Abstract
Genetiske polymorfismer i oksidativt stress pathway gener kan bidra til kreftutvikling, tilbakefall av sykdommen, behandlingsrespons, og kliniske resultater. Vi søkte en vei basert tilnærming for å fastslå effekten av flere enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) i denne veien på kliniske resultater i ikke-muskel-invasiv blærekreft (NMIBC) pasienter behandlet med Bacillus Calmette-Guérin (BCG). Vi genotypede 276 SNPs i 38 gener og evaluert sine assosiasjoner med kliniske resultater i 421 NMIBC pasienter. Tjueåtte SNPs ble assosiert med tilbakefall i BCG-behandlede gruppen (
P
0,05). Seks SNPs, inkludert fem i
NEIL2
genet fra den generelle og BCG gruppen forble signifikant assosiert med tilbakefall etter flere sammenligning justeringer (
q
0,1). Akkumulert ugunstig genotype analyse viste at risikoen for tilbakefall øker med økende antall ugunstige genotyper. I analysen av risikofaktorer forbundet med progresjon til sykdom, rs3890995 i
UNG
, forble signifikant etter justering for multippel sammenligning (
q
0,1). Disse resultatene støtter hypotesen om at genetiske variasjoner i verts oksidativ stressgener i NMIBC pasienter kan påvirke effekten av behandlingen med BCG
Citation. Wei H, Kamat A, Chen M, Ke HL, Chang DW, Yin J, et al. (2012) Association of Polymorfisme i oksidativt stress Gener med klinisk utfall for blærekreft Behandlet med Bacillus Calmette-Guérin. PLoS ONE 7 (6): e38533. doi: 10,1371 /journal.pone.0038533
Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA
mottatt: 08.12.2011; Godkjent: 06.05.2012; Publisert: 12 juni 2012
Copyright: © 2012 Wei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av tilskudd fra National Institutes of Health /National Cancer Institute: U01 CA 127 615, R01 CA 74880, P50 CA 91846, og R01 CA 131335 (https://www.cancer.gov/researchandfunding). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i USA er blærekreft den fjerde vanligste kreft og den åttende største dødsårsaken av kreft hos menn, med anslagsvis 69,250 nye tilfeller og 14990 dødsfall i 2011 [1]. De fleste (75% -85%) blærekreft er ikke-invasiv muskel først diagnose, som omfatter overfladisk ikke-invasiv (PTA), minimal-invasiv (PT1) eller carcinoma in situ (CIS) [2]. Totalt blærekreft tilbakefall av ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC) har blitt rapportert å være 31-78% på 5 år, og for høyrisikogrupper, vil 17-45% av pasientene videre til muskel invasiv sykdom på 5 år [3 ] – [4]. Transurethral reseksjon (TUR) er gullstandarden for diagnostisering og lav risiko Ta T1 overgangsordning celle carcinoma (TCC) behandling [5]. Men tilbakefall på 3 måneder for pasienten med multifokale svulster varierte mellom 7% og 46%, noe som tyder på forskjellige TUR kvaliteter [5].
Kreftceller viser ofte en økt nivå av DNA oksidasjonsprodukter og oksidasjon-indusert mutasjoner [ ,,,0],6]. Oksidativt stress fører til protein, lipid og DNA-skade, og er en kritisk hendelse patofysiologisk implisert i en rekke humane sykdommer, inkludert kreft [7] – [8]. Imidlertid kan akselereres reparasjon av oksydert DNA beskytte cancerceller mot skadelige oksidativ DNA-skade [9] og er forbundet med metastase og dårlig pasientoverlevelse [10]. Mange oksidative stressgener, for eksempel e
NOS, MnSOD, etter og
GPX
er polymorfe og har blitt studert i forbindelse med kreftrisiko og kliniske utfall [11] -. [14]
for å redusere tilbakefall og progresjon av NMIBC, intravesikal installasjon av Bacillus Calmette-Guérin (BCG) er ofte gitt etter TUR. BCG administrasjonen har blitt rapportert å indusere lokal oksidativt stress, som kan mediere den antitumoraktivitet [15]. Vi antok at polymorfismer av oksidativt stress-pathway gener kan modulere risiko for tilbakefall og progresjon i BCG behandlede pasienter. For å teste denne hypotesen, gjennomførte vi en studie for å evaluere effekten av 276 single-nukleotid polymorfismer (SNPs) i 38 viktige gener fra oksidativt-stress veien. Så vidt vi vet, er dette den første studien å utforske sammenhengen mellom et omfattende panel av polymorfismer av oksidativt stress-pathway gener og risiko for tilbakefall eller progresjon i NMIBC pasienter, særlig hos de som fikk BCG behandling.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter før innmelding i denne studien. Studien ble godkjent av Institutional Review Boards ved MD Anderson Cancer Center og Baylor College of Medicine.
Studiepopulasjon
Studiet befolknings og påmelding prosedyrer ble beskrevet tidligere [16]. Pasientene ble rekruttert fra The University of Texas MD Anderson Cancer Center og Baylor College of Medicine som en del av en pågående prosjektet siden 1999. Alle pasientene ble identifisert ved gjennomgang av daglig elektronisk klinikk planer ved Urologi og GU Medical Oncology klinikker. De NMIBC pasienter ble nylig diagnostisert, histologisk bekreftet, og hadde ikke tidligere blitt behandlet med kjemoterapi eller strålebehandling ved rekruttering. Det var ingen restriksjoner for alder, kjønn, etnisitet, histologi eller scene på rekruttering. Siden mer enn 90% av våre rekruttert tilfeller var overgangscellekreft (TCC), vi bare tatt med TCC tilfeller i denne studien. I tillegg er flertallet av pasientene i vår studie befolkningen (90,6%) var kaukasiere; derfor begrenset vi analysen til kaukasiere å begrense konfunderende effekt av befolkningen lagdeling. Totalt 421 NMIBC pasienter ble inkludert i denne studien.
epidemiologisk og klinisk datainnsamling
M.D. Anderson ansatte intervjuere administrert en 45-minutters personlig intervju til alle deltakerne til å samle inn data om demografiske karakteristika, tobakksbruk historie, medisinsk historie, yrke og eksponering, og slektshistorie av kreft. På slutten av intervjuet, alle deltakerne donert en liten blodprøve for DNA-ekstraksjon før du får noen behandling. Pasienter som behandles med TUR ble fulgt opp med periodiske cystoskopisk undersøkelser, og deretter noen ble behandlet med BCG. Denne behandling besto av enten BCG til 6 ukentlige instillasjoner (induksjon BCG, iBCG) eller iBCG + vedlikehold BCG (mBCG) i 3 ukentlige sykluser angitt ved 3, 6, 12, 18, 24 og 30 måneder etter iBCG [17]. Kliniske data ble hentet fra pasientjournaler ved trente chart gjennomgang spesialister. Endepunktene av utfallet vurdering i denne studien inkluderte tilbakefall og progresjon, som ble beregnet fra datoen for diagnose til datoen for endepunkt, død eller siste oppfølging, avhengig av hva som kom først. Tumorresidiv ble definert som en nylig oppdaget blære tumor etter en negativ oppfølging systoskopi, og tumorprogresjon ble definert som overgang fra ikke-muskel-invasiv til invasive eller metastatisk sykdom. Pasienter som døde eller ikke fulgt opp før endepunkt ble sensurert
Utvalg og Genotyping polymorfismer i oksidativt stress-Pathway Gener
Vi utarbeidet genet listen ved hjelp SNPs3D bioinformatiske verktøy (http: /. /www.snps3d.org) [18]. Vi identifiserte tagging SNPs fra Hapmap database (https://www.hapmap.com). I likhet med vår tidligere studie [19], alle SNPs passer følgende kriterier:
r
2
0,8, mindre allel frekvens (MAF) 0,05, og ligger innen 10 kb oppstrøms av 5 «utranslaterte region (UTR) og 10 kb nedstrøms fra 3»-UTR av genet. Vi inkluderte også potensielt funksjonelle SNPs med MAFs 0,01 (f.eks koding SNPs og SNPs i UTR, arrangører, eller spleiseseter) sikret genotyping ble utført ved hjelp av Illumina er IVelg tilpasset SNP array (Illumina, San Diego, California) og gjennomsnittlig samtale hastigheten var 99,7%
luciferaserapportørplasmid analyse for å bestemme effekten av NEIL2. rs4639 Alleler på forordning av NEIL2 Expression av microRNAs
En reporter konstruksjon som stammer fra pGL3 (Ambion) som inneholder 3′ UTR av
NEIL2
ble generert på følgende måte: en 1,35-kb fragment av
NEIL2
3′-UTR ble forsterket fra genomisk DNA med følgende primere: Forward1, 5′-GAAGATGGGTTACAGAGGCT; Reverse1, 5′-CAGACATCGTGGTGACAGAG. Deretter ble en 0,35-kb nestet PCR fragment av 3′-UTR inneholder rs4639 generert med primere: Forward2, 5’AATTCTAGAGGGATACAGGCACCAAGAGGCGG; Reverse2, 5’GTAGGCCGGCCGCGAGTAACAGTGAGCTTTAT. Det amplifiserte produkt ble spaltet med Xbal og FseI og subklonet inn i pGL3 kontroll vektor. Variant
NEIL2
allel konstruksjon ble generert ved seterettet mutagenese med primere. Forward3, 5’GATTTGTTGgACAATTCAGGAATCAAGG og Reverse3, 5′-TCCTGAATTGTcCAACAAATCAACAGTCAC
UM-UC-9 blære epithelial kreftceller var vennlig levert av Dr. Barton Grossman laboratorium og ble godkjent i løpet av seks måneder før vår studie [20]. UM-UC-9-celler ble transfektert med 0,5 ug av vill-type eller varianten
NEIL2
3′-UTR konstruere sammen med 5 pmol av negativ kontroll RNA (kryptert sekvens), MIR-421, eller speil 1200 mikroRNA (miRNA) etterligner (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og 10 ng av pGL4 Renilla luciferase reporter (Ambion, Carlsbad, California) bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) i 36 timer. Reporteren uttrykk ble analysert ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega, Madison, WI) og luciferase aktiviteter ble målt i en FLUOstar Optima mikroplateleser (BMG Labtech, Cary, NC). Hver analysen ble gjentatt uavhengig tre ganger med fem replikater.
Statistiske analyser
statistiske analysene ble utført ved hjelp av Stata 10,0 (Stata Corp., College Station, TX, USA). Den χ
2 test (for kategoriske variabler) eller Student
t
-test (for kontinuerlige variabler) ble brukt til å sammenligne egenskapene mellom grupper av pasienter med eller uten sykdom utfallet. Koblingsulikevekt (LD) mellom enkelt SNPs ble evaluert, med
r
2
0.8 ble definert som å være i samme haplotype blokk
For hver pasient, beregnet vi gjentakelse. -fri overlevelse som tid fra diagnose til gjentakelse, progresjon eller til dødsdato eller siste oppfølging. Pasienter som ble tapt for oppfølging eller døde før sluttpunktet hendelsen ble sensurert. Vi beregnet årsverk i fare innenfor hver genotype kategori som summen av tilbakefall overlevelse tider av alle fag i det genotype kategorien. Effektene av genotyper av SNPs på blærekreft utfall ble estimert som hazard ratio og 95% konfidensintervall (95% KI) ved hjelp av multivariat Cox regresjon under dominerende, recessive, og additive modeller av arv justert for alder, kjønn og røykestatus, der det er hensiktsmessig. For å kontrollere for flere forhold, en
q
verdi (en falsk funnrate [FDR] -adjusted
P
verdi) ble brukt til å justere signifikansnivået for individuelle SNPs.
q
verdi ble beregnet av
q
verdi-pakken implementert i R-programvaren. En bootstrap resampling metode, ved anvendelse av 100 bootstrap prøvene, ble påført internt bekrefte resultatene.
P
for trendverdien ble beregnet med antall ugunstige genotyper som kontinuerlig variabel ved hjelp ubetinget Cox regresjon.
Alle analyser ble fordelt etter alder, kjønn, røykestatus, tumor stadium, svulst klasse, og behandling. For den kumulative effekten av flere genetiske varianter, ble de negative genotyper summert og kategorisert med antall uønskede genotyper i fag. For å vurdere den kumulative effekten av genetiske varianter, vi oppsummerte uønskede genotyper (genotyper forbundet med betydelig økt risiko i hovedeffektanalyse etter justering for multiple sammenligninger) for hvert fag. Kaplan-Meier plott og log-rank tester ble brukt for å sammenligne forskjellene mellom tilbakefall overlevelse tider av ulike genotyper. Ikke-parametrisk Wilcoxon Ranksum test ble brukt for å sammenligne forskjeller i luciferase aktiviteter i reporter analysen. Alle statistiske tester var tosidig.
Resultater
Kjennetegn på studiepopulasjonen
Av de 421 kaukasiske pasienter vi fulgte, 346 (82,2%) var menn og 75 ( 17,8%) var kvinner. Blant dem, 232 (55,1%) hadde tilbakefall av sykdommen, med en median tilbakefall overlevelse tid på 14.05 måneder. Som vist i tabell S1, ble ingen signifikante forskjeller for tilbakefall identifisert basert på alder (
P
= 0,68), kjønn (
P
= 0,11), røykestatus (
P
= 0,69), kreft stadium (
P
= 0,13), eller kreft Karakter (
P
= 0,19). Det var ingen signifikante forskjeller i progresjon etter alder (
P
= 0,05) eller røykestatus (
P
= 0,96). Menn hadde høyere forekomst av sykdomsutvikling enn kvinner (
P
= 0,01) og pasienter med et høyere stadium eller klasse var også mer sannsynlig å oppleve progresjon (
P
0,01). Siden BCG var først og fremst gitt til de med høyere risiko for tilbakefall [21], sammenlignet vi ulike BCG behandlinger på risikoen for tilbakefall og progresjon. Sammenlignet med iBCG ble mBCG behandling signifikant assosiert med redusert risiko for tilbakefall og progresjon (
P
0,01).
Analyser av tilbakefall av sykdommen stratifisert etter behandling
Tjuefem SNPs var signifikant assosiert med tilbakefall risiko i totale pasienter, og etter å ha justert for multiple sammenligninger, seks forble signifikant, med en
q
-verdi ≤0.1 (tabell S2). I TUR pasientene ble 34 SNPs signifikant assosiert med tilbakefall risiko (
P
0,05), men etter å ha justert for multiple sammenligninger ingen forble signifikant (tabell S3). I BCG-behandlede pasienter, ble 28 SNPs signifikant assosiert med tilbakefall, og etter å ha justert for multiple sammenligninger, seks forble signifikant, med en
q
-verdi ≤0.1 (tabell 1; Tabell S4)
.
for å internt validere disse resultatene, utførte vi tilfeldig bootstrap prøvetaking av de betydelige SNPs for 100 iterasjoner og notert antall ganger at
P
verdien var mindre enn 0,05. I BCG-behandlede pasienter, fire av de fem beste SNPs i
NEIL2
hadde svært konsistente resultater, med bootstrap
P
verdier 0,05 for mer enn 90% av prøvetakinger (tabell 1).
kumulative effekten av flere SNPs på regelmessighet i NMIBC pasienter
Vi summert antall ugunstige genotyper for den enkelte og kategorisert pasientene ved tertile distribusjon av deres tilbakefall risiko, som viste dose -avhengig trend blant tre grupper (
P
trend 0,0001). Totalt pasienter, sammenlignet med lav risiko gruppe, median risiko og høyrisikogrupper hadde en 1,2 ganger (HR, 1,21, 95% KI, 0,85 til 1,71) og en 2,2-fold (HR 2,21, 95 % KI, 1,60 til 3,05) høyere risiko for tilbakefall, henholdsvis (
P
0,01; tabell 2). Blant BCG (iBCG alene eller iBCG pluss mBCG) behandlede pasienter, sammenlignet med lav risiko gruppe, median risiko og høyrisikogrupper hadde en 1,46 ganger (HR, 1,46, 95% KI, 0,9 til 2,38) og en henholdsvis 3,5 ganger (HR 3,52, 95% KI, 2,23 til 5,55) høyere tilbakefall risiko, (
P
0,01; tabell 2). Kaplan-Meier estimater av de totale og BCG-behandlingsgruppene angitt forskjeller i median tilbakefall overlevelse ganger (MST) (log rank test,
P
= 0,0001, figur 1 A og B).
(A) Kaplan-Meier-estimatene for tilbakefall overlevelse i alle NMIBC pasienter gruppert etter de tre risikogrupper som kategorisert etter antall ugunstige genotyper i oksidativt stress veien. Tilbakefall fritt median overlevelsestid [MST] = 42,3, 12,5 og 5,6 måneder for lav, middels og høy risiko pasienter, henholdsvis (
P
log-rank = 0,0001). (B) Kaplan-Meier-estimatene for tilbakefall overlevelse i BCG-behandlede pasienter gruppert etter de tre risikogrupper som kategorisert etter antall ugunstige genotyper i oksidativt stress veien. MST = 66,1, 25,4 og 16,6 mnd) for lav, middels og høy risiko pasienter, henholdsvis (
P
log-rank = 0,0001). (C) Alt Kaplan-Meier-estimatene for effekten av
UNG
: rs3890995 genotyper på progresjonsfri overlevelse i NMIBC pasienter (i de tre risiko undergrupper, progresjonsfri overlevelse var større enn oppfølgingstiden 132,6 måneder). Sammenlignet med pasienter som frakter homozygot variant genotype, de med minst en villtype allel viste lengre progresjonsfri overlevelse (
P
log-rank = 0,04). ww-homozygot villtype; wv- heterozygot; vv-homozygot variant.
Effekter av SNPs for sykdomsutvikling
I NMIBC pasienter, ble 23 SNPs signifikant assosiert med progresjon (
P
0,01 ved Wilcoxon Ranksum test. Analysen ble gjentatt tre ganger med samme resultat.
Diskusjoner
Vi har evaluert foreningen av et panel av 276 SNPs i 38 oksidativt-stress gener med tilbakefall av NMIBC hos pasienter behandlet med eller uten BCG. Vi identifiserte 25 SNPs som var signifikant assosiert med kreft tilbakefall i det hele tatt (turbo og BCG-behandlede) pasienter, 34 betydelige SNPs i TUR bare pasienter, og 28 betydelige SNPs i BCG-behandlede pasienter. I tillegg fant vi signifikante gen-dose effekter fra den kumulative analysen, og identifisert en SNP forbundet med NMIBC progresjon
Den mest betydningsfulle SNP assosiert med tilbakefall i BCG-behandlede gruppen var
NEIL2.
rs804256, som ligger i intronet regionen. Sammenlignet med villtype genotyper ble gjentakelse risiko for homozygot variant CC genotype økt mer enn fire ganger. Men dette SNP var ikke signifikant i TUR bare undergruppe, noe som tyder på en mulig interaksjon mellom rs804256 med BCG behandling. Fem av seks av de mest betydelige SNPs ligger i
NEIL2
, som fremhever viktigheten av dette genet i tilbakefall risiko.
NEIL2
tilhører en klasse av DNA-glykosylaser homolog med bakteriell Fpg /Nei familie, noe som er vesentlig for å fjerne cytosin-avledet lesjoner, spesielt 5-hydroxyuracil og 5-hydroxycytosine [22]. Det har blitt rapportert at to 5′-UTR polymorfismer redusere
NEIL2
uttrykk og øke mutagen-indusert genetiske DNA-skader [23]. Nedregulering av
NEIL2
uttrykk kan føre til økt oksidativt stress og genomisk ustabilitet i raskt voksende vev [24].
NEIL2
kan også spille viktige roller i å reparere DNA-skader indusert av kreftfremkallende metaller [25]. En av de mest betydningsfulle SNPs assosiert med tilbakefall, rs4639, ligger i 3′-UTR av
NEIL2
. Luciferaserapportørplasmid analyseresultatene viste at HSA-mir-421 og HSA-mir-1200 mirnas hadde lignende hemmende effekt på både villtype og variant rs4639 uttrykk. Siden enten mirnas viste lignende hemmende effekt på både villtype og variant genotyper, er det mulig at rs4639 ikke kan være den utløsende variant, men fungerer som en merking SNP for andre polymorfismer som kan bidra til blærekreft tilbakefall ved å endre
NEIL2
ekspresjon eller funksjon. Alternativt kan variant allel av dette SNP påvirke målretting av andre mirnas. Future fin kartlegging av regionene rundt de viktigste tagSNPs er nødvendig for å identifisere årsaks genetiske variasjoner og deres molekylære mekanismer.
Vi identifiserte også en betydelig gen-dose effekt for de seks tagging SNPs som viste signifikante hovedeffekter. Pasienter med det største antall ugunstige genotyper hadde høyest risiko for NMIBC tilbakefall, noe som tyder på at ytterligere risiko genotyper innenfor denne tasten veien var skadelig. Dette understreker betydningen av å vurdere flere SNPs innenfor en felles vei for klinisk utfall vurdering
En polymorfisme,
UNG
. Rs3890995, var signifikant assosiert med NMIBC progresjon. Rs3890995 ligger 1,87 kb oppstrøms
UNG
5 «UTR. En viktig funksjon av UNG er å gjenkjenne og fjerne uracil fra DNA ved spalting av N-glycosylic binding og initiere base-excision reparasjon pathway. DNA uracil kommer fra cytosin deaminering eller misincorporation av dumpe rester [26]. Det er mulig at den variant allelet av SNP rs3890995 kan påvirke gentranskripsjon dermed endrer proteinnivå. Alternativt kan det være knyttet til andre årsaks varianter i
UNG
.
I sammendraget, viste vi at genetiske polymorfismer av oksidativt stress sti gener kan modulere risikoen for NMIBC tilbakefall og progresjon i BCG behandlede pasienter. Videre har vi gjennomført en relativt omfattende spørring av de oksidative stresset pathway polymorfismer med detaljert klinisk informasjon og analyser, som ga betydelige bevis for involvering av denne veien i de kliniske utfall av blærekreftpasienter, spesielt med BCG behandling. Det er noen begrensninger i denne studien. For eksempel ble bare kaukasiere inkludert. Det ville være interessant å eksamen disse SNPs i minoritetsbefolkningen. I tillegg er utvalgsstørrelsen ikke spesielt stor, selv om styrkeberegning viste at vår analyse hadde nok strøm ( 80%) for å oppdage de viktigste effektene analysert. Selv om våre data er i stor grad internt validert, er fremtidige replikering studier i uavhengige populasjoner for å validere noen av resultatene og å oversette resultatene til kliniske studier.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Demografiske og kliniske variabler for 421 NMIBC pasienter.
doi: 10,1371 /journal.pone.0038533.s001 plakater (DOC)
Tabell S2.
Oksidativt stress genet SNPs og gjentakelsesrisiko i samlede NMIBC pasienter.
doi: 10,1371 /journal.pone.0038533.s002 plakater (DOC)
tabell S3.
Oksidativt stress genet SNPs og gjentakelsesrisiko i NMIBC pasienter som fikk TUR bare.
doi: 10,1371 /journal.pone.0038533.s003 plakater (DOC)
Tabell S4.
Oksidativt stress genet SNPs og gjentakelsesrisiko i NMIBC pasienter som fikk BCG behandling.
doi: 10,1371 /journal.pone.0038533.s004 plakater (DOC)
