Abstract
målrettet levering av kjemoterapeutiske midler er en ny metode for behandling av kreft, noe som gir økt selektivitet og lavere systemisk toksisitet. Vi har nylig utviklet en lovende medikamentavgivelsessystem, karakterisert ved at anticancermedikament daunorubicin (Dau) ble bundet
via
oksimbinding til en gonadotropin-frigjørende hormon-III (GnRH-III) derivatet anvendt som en målsøkende gruppe ( GLP-His-Trp-Lys (Ap) -Hans-Asp-Trp-Lys (Dau = Aoa) -Pro-Gly-NH
2; GLP = pyroglutaminsyre, Ac = acetyl; Aoa = aminooxyacetyl). Dette biokonjugatet som utøves
in vitro
cytostatisk /cytotoksisk effekt på human bryst, prostata og tykktarm kreft celler, samt betydelige
in vivo
tumorveksthemmende virkning på colon carcinoma bærende mus. I våre tidligere studier, ble H-Lys (Dau = Aoa) -OH identifisert som den minste metabolitt produsert i nærvær av rottelever lysosomal homogenat, som var i stand til å binde til DNA
in vitro
. For å få en dypere innsikt i mekanismen av virkningen av biokonjugatet, ble forandringer i protein ekspresjonsprofilen av HT-29 humane tarmkreftceller etter behandling med biokonjugatet eller fri daunorubicin undersøkt ved hjelp av massespektrometri-baserte proteomikk. Våre resultater tyder på at flere metabolisme-relaterte proteiner, molekyl chaperons og proteiner som er involvert i signal er annerledes uttrykt etter målrettet kjemoterapeutisk behandling, som fører til den konklusjon at biokonjugatet utøver sin cytotoksiske virkning ved å interferere med flere intracellulære prosesser.
Citation : Schreier VN, Pethő L, Orbán E, Marquardt A, Petre BA, Mezo G, et al. (2014) Protein Expression Profilen til HT-29 Mennesketykktarmskreft celler etter behandling med et cytotoksisk Daunorubicin-GnRH-III Derivative Bioconjugate. PLoS ONE 9 (4): e94041. doi: 10,1371 /journal.pone.0094041
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italia
mottatt: 09.11.2013; Godkjent: 10 mars 2014; Publisert: 09.04.2014
Copyright: © 2014 Schreier et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Universitetet i Konstanz (Zukunftskolleg, Prosjekt 879/08 og Young Scholar Fund, Prosjekt 462/12), den ungarske National Science Fund (OTKA NK 77485 og K 104 045) og ved Romanian National Authority for Scientific Research, CNCs -UEFISCDI (PN-II-RU-TE-2011-3-0038). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
reseptor-mediert medikamentavgivelse er en lovende metode for behandling av kreft, noe som kan gi økt selektivitet og lavere systemisk toksisitet sammenlignet med klassiske kjemoterapi (dvs. administrering av frie legemidler mot kreft) [1] – [3] . Tatt i betraktning at reseptorer for visse regulerende peptider, slik som gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH; også kjent som luteiniserende hormon-frigjørende hormon, LHRH), er sterkt uttrykt på en rekke kreftceller med forholdsvis begrenset ekspresjon i normalt vev, representerer de viktigste molekylære mål i kreftterapi [4]. Dermed kunne GnRH avledede peptider benyttes som målgruppe andeler for vedlegget og påfølgende spesifikk levering av kjemoterapeutika til GnRH-reseptor (GnRH-R) positive kreftceller. Etter deres internalisering av reseptormediert endocytose, blir bioconjugates vanligvis behandlet i lysosomer, som fører til frigjøring av fritt medikament, eller til dannelse av legemiddelholdige metabolitter [5], [6].
A lovende innfødt GnRH-analog til å bli brukt som en målsøkende gruppe er lamprett GnRH-III (Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH
2), som binder seg til GnRH-R, har en ubetydelig endokrin virkning på pattedyr, og utøver en direkte antiproliferativ effekt på begge hormon-avhengige og-Uavhengig kreftceller [7] – [9]. I vårt tidligere arbeid, har ulike antracyklin-GnRH-III derivative bioconjugates blitt designet, syntetisert og biokjemisk preget [10] – [12]. En av de mest lovende medikamentleveringssystemer som er utviklet til dags dato i våre laboratorier består av anticancermedikament daunorubicin (Dau) festet
via
en oksimbinding til en GnRH-III-derivat hvori Ser i posisjon 4 ble erstattet med Lys (Ac) [13]. Daunorubicin (figur 1A) er et kjemoterapeutisk middel som forstyrrer cellen spredning og deling av mekanismer som DNA innskyting, hemming av topoisomerase II, frie radikaler dannes, lipidperoksidasjon, etc. Til tross for sine kliniske fordeler, administrasjon av fri Dau fulgt av toksiske bivirkninger, de mest alvorlige er en kardiotoksisitet [14], [15]. Derfor bør feste Dau til GnRH-baserte rettet mot gruppene gi økt selektivitet og redusert systemisk toksisitet [12]. Vi har nylig vist at biokonjugatet GnRH-III [
4Lys (AC),
8Lys (Dau = Aoa)] (figur 1B) utøves
in vitro
cytostatisk /cytotoksisk effekt på human bryst, prostata og tykktarm kreft celler, med IC
50 verdier i lav mikrometer rekkevidde. Det er viktig å nevne at med HT-29 colon cancerceller, biokonjugatet utøvet høyere cytostatisk effekt (IC
50 = 7,4 ± 2,6 uM) enn moder biokonjugatet hvori Dau var festet til det native peptid hormon (IC
50 = 27,8 ± 4,2 mm). Videre på tykktarmskreft bærende mus, GnRH-III [
4Lys (AC),
8Lys (Dau = Aoa)] utøvet betydelig
in vivo
tumorvekst hemmende effekt (49,3% tumorvekstinhibitering i forhold til den ubehandlede kontrollgruppe) [13]. Videre, H-Lys (Dau = Aoa) -OH ble identifisert som den minste medikamentholdige metabolitt produsert i nærvær av rottelever lysosomal homogenat, som var i stand til å binde til DNA
in vitro product: [10], [13], resulterer som kan bidra til forståelsen av den cytotoksiske effekt av biokonjugatet.
(A) daunorubicin og (B) oksimbinding bundet daunorubicin-GnRH-III-derivat biokonjugatet, GnRH-III [
4Lys (Ac),
8Lys (Dau = Aoa)].
for å få en dypere innsikt i virkningsmekanismen til GnRH-III [
4Lys (Ac ),
8Lys (Dau = Aoa)] biokonjugatet ble endringer i proteinuttrykk profilen til HT-29 humane tykktarm kreft celler etter behandling med biokonjugatet eller gratis Dau undersøkt ved massespektrometri-baserte proteomikk. Våre resultater tyder på at flere metabolisme-relaterte proteiner, molekyl chaperons og proteiner som er involvert i signal er annerledes uttrykt etter målrettet kjemoterapeutisk behandling, som fører til den konklusjon at biokonjugatet utøver sin cytotoksiske virkning ved å interferere med flere intracellulære prosesser.
Material og Methods
Material
RPMI-1640-medium, føtalt kalveserum (FCS) og 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (Budapest, Ungarn). -Lineær immobilisert pH-gradient strimler (IPG strimler, pH 3-10 NL, 17 cm) ble kjøpt fra Bio-Rad Laboratories (München, Tyskland), mens bicinchoninic syre (BCA) assay kit var en Pierce produkt (Rockford, USA). Lyseringsbuffer (0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton-X100, 10 mM Tris-HCl pH = 7,4, 5 mM DTT og proteaseinhibitorer), rehydrering buffer (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 40 mM Tris, 2% Servalyt 3-10), ekvilibrert buffer (6 M urea, 2% SDS, 30% glyserol, 2,5 mM Tris-HCl) og rennende buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin og 0,1% SDS) ble fremstilt i våre laboratorier.
Syntese og kjemisk karakterisering av GnRH-III [
4Lys (AC),
8Lys (Dau = Aoa)] Bioconjugate
biokonjugatet GnRH-III [ ,,,0],
4Lys (Ac),
8Lys (Dau = Aoa)] ble fremstilt ved en kombinasjon av fastfase-peptidsyntese, og chemoselective ligering i oppløsning som tidligere rapportert [13]. I korte trekk ble det aminooxyacetylated derivat av GnRH-III (Glp-His-Trp-Lys (Ac) -Hans-Asp-Trp-Lys (Aoa) -Pro-Gly-NH
2) syntetisert på en Rink Amid MBHA harpiks ifølge Fmoc /tBu strategi, ved hjelp av en ortogonal beskytte ordning for lysinresidier i posisjon 4 og 8 (Protocol S1). Daunorubicin var festet
via
oksimbinding til den aminooxyacetylated GnRH-III-derivat, reaksjon som ble utført i oppløsning (0,2 M natriumacetat, pH 5) (figur S1). Etter dets rensing ved semipreparativ HPLC, biokonjugatet (Glp-His-Trp-Lys (Ac) -Hans-Asp-Trp-Lys (Dau = Aoa) -Pro-Gly-NH
2) ble karakterisert ved analytisk HPLC og massespektrometri (protokoll S2 og S3 og fig S2)
cellene
HT-29. (ATCC: HTB-38) humant colon carcinoma-celler ble holdt i RPMI-1640 medium inneholdende 10% FCS , L-glutamin (2 mM) og gentamicine (160 ug /ml). Cellekulturene ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 5% CO
2.
In vitro
cytotoksisk effekt
in vitro
cytotoksiske effekten av GnRH-III [
4Lys (Ac),
8Lys (Dau = Aoa)] biokonjugatet og gratis Dau ble bestemt ved MTT-analyse. Et antall 3 x 10
3-celler per brønn ble sådd ut på 96-brønners plater. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C ble cellene behandlet i 6, 24, 48 og 72 timer med biokonjugatet eller fri Dau oppløst i serumfritt medium (konsentrasjonsområdet: 2,6 x 10
-4-10
2 mm). Celler behandlet med serumfritt medium for de samme tidsperioder ble anvendt som en kontroll. Etter dette ble MTT-løsning tilsatt til hver brønn. Etter 3,5 timer med inkubering ble purple krystaller dannet av mitokondriell dehydrogenase enzym av levende celler. Cellene ble sentrifugert i 5 minutter ved 1000 g, og supernatanten ble fjernet. Krystallene ble oppløst i dimetylsulfoksyd og den optiske densitet (OD) ble målt ved λ = 540 og 620 nm ved bruk av en ELISA-leser (Labsystems MS leser, Finland). OD
620 ble trukket fra OD
540 og den prosent av cytotoksisitet ble beregnet ved anvendelse av følgende ligning: hvor OD
behandlede og OD
kontroll tilsvarte de optiske tettheter av behandlede og kontrollcellene, henholdsvis. Cytotoksisitet% ble plottet som en funksjon av konsentrasjon, montert til en sigmoid kurve og IC
50 verdi ble bestemt på grunnlag av denne kurve. IC
50 representerer konsentrasjonen av biokonjugatet eller Dau nødvendig for å oppnå 50% inhibering
in vitro
.
Fremstilling av cellelysater
For å fremstille cellelysatene , 5 x 10
5 HT-29 humane tarmkreftceller per brønn ble sådd ut på 6-brønners plater. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C ble cellene behandlet i 72 timer med biokonjugatet (ved en konsentrasjon på 3 uM) eller fri Dau (ved en konsentrasjon på 0,15 uM). Celler behandlet med cellekulturmedium for den samme periode ble anvendt som en kontroll. Etter inkubering ble cellene sentrifugert i 5 minutter ved 1000 rpm, vasket med fosfat-bufret saltvann, pH = 7,3 og deretter et volum på 300 ul lysebuffer ble tilsatt til hver brønn. Prøvene ble inkubert i 30 minutter på is og deretter de isolerte proteinblandinger ble sentrifugert ved 16 000 g i 20 min ved 4 ° C. Proteininnholdet i løselige fraksjonen ble bestemt ved BCA-analyse i henhold til produsentens instruksjoner.
Protein Separasjon ved Todimensjonale-natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (2D-SDS-PAGE)
Fra cellelysatene, proteiner (500 ug /prøve) ble først utfelt med fem volumer av iskald aceton ved -28 ° C i 4 timer. Etter deres oppløsning i rehydratisering buffer inneholdende 0,6% ditiotreitol (DTT), passiv rehydratisering av 17 cm-lineær IPG strimler (pH 3-10) ble utført i 14 timer ved RT. Den isoelektrisk fokusering (IEF) ble utført ved anvendelse av en Bio-Rad IEF Protean celle instrument og de følgende parametre: (i) 0-150 V i 3 minutter, (ii) 150 V i 30 minutter, (iii) 150-300 V i 15 min, (iv) 300 V i 30 minutter, (v) 300-3500 V i 150 min, (vi) 3500 V i 12 timer. For den andre dimensjon, ble hver IPG strimmel først inkubert i 20 minutter i ekvilibreringsbuffer inneholdende 1% DTT og i ytterligere 20 min i ekvilibreringsbuffer inneholdende 2,5% jodacetamid (IAA). Strimlene ble deretter plassert på en 12% SDS gel og elektroforese ble utført i to trinn: det aktuelle ble først satt til 25 mA /gel i ~ 30 minutter og deretter til 40 mA /gel inntil det sporende farvestoff nådd den anodiske del av gelen. Etter dette separasjonstrinn, ble proteinene prefikset i 1 time med 12% trikloreddiksyre og farget over natten med Coomassie Brillant Blå G-250 inneholdende løsning. Etter avfarging bakgrunnen med 25% metanol i vann (v /v), ble gelene scannet med et GS-800 kalibrert avbildning densitometer (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munchen, Tyskland) ved hjelp av QuantityOne programvare. For hver prøve ble tre replikere 2D-geler relativt analysert ved hjelp av PDQuest 8.0-programvaren (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Tyskland), som tillot automatisk registrering med manuelle korrigeringer og kvantifisering av protein flekker. Signifikansen av forskjeller mellom protein flekker ble evaluert ved t-test og en p-verdi lavere enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Tilleggsutvalgskriterium var en fold endring verdi høyere enn to.
I-gel tryptisk Fordøyelse
Valgte protein flekker ble manuelt skåret og utsatt for i-gel tryptisk fordøyelse som tidligere rapportert [16]. Kort, avfarging av protein flekker ble oppnådd ved å utføre følgende trinn, som ble gjentatt inntil gelen bitene var gjennomsiktig: (i) inkubasjon av gel stykker med acetonitril-Milli-Q (03:02 v /v) løsemiddel blanding for 30 min; (Ii) tørkingen ved anvendelse av en speedvac (Eppendorf AG, Tyskland) og (iii) rehydratisering med 20 mM ammoniumbikarbonat (pH 8,0) i 15 min. Etter at en nyfremstilt trypsin-oppløsning (12,5 ng /mL av sekvense grad modifisert trypsin (Promega, Madison, WI, USA) i 20 mM ammoniumbikarbonat, pH 8,0) ble tilsatt til de tørkede gelbitene og inkubert ved 4 ° C i 45 min. Deretter ble den trypsinoppløsning ble erstattet med 20 mM ammoniumbikarbonat (pH 8,0) og inkubert ved 37 ° C i 12 timer. De tryptiske peptider ble ekstrahert fra gelen med en blanding av acetonitril-0,1% TFA i Milli-Q-vann (03:02, v /v) ved romtemperatur (3 x 60 min).
Massespektrometrisk analyse og protein Identification
tryptisk peptid-blandingene ble analysert ved reversfase-væskekromatografi-nanospray tandem massespektrometri (LC-MS /MS) ved anvendelse av en LTQ-Orbitrap massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Tyskland) og en Eksigent nanoHPLC (CA, USA). Det karakteristiske ved reversert-fase LC-kolonnen var 5 um, 200 Å porestørrelse C18-harpiks i en 75 um i.d. x 10 cm langt stykke av smeltet silisiumdioksyd kapillær (Hypersil C18 gull, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Tyskland). Etter injisering av prøven ble kolonnen vasket i 5 minutter med 90% eluent A (0,1% maursyre i vann) og 10% eluent B (0,1% maursyre i acetonitril). Peptidene ble eluert ved anvendelse av en lineær gradient på 10-50% elueringsmiddel B i 25 min og deretter 50 til 80% elueringsmiddel B i 5 min, ved en strømningshastighet på 300 Nl /min. Den LTQ-Orbitrap massespektrometer ble operert i en data-avhengige modus der hver hele MS skanningen ble etterfulgt av fem MS /MS-skanner, der de fem mest tallrike molekylære ioner ble dynamisk valgt og fragmentert etter kollisjon indusert dissosiasjon (CID) ved hjelp en normalisert kollisjonsenergi på 35% i LTQ ionefelle. Dynamisk utelukkelse var tillatt. Tandem massespektra ble søkt mot SwissProt protein database med Mascot (Matrix Science) med følgende parametre: «. Trypsin» cleavage med en savnet cleavage, cystein alkylering av iodoacetamide som en konstant endring og metionin oksidasjon som en variabel modifikasjon
og diskusjon
optimalisering av Cell behandlingsforhold med Bioconjugate og gratis Daunorubicin
mobil~~POS=TRUNC (dvs. inkubasjon tid og konsentrasjon) med GnRH-III [
4Lys resultater (Ac),
8Lys (Dau = Aoa)] biokonjugatet og gratis Dau ble valgt på grunnlag av
in vitro
cytotoksisitetstester data. HT-29 human colon cancerceller ble behandlet med enten biokonjugatet eller fri Dau ved forskjellige konsentrasjoner for 6, 24, 48 og 72 timer henholdsvis. Fri Dau som utøves en cytotoksisk effekt selv etter 6 timer, som var mer uttalt med tiden. Den laveste IC
50 verdi (0,26 mm) ble bestemt etter 72 timers inkubering. I motsetning til dette, biokonjugatet var cytotoksisk bare etter 72 h (IC
50 = 11,5 pM); derfor ble den behandlingstid på 72 timer bruk i videre studier proteomics. De valgte konsentrasjonene celle behandling var under IC
50 verdier, nemlig 0,15 mikrometer gratis Dau og tre mikrometer for biokonjugatet. Det er viktig å være oppmerksom på de ulike IC
50 verdier og dermed forskjellige cytotoksiske egenskaper fri og konjugert Dau som kunne forklares av sine mekanismer cellulært opptak, nemlig passiv diffusjon i tilfelle av gratis Dau
vs.
reseptormediert endocytose, som etterfølges av intracellulær prosessering av GnRH-III [
4Lys (Ac),
8Lys (Dau = Aoa)] biokonjugatet.
endringer i Protein Expression profil av HT-29 menneske~~POS=TRUNC celler etter kjemoterapeutisk behandling
etter å optimalisere behandlingsbetingelsene, HT-29 menneskelige kolon kreft celler ble behandlet i 72 timer med GnRH-III [
4Lys (AC),
8Lys (Dau = Aoa)] biokonjugatet eller gratis Dau. Cellelysater ble fremstilt i henhold til den protokoll som er beskrevet i Materialer og Metoder seksjon. Proteininnholdet av de overliggende fraksjoner ble bestemt ved BCA-analyse, og det var i gjennomsnitt 2,34 mg /ml for de ubehandlede celler anvendt som en kontroll, 2,94 mg /mL for Dau-behandlede og 3,18 mg /mL for Bioconjugate-behandlede celler.
Proteiner ble deretter separert ved 2D-gel elektroforese bruker 3-10 lineære IPG strimler og 12% geler. Etter Coomassie-farging, ble gelen mønstrene sammenlignet under anvendelse av PDQuest 8,0-programvaren. Annerledes uttrykte proteiner ble underkastet in-gel tryptisk fordøyelse, etterfulgt av nanoLC-tandem massespektrometrisk analyse av de tryptiske peptid blandinger og databasesøk. I figur 2 er de analyserte proteinene betegnet med en pil og er vist bare på styre gel. Proteinene funnet å være annerledes uttrykk etter målrettet kjemoterapeutisk behandling (endring 2; p 0,05, tabell 1 og tabell S1) kan klassifiseres i følgende undermenyer: (i) molekylære chaperons, (ii) stoffskifterelaterte proteiner og (iii) proteiner involvert i signalering.
(A) ubehandlet, (B) biokonjugatet-behandlede og (C) daunorubicin-behandlede kreftceller. Vises bare på styre gel, piler og spot tall indikerer signifikant forskjellige protein flekker.
Blant molekylære anstand, uttrykk for varme sjokk 70 kDa protein 1A /1B (Hsp70) ble funnet å være betydelig redusert etter behandling med GnRH-III [
4Lys (AC),
8Lys (Dau = Aoa)] biokonjugatet, mens gratis Dau hadde ingen merkbar effekt på sitt uttrykk i HT-29 humane tykktarmskreftceller sammenlignet med ubehandlede celler (protein sted P1). Tidligere rapporter har antydet at stress-indusert Hsp70 er en molekyl anstand marginalt uttrykt i ubetonte normale celler, men overuttrykt i forskjellige typer kreftceller. Videre har forhøyet ekspresjon av Hsp70 i kreftceller blitt forbundet med sykdomsprogresjon, metastase, resistens mot kjemoterapi og generelt dårlig prognose pasient. Disse funksjonene kan bli forklart ved sin anti-apoptotiske egenskaper, bidrar til at cellene skal overleve stressende forhold, slik som virkningen av kjemoterapeutiske midler [17] – [19]. Nedregulering av HSP70 har blitt funnet å hemme celleproliferasjon og indusere apoptose. Dermed Hsp70 har blitt foreslått som en viktig molekylære mål i kreftbehandling og det jobbes med å utvikle HSP70 modulatorer (for eksempel små-molekyl hemmere) [20] – [22]. I vårt arbeid, har behandling av HT-29 humane tarmkreftceller med en enkelt dose av fritt Dau ikke påvirker ekspresjonen av Hsp70 protein. Interessant, festingen av Dau til en GnRH-III-derivat anvendt som en målsøkende gruppe som resulterte i en biokonjugatet med hemmende egenskaper på Hsp70 (tabell 1).
Et annet protein med anstand aktivitet, noe som ble funnet å være på en annen måte uttrykkes i HT-29 celler etter deres behandling med GnRH-III [
4Lys (Ac),
8Lys (Dau = Aoa)] biokonjugatet, var Calreticulin (protein sted P2). Implikasjonene av dette proteinet i kreft har nylig gjennomgått av Zamanian
et al.
[23]. Dets overekspresjon er rapportert i forskjellige typer kreftceller (for eksempel bryst, blære, spiserøret, bukspyttkjertel, tykktarm, mage kreft, etc.) og ble funnet å være assosiert med økt invasjon, metastase og dårlig prognose [23]. Vurderer disse tidligere funn, kan Calreticulin også representere en kreft terapeutisk mål, som redusert uttrykk kan gi en terapeutisk effekt. I den foreliggende undersøkelse, i motsetning til ved behandling med fri Dau, som ikke hadde noen signifikant effekt på Calreticulin uttrykk, biokonjugatet utøves en inhiberende virkning (det vil si, sammenlignet med ubehandlede celler, i biokonjugatet behandlet som nivået av Calreticulin var i gjennomsnitt fire ganger lavere; se tabell 1)
Sammenlignet med ubehandlede og behandlede Dau-HT-29 kolon kreftceller, på behandling med biokonjugatet resulterte i redusert ekspresjon av protein-disulfid-isomerase (PDI), et multifunksjonelt protein. som spiller en viktig rolle i proteinfolding ved å katalysere dannelsen, bryte og omordning av intramolekylære disulfidbroer (protein sted P3). PDI er kjent for å operere som en anstand som hemmer aggregering av ukorrekt foldede proteiner. Videre har det blitt funnet at ekspresjonen av PDI er forhøyet i kreftcellene, og dette proteinet har blitt foreslått som en biomarkør for visse typer kreft, for eksempel kolonkreft eller melke tumorigenesis [24], [25]. Videre Goplen
et al
. har vist at PDI ble sterkt uttrykt på invasive glioma-celler, spiller en viktig rolle i tumorcellemigrering og invasjon, handlinger som kan effektivt inhiberes ved en PDI monoklonalt antistoff, så vel som bacitracin [26].
I samt molekylære anstand, ble ekspresjonen av metabolisme-relaterte proteiner som UDP-glukose-6-dehydrogenase (UGDH) påvirket av det kjemoterapeutiske behandling (protein sted P4). Mens fri Dau hadde en positiv innflytelse på UGDH uttrykk, anvendelse av biokonjugatet hadde en hemmende effekt. Sistnevnte kan bidra til kreftterapi, fordi UGDH antagonister er blitt foreslått som nyttige terapeutiske midler [27], [28]. Dette er basert på den betraktning at forhøyet glycosaminoglycan dannelse (f.eks hyaluronan), der UGDH spiller en nøkkelrolle, er involvert i en rekke menneskelige sykdommer, inkludert tumorprogresjon [29].
Både biokonjugatet og gratis Dau betydelig påvirket uttrykk for epidermal fettsyrebindende protein (E-FABP) (protein sted P5). De FABPs er multifunksjonelle proteiner som er involvert i lipidmetabolisme, men også i modulering av genekspresjon, vekst og overlevelsesreaksjonsveier, så vel som inflammatoriske og metaboliske responser [30]. Videre endrede ekspresjonsmønstre FABP ble beskrevet for ulike typer av kreft, noe som tyder på at FABPs spiller en viktig rolle i kreftutvikling. For eksempel, i en fersk undersøkelse utført av Junqin Li
et al.
Det har blitt funnet at E-FABP, samt Liver-FABP og Hjerte- eller muskel-FABP, er involvert i utviklingen av invasive ductal brystkreft, ettersom deres nivåer var signifikant forhøyet i duktalt karsinom infiltrerende forhold til fibroadenoma [31]. Øket ekspresjon av E-FABP ble også påvist i endometriecancer og kjemoresistent bukspyttkjertelcancercellelinjer [32], [33]. Således kan E-FABP representere en annen molekylære mål i kreftterapi
Selv om det ikke i betydelig grad påvirket av kjemoterapeutisk behandling, ekspresjonen av Ran-spesifikk GTPase-aktiverende protein. (Også kalt Ran-bindende protein 1; RanBP1) (protein sted P6) ble redusert etter behandling med biokonjugatet (2,21 ganger endring, p = 0,05). Ran er en liten GTPase som fungerer som en bryter molekyl ved å binde til enten GTP og GDP. Et viktig regulator av denne fremgangsmåte er Ran-spesifikk GTPase-aktiverende protein (RanBP 1), som også katalyserer GTP hydrolyse av Ran. Det har blitt funnet at løp og løp bindende proteiner er involvert i et bredt spekter av fundamentale cellulære prosesser (f.eks nucleocytoplasmic transport, mitotisk spindelenheten, kjerne konvolutt og kjerne pore kompleksdannelse) så vel som i celledød, celleproliferasjon, celledifferensiering og malign transformasjon (se [34] for gjennomgang). Videre har det blitt rapportert at ekspresjon av Ran og RanBP1 økes i ulike typer av kreft, og at oppheving av RanBP1 kan føre til celledød. Tatt sammen disse resultater, har det blitt foreslått at både Ran og Ran-spesifikk GTPase-aktiverende protein som er gode kandidater som molekylære mål i kreftterapi [34], [35].
I forhold til den ubehandlede HT-29 tykktarmskreftceller, ekspresjon av guanin nukleotid-bindende protein-subenhet beta-2-lignende 1 (GNB2L1, også kjent som reseptoren av aktivert protein kinase C 1, RACK1) (protein sted P7) ble påvirket av behandling med biokonjugatet, men ikke signifikant (2,25 ganger endring; p = 0,0773). Men uttrykket av dette proteinet var signifikant forskjellig i biokonjugatet
vs.
Dau behandlede celler (p = 0,0113), et lavere beløp som blir oppdaget i biokonjugatet behandlede celler. GNB2L1 har blitt funnet å spille en avgjørende rolle i flere intracellulære signaltransduksjonsveier. Når det gjelder dens mulige implikasjoner i kreftutvikling og progresjon, har det vist seg at RACK1 fremmer brystkreft spredning og invasjon /metastase
in vitro Hotell og
in vivo Hotell og dens uttrykk er assosiert med dårlig prognose. Videre reduksjon av RACK1 uttrykk førte til inhibering av celleproliferasjon
in vitro product: [36]. Lignende resultater har også blitt rapportert ved andre typer kreft som ikke-småcellet og tykktarmskreft [37].
I konklusjonen, behandling med daunorubicin-GnRH-III derivat biokonjugatet medført endringer i protein ekspresjonsprofilen av HT-29 colon cancerceller. Spesielt molekylære chaperons, metabolisme relaterte proteiner og proteiner involvert i signale ble påvirket av målrettet kjemoterapeutisk behandling, blir deres uttrykk nedregulert i Bioconjugate behandlede celler sammenlignet med ubehandlede og Dau-behandlede seg. Tidligere studier har vist konsekvensene av disse proteinene i kreft, noe som indikerer at deres nedregulering kan være av terapeutisk nytte (f.eks Hsp70, protein disulfide isomerase, etc). Framskritt i kreftbehandling har foreslått betydningen av mot mer enn ett protein eller signalveien. En mulig måte å oppnå dette kan bli målrettet cancerkjemoterapi. På bakgrunn av våre resultater, kan det konkluderes med at GnRH-III [
4Lys (AC),
8Lys (Dau = Aoa)] biokonjugatet utøver sin cytotoksiske handling på HT-29 kolon kreftceller ved å forstyrre flere intracellulære prosesser og representerer en lovende målrettet kjemoterapeutisk middel.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Syntese av oksimbinding bundet daunorubicin-GnRH-III derivat biokonjugatet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0094041.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Kjemisk karakterisering av GnRH-III [
4Lys (AC),
8Lys (Dau = Aoa)] biokonjugatet. (A) analytisk HPLC-profil og (B) ESI-ion trap mass spektrum. Fragmentering av glykosidbindinger henhold massespektrometri forhold, som fører til tap av daunosamin, er merket med en stjerne
doi:. 10,1371 /journal.pone.0094041.s002 plakater (TIF)
Tabell S1. .
Kjennetegn på de identifiserte proteiner med endret uttrykk på grunn av kjemoterapeutisk behandling av HT-29 tykktarm kreft celler
doi: 10,1371 /journal.pone.0094041.s003 plakater (DOC)
Protocol S1.
Syntese av aminooxyacetylated-GnRH-III derivat
doi:. 10,1371 /journal.pone.0094041.s004 plakater (DOC)
Protocol S2.
Høy ytelse væskekromatografi (HPLC)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0094041.s005 plakater (DOC)
Protocol S3.
Massespektrometrisk analyse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0094041.s006 plakater (DOC)
