Abstract
Nyere studier har konferert at
RAD51C Hotell og
RAD51D
gener som koder for de essensielle proteiner involvert i homolog rekombinasjon, er eggstokkreft (OC) mottakelighet gener som kan forklare genetiske risikoen i høyrisikopasienter. Vi utførte en mutasjon analyse i 171 høyrisiko
BRCA1 Hotell og
BRCA2
negative OC pasienter, for å vurdere hyppigheten av arvelig
RAD51C Hotell og
RAD51D
varianter i tsjekkiske befolkningen. Analysen er involvert direkte sekvensering, høy oppløsning, smelting og flerringsavhengige probe-analyse. Vi identifiserte to (1,2%) og tre (1,8%) inaktivere germline mutasjoner i begge respektive gener, hvorav to (c.379_380insG, p.P127Rfs * 28 i
RAD51C Kjøpe og c.879delG, p.C294Vfs * 16 i
RAD51D
) var romanen. Interessant, en veiledende familie kreft historie var ikke til stede i fire bærere. Videre aldre på OC diagnoser i identifiserte mutasjonsbærere var vesentlig lavere enn det som er rapportert i tidligere studier (fire bærere var yngre enn 45 år). Videre har vi også beskrevet sjeldne missense varianter, to i
RAD51C Hotell og ett i
RAD51D
som klinisk betydning må verifiseres. Avkorting mutasjoner og sjeldne missense varianter konstatert i OC pasienter ble ikke oppdaget i 1226 kontrollprøver. Selv om den kumulative hyppigheten av
RAD51C Hotell og
RAD51D
avkorting mutasjoner i våre pasienter var lavere enn for
BRCA1 Kjøpe og
BRCA2
gener, kan det forklare OC mottakelighet i ca 3% av høyrisiko OC pasienter. Derfor en
RAD51C Hotell og
bør implementeres RAD51D
analyse inn i omfattende multi-gentesting for høy risiko OC pasienter, inkludert tidlig debut av OC pasienter uten en familie kreft historie.
Citation: Janatova M, Soukupova J, Stribrna J, Kleiblova P, Vocka M, Boudova P, et al. (2015) Mutasjon Analyse av
RAD51C Hotell og
RAD51D
Gener i høyrisiko eggstokkreft Pasienter og Familier fra Tsjekkia. PLoS ONE 10 (6): e0127711. doi: 10,1371 /journal.pone.0127711
Academic Redaktør: Klaus Brusgaard, Odense Universitetssykehus, DANMARK
mottatt: 23 januar 2015; Godkjent: 17 april 2015; Publisert: 09.06.2015
Copyright: © 2015 Janatova et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Internal Grant Agency, Helsedepartementet, Tsjekkia, NT13343, (https://www.mzcr.cz/Cizinci/) ; PP, Charles University i Praha, PRVOUK-P27 /LF1 /1, (https://www.cuni.cz/UKEN-1.html); MJ, Charles University i Praha, SVV-UK 3362-2014, (https://www.cuni.cz/UKEN-1.html); PB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft (OC) er den mest dødelige gynekologisk kreft, men det utgjør bare 3% av kvinnelige kreft på verdensbasis. Dens ugunstig prognose knyttet til en høy prosentandel av sent stadium diagnose rangerer OC til fjerdeplass blant de vanligste kreftrelaterte dødsårsaken i befolkningen kvinnelige [1]. Dens forekomst i Tsjekkia er 23/100 000 individer og dødelighet utgjør 15/100 000 individer [2].
Den viktigste risikofaktoren er en familie OC historie. Det har vært antatt at arvelig disposisjon står for minst 10% av OC tilfellene [3]. Derfor er identifisering av kvinnen bærer sykdomsfremkallende mutasjoner i OC-mottakelighet gener en viktig oppgave som muliggjør tilpasset OC forebygging i høy-risiko befolkning. Flertallet av arvelig OC (HOC) tilfeller er også forbundet med en økt risiko for brystkreft (BC) og de hyppigste sykdomsfremkallende mutasjoner i arvelige bryst og /eller eggstokkreft (HbOC) kreft familier påvirke
BRCA1
genet og i mindre grad også
BRCA2 product: [4]. Begge genene spiller en viktig rolle i forbindelse med reparasjon av DNA dobbel-tråd pauser (DDSB). Nylig flere gener ble beskrevet som i forbindelse med HOC, blant dem
RAD51
paraloger
RAD51C Hotell og
RAD51D
.
Både gener koder for proteiner involvert i genomet stabilitet vedlikehold, og de deltar i den homologe rekombinasjon-mediert DDSB reparasjon [5,6]. Innledende studier rapporterte
RAD51C
genet (MIM: 602774) som en annen Fanconi anemi (FA) genet betegnet som
FANCO
fordi dens biallelic germline mutasjoner ble funnet hos en pasient med FA-lignende fenotype tilsvar til komplemente gruppe O [7]. Den banebrytende arbeid Meindl et al. viste at
RAD51C
er en OC mottakelighet gen med en mutasjon frekvens på 1,3% i HbOC pasienter [8]. Siden da har flere studier vist seg rollen som
RAD51C
genet i OC utvikling hos opptil 2,5% av høyrisiko HbOC familier [9,10,11,12] inkludert sjeldne store genomiske rearrangements [13] .
En studie av Loveday et al. rapportert at germline mutasjoner i
RAD51D
genet (MIM: 602954) konferere mottakelighet for OC i 0,9% av HbOC familier (hovedsakelig med mer enn ett tilfelle av OC) og beregnet relativ risiko (RR) på 6,3 for OC og 1,32 for BC [14]. Flere andre studier har bekreftet sin rolle i OC mottakelighet [15,16,17,18]
Mens individuelt sjeldne, sammen alle moderat penetrans gener kan bidra til en betydelig del av OC risiko.; men deres frekvenser varierer i ulike populasjoner [19]. Målet med vår studie var å bestemme hyppigheten av germline mutasjoner i
RAD51C Hotell og
RAD51D
blant høyrisiko OC tsjekkiske pasienter negativt testet for
BRCA1 Hotell og
BRCA2
mutasjoner.
Metoder
Pasienter
Vi analyserte 171 DNA-prøver (hentet fra perifert blod) fra
BRCA1 Hotell og
BRCA2
negative OC pasienter samlet på vårt institutt mellom 2000 og 2013. De tilhørte enten en familiær gruppe (N = 62) eller en gruppe uten familie kreft historie (N = 109; Tabell 1) [20]. Kontrollgruppen bestod av anonymiserte DNA-prøver tatt fra 1.226 personer, inkludert 756 ikke-kreft enkeltpersoner og 470 blodgivere, som beskrevet tidligere [21,22].
Alle pasienter og kontroller var av sentraleuropeisk avstamning av tsjekkisk opprinnelse fra Praha regionen. Studien ble godkjent av etisk komité general universitetssykehus i Praha, og alle deltakerne ga sin skriftlig informert samtykke til bruk av lagret DNA /RNA prøver for forskningsformål.
Mutasjon analyse
alle individuelle koding eksoner (med intron-exon grenser) atskilt av store intronic regioner i
RAD51C
genet ble PCR-forsterket (primere er oppført i S1 tabell) og analysert av en høy oppløsning smelting (HRM) analyse på Lyset Cycler 480 (Roche) med en HOT FirePol EvaGreen HRM Mix (Solis biodyne) i henhold til produsentens instruksjoner.
Varianter i prøver med en avvikende smelteprofil ble bekreftet ved direkte sekvensering fra separate PCR reaksjoner ved bruk av BigDye v3.1 på ABI3130 (Applied Biosystems).
Alle koding eksoner (inkludert intron-exon grenser) som danner fire exonic klynger av
RAD51D
genet ble amplifisert ved PCR og analysert ved direkte sekvense (PCR og sekvense primere er oppført i S1 tabell).
Alle eksoner med de identifiserte mutasjoner ble vist i 1.226 kontrollprøver av en HRM analyse og variant prøvene ble bekreftet ved sekvensering.
Påvisning av store genomiske rearrangements (LGRs)
P260-A1 Kit ble brukt til en multiplex ligation avhengig probe forsterkning (MLPA) analyse i
RAD51C
henhold til produsentens protokoll. De amplifiserte produkter ble separert på ABI3130 og analysert ved MRC Coffalyser programvare (MRC Holland). Den MLPA kit for
RAD51D
analyse var ikke tilgjengelig fra noen leverandør på tidspunktet for analysen.
cDNA analyse
For å bestemme effekten av intronic variant c. 1026 + 5_1026 + 7delGTA flanke til intron-exon grensen i
RAD51C
vi utført en cDNA basert analyse. Den totale RNA isolert fra venøs blod ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av Super III revers transkriptase (Life Technologies) etter produsentens protokoll. PCR fragment som strekker seg over de involverte regionen ble forsterket (primere er i S1 tabell). PCR produkt som inneholder vill-type og avvikende fragmenter ble sekvensert for å karakterisere avvikende spleising variant.
I silico
analyse
patogenitet for missense varianter ble vurdert ved hjelp av SIFT , PolyPhen, Align GVGD, og CADD rilleverktøy som beskrevet tidligere [21,22]. Frekvenser av identifiserte varianter ble konstatert i NHLBI Exome Sequencing Project (ESP, https://esp.gs.washington.edu/drupal/). Og 1000 genomer (https://www.1000genomes.org/) databaser
Resultater
Patogene mutasjoner fører til avkorting av protein produkter ble identifisert i fem av 171 (3%) med høy risiko OC pasienter, to (1,2%) i
RAD51C Hotell og tre ( 1,8%) i
RAD51D plakater (tabell 2). To patogene forandringer var romanen. Ingen LGR ble funnet i
RAD51C
genet, men vi kunne ikke utelukke en tilstedeværelse av LGRs i
RAD51D
gen som ikke ble analysert fordi MLPA kit var utilgjengelig i den tiden av analysen. Ingen av de identifiserte endringer ble funnet i 1.226 ikke-kreft-kontroller. Alderen på diagnose og familiens historie av kreft i mutasjoner «bærere er vist i Tabell 2.
En roman c.379_380insG (p.P127Rfs * 28) variant i
RAD51C
ble funnet i en ung OC pasient som døde 12 måneder etter diagnosen mucinous adenokarsinom. En annen
RAD51C
avkorting variant var et spleise-site endring, c.1026 + 5_1026 + 7delGTA, identifisert hos en pasient som utviklet livmorkreft syv år etter at diagnosen eggstokkreft serøs adenokarsinom. Den patogene potensialet i denne endringen ble demonstrert av cDNA analyse som viste avvik ekson 8 hoppe, som resulterte i rammeskift og for tidlig avslutning av oversettelses produkt (p.R322Sfs * 22; Fig 1). Denne varianten ble tidligere rapportert en gang i en kontroll og en pasient, henholdsvis ved Loveday
et al
. og i en studie av Golmard
et al
. [10,11].
elektroforese (til venstre) av PCR-produktene amplifisert med primere lokalisert i exon 5 og 3 «UTR-sekvens (tabell S1) viser to produkter i en pasient No.1273 sammenlignet med en vill- skriv kontroll (C) prøve. Sekvense kromatogram av pasientens PCR-produktet viser tilstedeværelse av abnorme spleiset mRNA med ekson 8 hoppe
Den eneste avkorting mutasjonen beskrevet recurrently i vår studie var c.694C . T (p.R232 *) i
RAD51D
, som finnes i to urelaterte unge OC pasienter med serøs adenokarsinom og ingen familie kreft historie. Den tidligere diagnostisert pasient døde av OC formidling 10 år etter diagnosen. Denne varianten er tidligere beskrevet i spanske og amerikanske HbOC pasienter [18,16]. En roman
RAD51D
mutasjon, c.879delG (p.C294Vfs * 16), ble funnet i en OC pasient med en datter som lider av BC og OC falskhet.
I tillegg til avkorting varianter, vi funnet tre sjeldne missense varianter (tabell 2). Den c.641G A (p.R214H) mutasjon i
RAD51C
ble nylig identifisert i en BC kvinnelig av afrikansk opprinnelse [12] og beskrevet som en lav risiko variant basert på hennes familiehistorie som er i samsvar med programvare spådommer. Den andre sjeldne missense variant c.947A G (p.H316R) var romanen; Men begge disse endringer i
RAD51C
ble spådd som ikke-sykdomsfremkallende. Den eneste sjeldne variant- c.629C T (p.A210V) -i
RAD51D
ble beskrevet tidligere [18] og ble spådd som sykdomsfremkallende (tabell 2)
Annet oppdaget sekvensvarianter. presentert i en dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) eller HGMD (https://portal.biobase-international.com/hgmd/pro/start.php) databaser som polymorfismer er oppført i S3 tabell.
Diskusjoner
Vi identifiserte kimcellelinje avkorting mutasjoner i
RAD51C Hotell og
RAD51D
gener i 1,2% og 1,8% av analysert høy- risiko individer, henholdsvis, noe som er i overensstemmelse med tidligere studier [23,24]. Vår studie gir ytterligere bevis på at både gener gi en begrenset, men klinisk bemerkelsesverdig andel av OC mottakelighet.
Første studiene rapporterte skadelige avkorting mutasjoner i
RAD51C
og
RAD51D
gener overveiende i HbOC familier med to eller flere OC tilfeller [8,14]. Men vi fant de fleste (fire av fem klart skadelige mutasjoner, tabell 2) i en undergruppe av 109
BRCA1 Hotell og
BRCA2
negative OC pasienter uten BC eller OC familiens historie. Dette er i samsvar med senere studier som identifiserte
RAD51C Hotell og
RAD51D
mutasjoner i en uselektert populasjon av OC pasienter [25,16]. Disse resultatene tyder på at omfattende genetisk testing av
RAD51C Hotell og
RAD51D
gener i OC pasienter bør ikke være begrenset kun til høyrisiko OC pasienter med en tilsynelatende familiehistorie, og en analyse av alle OC pasienter bør vurderes uavhengig av familien kreft historie og debutalder [26].
de gjennomsnittlige alderen OC utbruddet for kvinner med
RAD51C Kjøpe og
RAD51D
mutasjoner publisert i tidligere studier var 60 år for
RAD51C plakater (anmeldt i [23]) og 56,6 år for
RAD51D plakater (S4 tabell). Sopik
et al
. foreslått den forebyggende kirurgi for å bli forsinket inntil etter naturlig menopause. Likevel, i vår studie gjennomsnitts alderen OC utbruddet i bærere av avkorting varianter var 26,0 år for
RAD51C plakater (25 og 27 år, henholdsvis) og 48,7 år for
RAD51D plakater (37, 43 og 66 år, henholdsvis). Mens et lite antall mutasjonsbærere kan påvirke denne observasjonen, antar vi at det faktum at fire av fem bærere av sykdomsfremkallende mutasjoner i
RAD51C
og
RAD51D
gener var premenopausale kvinner yngre enn 45 år kan være av klinisk betydning. Derfor videre studier av operatører i begge gener er nødvendig å estimere de kliniske anbefalinger for risikoreduserende bilateral salpingo-ooforektomi (RR-BSO) og frem til da, bør tidligst utbruddet av OC i familien tas hensyn til. Nylig, Baker et al. rapportert RR-BSO i en 39 år gammel kvinnelig BC pasienten bærer
RAD51D
mutasjon fra familie med flere BC (men ingen OC) tilfeller [24].
I vår studie, bare en proband, bærer patogene
RAD51C
mutasjon, vises familie kreft historie som inkluderte OC og BC tilfeller. Siden tidligere studier rapporterte ingen økt risiko for BC for bærere, senere studier beskrevet noen
RAD51C Hotell og
RAD51D
avkorting mutasjoner i BC bare familier [13,27,28,18,24]. Selv om disse mutasjonene synes å være svært sjelden i BC pasienter, er de sannsynligvis ansvarlig for visse BC predisposisjon. Stamtavlene av mutasjonsbærere inkludere andre krefttilfeller (endometrial, leukemi, skjoldbruskkjertelen), hvis tilknytning til mutasjoner bør videre analysert i detalj.
Vi har også identifisert tre sjeldne missense endringer i begge genene (tabell 2, S2 Bord). Bare c.629C T, p.A210V sjelden missense variant i
RAD51D
genet ble spådd å være skadelig konsekvent i alle programvare prediksjon verktøy. Imidlertid kan det patogenitet ikke bekreftes uten ytterligere segregering og /eller funksjonelle analyser. Dessverre var vi ikke i stand til å utføre en co-segregering analyse i andre familie slektninger.
pene for mutasjoner i moderate penetrans gener er ikke lett å anslå [29]. Til å begynne med Meindl et al. rapporterte en komplett segregering av
RAD51C
mutasjoner i HbOC familier [8]. Videre studier beregnet relativ risiko (RR) av OC for mutasjonsbærere i
RAD51C plakater (RR = 5,9) og
RAD51D plakater (RR = 6,3) [10,14]. Pelttari
et al
. oppdaget en odds ratio (OR) for finske grunnlegger mutasjoner i hvert gen i en uselektert befolkning til å være 6,3 og 7,1 henholdsvis [30,15]. Disse dataene antyder at OC risiko overstiger terskelen for moderate penetrans gener i
RAD51C Hotell og
RAD51D
mutasjoner transportører og både gener har klinisk betydning for diagnostisk testing og forebyggende tiltak for bærere som involverer både OC og BC ledelse. Videre studier og meta-analyser av publiserte data fra ulike bestander over hele verden er nødvendig for å beregne pene i
RAD51C Hotell og
RAD51D
mutasjonsbærere overbevisende.
Den kliniske nytten av identifisering av
RAD51C Hotell og
RAD51D
mutasjonsbærere er ikke begrenset til prediksjon av kreft mottakelighet bare. Begge proteiner er involvert i DNA-skade signalering og DDSB reparasjon funksjonelt samarbeide med BRCA1 og BRCA2 i prosesser av homolog rekombinasjon (HR). En svikt i denne reparasjonsveien som kunne forventes hos kreftpasienter som bærer germline patogene mutasjoner i
RAD51C Hotell og
RAD51D
sensitizes kreftceller til PARP-hemmere; derfor pasienter bærende kimcellelinje
RAD51C Hotell og
RAD51D
mutasjoner kan ha nytte av denne behandlingen [14].
I konklusjonen, vi beskrev nye patogene varianter i
RAD51C
og
RAD51D Hotell og viste at avkorting mutasjoner i begge genene kan bli funnet i 3% av høyrisiko tsjekkiske OC pasienter. Våre resultater tyder på at utbruddet av OC i mutasjonsbærere kan være yngre enn forventet. Vi foreslår som bør implementeres i den omfattende multi-gen panel testing i høyrisiko OC pasienter mutasjon analyse av
RAD51C Hotell og
RAD51D
. Imidlertid kan videre studier i ulike populasjoner bidra til å forbedre estimatene for den kliniske effekten for germline mutasjonsbærere og la fastsettelse av passende screening, oppfølging, eller forebygging strategier.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table . . PCR primer sekvenser
Oppsummering av PCR primere som brukes for sekvensering, cDNA og HRM analyser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0127711.s001 plakater (docx)
S2 Table.
I silico
prediksjon for missense varianter.
Tippe analyse av identifiserte sjeldne missense varianter i
RAD51C Hotell og
RAD51D
gener og hyppigheten av disse variantene i exome sekvense . og 1000 genom prosjekter
doi: 10,1371 /journal.pone.0127711.s002 plakater (docx)
S3 Table.
RAD51C Hotell og
RAD51D
sekvensvarianter
tidligere beskrevet endringer (polymorfismer, intronic varianter) funnet i vår studie
doi:.. 10,1371 /journal.pone.0127711.s003
(docx)
S4 Table. Kjennetegn på pasienter bærende
RAD51D
patogene mutasjon
alder av utbruddet av 21 OC pasienter og 15 BC pasienter bærende
RAD51D
mutasjoner i studier publisert så langt
doi:.. 10,1371 /journal.pone.0127711.s004 product: (docx)
Takk
Dedikert til minne om vår kollega og venn, Petr Pohlreich, som gikk bort når manuskriptet ble skrevet.
Vi ønsker å takke Marie Epsteinova og Marketa Dostalova for deres utmerkede teknisk støtte og pasienter og deres familier for bidrag i denne studien.
