller Thymoquinone i, (A) MIA Paca-2 celler med et fast stoff forholdet 1:0.01 av GCB : BA og GCB: TQ
(B) PANC-1 celler med et fast stoff forholdet 1:0.2 av GCB: BA og GCB: TQ. De individuelle doser av gemcitabin, Betulinic syre og Thymoquinone, for å oppnå 90% (rett linje) vekstinhibering (Fa = 0,90), 75% (bindestrek linje) vekstinhibering (Fa = 0,75), og 50% (kryss) vekstinhibering ( Fa = 0,50) ble plottet på x- og y-aksene. Kombinasjon indeks (CI) verdier beregnet ved hjelp Calcusyn programvare representeres av punktene ovenfor (indicating- motsetningen mellom legemidler) eller under linjene (indicating- synergi). (X symbol) ED50, (plusstegn) ED75 og (åpen stiplet sirkel) ED90 (Monoterapi (BA, GCB, TQ) versus kombinasjoner (CI
(GCB: BA), CI
(GCB: TQ)) (***, signifikant forskjell ved p-verdi 0,001, n = 3).
Tap av mitokondriemembranen potensial
BA eller TQ forbehandlet MIA PACA-2 og PANC-1-celler sammen med GCB, i kombinasjon og uavhengig av hverandre, når det analyseres for Rh-123 opptak av strømnings cytometery, viste et tap på 11% og 17% Mitokondriell membranpotensialet (MMP) , på MIA PACA-2-celler ble behandlet med 0,33 uM og 0,66 uM av GCB, henholdsvis Mens i kombinasjon, CI
(BA: GCB)., ble thedecrease 77% sammenlignet med kontrollgruppen (p-verdi 0,001) (figur . 4A) Men PANC-1 celler, som er relativt motstandsdyktig mot GCB sammenlignet med MIA PACA-2, viste en nedgang på 74% med BA alene og i kombinasjon, CI
(GCB: BA) var nedgangen opp to46%, sammenlignet med kontrollgruppen (p-verdi 0,001). behandlingen med individuell dose på GCB dvs. 5,25 uM, viste en nedgang opp til 13% (figur 4B). TQ alene eller i kombinasjon med GCB ikke viste noen endring i MMP i begge cellelinjene. Angivelig, BA equi-potent målrettet mitokondrielle funksjoner enn TQ og GCB, i begge celletyper. I de ubehandlede kontrollceller, nesten alle cellene bio-energisk aktiv, noe som gjenspeiles av høy Rh-123 fluorescens
(A) MIA Paca-2. Betulinic syre
alene og i kombinasjon CI
(GCB: BA) med gemcitabin indusert tap av mitokondriemembranen potensial (ψ) som ikke er observert i Thymoquinone og gemcitabin verken alene eller i kombinasjon CI
(GCB: TQ). Celler ble farget med rhodamin-123 (5 mg /ml) i 1 time, og analysert på en FL-kanal for strømningscytometer. Data i alle tall er representative for en av tre lignende eksperimenter. (B) Lignende undersøkelser ble utført i PANC-1 cellelinjen, Betulinic syre alene induserer mer tap av mitokondriemembranen enn i kombinasjon med gemcitabin CI
(GCB: BA) også uten tap av mitokondriemembranen ble observert når de ble behandlet med Thymoquinone og gemcitabin alene eller i kombinasjon CI
(GCB: TQ) i 48 timer (kontroll vers Monoterapi (BA, TQ, GCB) og kontroll vers kombinasjoner (CI
(GCB:. BA), CI
( GCB: TQ)), (***, signifikant forskjell ved p-verdi 0,001, n = 3)
Flowcytometrisk analyse- scoring av apoptotiske celler, behandlet med BA, TQ. og GCB, alene og i kombinasjon
Den forbedrede cytotoksisitet av BA eller TQ forbehandling indusert apoptose var et spørsmål som skal besvares. BA eller TQ pre-behandlede celler sammen med GCB, i kombinasjon og individuelt, produsert dose avhengig økning i apoptotisk og etter apoptotisk celle befolkningen både i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, MIA PACA-2 og PANC-en. i MIA PACA-2, uavhengig behandling med BA (25 mm), TQ (36 mm) og GCB (0,33 uM og 0,66 uM) resulterte i 7%, 5%, 1% og 2% sats av apoptose, respektivt. I kombinasjon, CI
(GCB: BA), produsert 11% og CI
(GCB: TQ) produsert 6% (p-verdi 0,001) apoptose, whencompared å kontrollere (figur 5A). Tilsvarende, i PANC1 cellelinje, BA (20 uM), TQ (25 uM) og GCB (5,25 uM), individuelt produsert 9%, 8%, 7% sats av apoptose, respektivt. Mens i kombinasjon, CI
(GCB: BA) og CI
(GCB: TQ), økte satsen til 11% og 12% (p-verdi 0,001), henholdsvis i forhold til kontroll (figur 5B) . Ved kombinasjonsbehandling var det en økning i hastigheten av apoptose i begge cellelinjer. BA produserte mer apoptotisk virkning hver for seg og i kombinasjon med GCB enn GCB og TQ alene eller i kombinasjon med TQ GCB på MIA PACA-2; mens, omvendt ble observert i PANC-1 celler.
(A) MIA PACA-2 celler (1 x 10
5) ble inkubert med indikerte konsentrasjoner av Betulinic syre, Thymoquinone og gemcitabin
alene og i kombinasjon CI
(GCB: BA) og CI
(GCB: TQ) for
48 timer og analysert for annexinV-FITC /PI flekker å bestemme apoptotiske cellepopulasjoner som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. (B) Tilsvarende undersøkelser ble gjennomført med i Panc-1 celler etter behandling med angitte doser av Betulinic syre, Thymoquinone og gemcitabin alene og i kombinasjon CI
(GCB: BA) og CI
(GCB: TQ) for 48 timer (kontroll versus monoterapi (BA, TQ, GCB) og kontroll versus kombinasjoner (CI
(GCB:. BA), og CI
(GCB: TQ)), (***, signifikant forskjell på p-verdi 0,001, n = 3)
PKM2 uttrykk og aktivitet
BA eller TQ forbehandling med en synergistisk dose av Fa 0.75 sammen med GCB i kombinasjon. (CI
GCB: BA og CI
GCB: TQ). for 48 timer i begge bukspyttkjertelkreft cellelinjer, MIA PACA-2 og PANC-en, viste en nedgang inPKM2 proteinnivå (Figur 6A og B) mens ved Fa 0,5 ie-celler forbehandlet med BA (5 uM) og TQ (6,25 uM) i kombinasjon med GCB (1,3 pM) i 48 timer, en reduksjon ble observert i Pro-Caspase-3 ekspresjon og PARP, uten noen virkning på PKM2 uttrykk, med unntak av en moderat nedgang i ekspresjon i PKM2 med TQ (figur 6C). aktiviteten av PKM2 imidlertid viste en økning inuntreated MIA PACA-2-celler og en reduksjon i de behandlede celler med BA (25 pM) , TQ (36 mm) og GCB (0,33 mikrometer og 0,66 mm); som forbedret i kombinasjon (CI
GCB: BA og CI
GCB: TQ) (figur 7A). Mens i tilfelle av Panc-1-celler, og resultatene som ble oppnådd var så bakover i ikke-behandlede celler som viste en redusert aktivitet av PKM2 og en økning i aktiviteten i de behandlede celler alene eller i kombinasjon (figur 7B).
(A) MIA PACA-2 og (B) PANC-1 synergi doser på Fa 0.75 av Betulinic syre og Thymoquinone ble brukt alene og i kombinasjon CI
(GCB: BA) og CI
(GCB: TQ) med gemcitabin
fra blotter det ble observert at det var en nedgang i uttrykk for PKM2 når det behandles i kombinasjon doser.. (C) PANC1 cellelinje-doser ved Fa 0,5 av betulinsyre, Thymoquinone og gemcitabin anvendt alene og i kombinasjon, og fra blottene vi observert at det var en reduksjon i Pro-Caspase-3, fulgt av reduksjon av PARP og en liten nedgang er observert i Thymoquinone behandlet i PKM2.
(A) MIA PACA-2 celler behandlet med Betulinic syre, Thymoquinone og gemcitabin alene og i kombinasjon, CI
(GCB : BA) og Selge
CI
(GCB: TQ) på 48 timer. En reduksjon i aktiviteten i behandlede celler fulgt med
mer
redusere
i kombinasjon (s), CI
(GCB: BA)
og CI
(GCB: TQ), etter
sammenlignet med ble observert kontroll;
(B)
i PANC-en cellelinje vice versa var observert. Kontroll versus monoterapi (BA, TQ, GCB) og kontroll versus kombinasjoner (CI
(GCB: BA) CI
(GCB: TQ)), (***, signifikant forskjell ved p-verdi 0,001, n = 3)
Diskusjoner
bukspyttkjertelen svulster som er motstandsdyktig overfor gemcitabin terapi en utfordring for onkologer. Terapi som er i bruk for behandling av bukspyttkjertelkreft har vist skuff effekt; og kjøp av narkotika motstand under kjemoterapi utgjør en stor utfordring. Dermed nye strategier må være på plass for å utvikle nye chemo-forebyggende og /eller chemo-terapeutiske midler som ville forbedre det kliniske utfallet av denne sykdommen. Økende bevis oppfordrer til bruk av kosttilskudd molekyler og tilskudd i kosten for å øke responsen av standard kreft kjemoterapeutika. Tidligere flavonoider har blitt rapportert å inaktivere ofte deregulerte reaksjonsveier, slik som Akt og NF-kB, i kreft i bukspyttkjertelen, og bidrar til cellevekst, metastase og kjemoterapi motstand. Genistein, et kosttilskudd forbindelse, har vist seg å øke den anti-tumor aktivitet av erlotinib og gemcitabin i eksperimentelle systemer av kreft i bukspyttkjertelen [40]. Tidligere har det også blitt vist at Garcinol, et kosttilskudd molekyl, synergizes med gemcitabin å hemme celleproliferasjon og induserer apoptose i MIA PACA-2-celler med betydelig modulering av sentrale kreft regulatorer, inkludert
PARP
,
VEGF
,
MMP
,
ILs
, caspases, og
NF-kB product: [
41
]. Curcumin, et kosttilskudd komponent, sensitizes kreft i bukspyttkjertelen til gemcitabin
in vitro Hotell og
in vivo. In vitro
, ble curcumin vist å hemme proliferasjon av ulike bukspyttkjertelcancercellelinjer, potensiering apoptose indusert av gemcitabin, og inhibering av konstitutiv NF-kB-aktivering i cellene.
In vivo
, svulster fra hårløse mus injisert med kreft i bukspyttkjertelen celler og behandlet med en kombinasjon av curcumin og gemcitabin viste en signifikant reduksjon i volum (
P
= 0.008 vs kontroll;
P
= 0,036 vs gemcitabin alene) [42]. I våre forsøk, en kombinert samspill av betulinsyre (BA) eller thymoquinone (TQ), de to neutraceuticals med gemcitabin (GCB), i GCB-sensitive-MIA PACA-2 og GCB-resistente-Panc-1 – bukspyttkjertelkreft cellelinjer viste synergisme. Den levedyktighet analysen avslørte en synergistisk cytotoksisk samspill mellom GCB og BA eller GCB og TQ i begge GCB-sensitive og -resistente cellelinjer, som bestemmes av DRI (Dose Reduction Index) av 1 hentet fra calcusyn [43]. Mekanistisk, formidler GCB sine cytotoksiske effekter ved å hemme reparasjon syntesetrinnet gjennom sin handling som et ribonukleotid-reduktasehemmere, tappe intracellulære deoksy-nukleotid bassenger, og styrke potensialet i sin egen innlemmelse i nylig syntetisert DNA. Når inkorporert i DNA, bevirker den analoge terminering av DNA-syntese og er resistent mot fjerning ved ekso-nukleaser som resulterer i DNA-strengbrudd [44]. Betulinsyre (BA), en nutraceutical, er blitt vist å indusere apoptose gjennom mitokondrielle trasé, hvor i løpet av denne prosessen både de mitokondrielle ytre og indre membraner er permeabiliserte, noe som resulterer i frigjøring av oppløselige proteiner, så som cytokrom c, Smac eller AIF, fra mitokondriell mellomrommet inn i cytosol [45]. BA induserer også deathin flere forskjellige kreftcellelinjer gjennom flere baner, som inkluderer p53-uavhengig induksjon av p21 /Waf1, oppregulering av død-reseptorer, inhibering av spesifisitet protein (Sp) transkripsjonsfaktorer [46]. Tilsvarende Thymoquinone (TQ) induserer apoptose i tumorceller ved flere mekanismer, inkludert NF-kB undertrykkelse, Akt aktivering og ekstracellulære signalregulerte kinase signalveier, og også ved å hemme tumor angiogenese [47]. På grunnlag av ED
50, ED
75 og ED
90 av medikamentkombinasjoner, isobologrammer ble samlet og synergi evaluert ved hjelp av CalcuSyn. Betulinsyre (BA) eller Thymoquinone (TQ) i kombinasjon med gemcitabin (GCB), ved multiple legemiddelkonsentrasjoner, viste at i GCB-sensitive-MIA PACA-2 og GCB-resistent-PANC-1-celler, er kombinasjonen indeksen (CI) var under 0,88 ved Fa av 0,75 (75% reduksjon av cellevekst) på MIA PACA-2-celler. Mens i tilfelle av PANC-1, en kombinasjon indeksen (CI) var under 0,76 ved Fa på 0,5. Det biologiske grunnlaget for denne synergi var klart i differensial endringer i apoptose med både kosttilskudd molekyler. Selv om mekanistisk våre kombinasjoner er «gjensidig ikke-eksklusive» i naturen, men både kost molekylene viste en signifikant forskjell i quantum av cytotoksisitet induksjon i forhold til å stå alene GCB. Men hastigheten av apoptose-induksjon av BA i kombinasjon med GCB var mer effektiv i begge cellelinjer enn TQ i kombinasjon med GCB. Også reduksjon i transmembran mitokondriell potensial (Ψ) ble observert når BA alene eller i kombinasjon med GCB ble gitt til begge cellelinjene. Ingen endring, imidlertid ble observert på trans-membran mitokondriell potensial (Ψ) når kreftcellelinjer ble behandlet med GCB alene.
