Abstract
Formål
Mens kirurgisk reseksjon er en hjørnestein i kreftbehandling, lokale og fjernt residiv fortsette å påvirke resultatet i en signifikant andel av pasienter. Bevis for at en alternativ debulking strategi med radiofrekvensablasjon (RFA) induserer antitumor immunitet bedt dagens undersøkelse av effekten av å utføre RFA før kirurgisk reseksjon (pre-resectional RFA) i en preklinisk musemodell.
Experimental Design
terapeutisk effekt og systemiske immunresponser ble vurdert ved pre-resectional RFA behandling av murine CT26 colon adenokarsinom.
Resultater
behandling med pre-resectional RFA betydelig forsinket tumorvekst og bedret total overlevelse sammenlignet med simulerings kirurgi, RFA, eller reseksjon alene. Mus i pre-resectional RFA gruppe som oppnådde en komplett respons demonstrert holdbart antitumor immunitet ved tumor re-utfordring. Hvis det ikke oppnås en terapeutisk fordel i immunodeficient mus bekreftet at tumorkontroll av pre-resectional RFA er avhengig av en intakt adaptiv immunrespons snarere enn endringer i fysiske parametre som gjør tyreoideaektomi svulster mer mottagelig for en komplett kirurgisk eksisjon. RFA fører til en markert økning i intratumoral CD8
+ T-lymfocytt infiltrering, og dermed i det vesentlige å øke forholdet av CD8
+ effektor-T-celler: foxp3
+ regulatoriske T-celler. Viktigere, pre-resectional RFA øker antall antigen-spesifikke CD8
betydelig + T celler i svulsten mikromiljøet og tumor-drenering lymfeknuter, men hadde ingen innvirkning på infiltrasjon av myeloide-avledet suppressor celler, M1 makrofager eller M2 makrofager på tumor nettsteder eller i perifere lymfoide organer (dvs. milt). Til slutt, pre-resectional RFA av primære tumorer forsinket vekst av fjerne tumorer gjennom en mekanisme som avhenger av systemisk CD8
+ T-celle-mediert antitumorimmunitet.
Konklusjon
forbedret overlevelse og antitumor systemisk immunitet utløst av pre-resectional RFA støtte translasjonsforskning potensialet i dette neoadjuvant behandling for kreftpasienter med høy risiko for lokal og systemisk tilbakefall
Citation. Ito F, Ku AW, Bucsek MJ, Muhitch JB, Vardam -Kaur T, Kim M, et al. (2015) Immune adjuvant aktivitet av Pre-Resectional Radiobølgeablasjon Beskytter mot lokale og systemiske Regelmessighet i Aggressiv Murine tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (11): e0143370. doi: 10,1371 /journal.pone.0143370
Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanita, ITALIA
mottatt: 10 februar 2015; Godkjent: 04.11.2015; Publisert: 23.11.2015
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (CA79765 og AI082039 til SS Evans, CA098156 og CA109480 til SO Gollnick, og P30CA016056 til Roswell Park Cancer Institute); og Jennifer Linscott Tietgen Family Foundation (J.J. Skitzki og S.S. Evans). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kirurgi er fortsatt frontlinjen terapi og beste kurativ alternativet for kreftpasienter med resectable sykdom. Målet med kirurgisk inngrep er fullstendig fjerning av svulster med mikroskopiske kreft-frie kanter. Dessverre, mange pasienter utvikle lokal eller systemisk tilbakefall til tross for fremskritt innen kirurgisk teknikk og adjuvant kjemoterapi eller strålebehandling. I kolorektal levermetastaser, for eksempel, er tilbakefallsrate opp til 60% hos pasienter som gjennomgår en potensielt kurativ reseksjon, antagelig på grunn av mikroskopisk restsykdom eller mikrometastaser til stede på tidspunktet for kirurgi [1-3]. Bevis for en høy grad av tilbakefall og metastatisk spredning hos pasienter etter kirurgi foreslår videre at selv om systemisk antitumor immunitet er tydelig i avanserte kreftpasienter, er steady-state immunrespons utilstrekkelig til å gi tilstrekkelig tumorkontroll [4]. Ved tids svulster kan påvises at de allerede har utviklet mekanismer for å flykte fra immunologisk anerkjennelse og eliminering [4]. Dermed resected vevsprøver viser ofte sparsom infiltrasjon av CD3
+ T-lymfocytter, inkludert CD8
+ cytotoksiske T-celler, som korrelerer med dårlig prognose i flere histologiske tumortyper, inkludert tykktarmskreft [5-7].
In situ
termisk ablasjon teknikker, for eksempel radiofrekvensablasjon (RFA), har dukket opp som lovende behandlingstilbud for unresectable solide maligne svulster [8, 9]. RFA er godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for ablasjon av primære og metastatiske svulster, og har blitt brukt i behandlingen av en rekke svulster blant annet leveren, kolorektal, lunge, prostata, nyre, bryst, hjerne, skjoldbruskkjertelen, melanom, og bensvulster [9]. I forvaltningen av kolorektal kreft levermetastaser, har RFA vært brukt hyppigst
via
åpne, laparoskopisk eller bildeveiledet perkutan tilnærminger og kan utføres under generell eller lokal anestesi med minimale komplikasjoner [8, 9]. RFA brukes også i kombinasjon med kirurgisk reseksjon i pasienter med flere leverlesjoner hvori fullstendig reseksjon er ikke gjennomførbart på grunn av tumor nærhet til vitale strukturer (f.eks blodkar eller galleganger) eller utilstrekkelig parenchyma for å understøtte etter hepatectomy funksjon [2, 10].
leveres av RFA energi bevirker ionisk agitering som omdannes ved hjelp av friksjon til fokal høy temperatur hypertermi (≥50 ° C), for derved å indusere uopprettelig cellulær skade og koagulative nekrose [8]. I tillegg til denne direkte cytoreduktiv antitumoraktivitet, og RFA blitt vist å fremkalle immunmodulerende effekter i prekliniske og kliniske studier [8, 11]. I motsetning til kirurgisk reseksjon, den skadede tumorvev følgende RFA forblir
in situ
og tilveiebringer en kilde av tumorantigener. Disse antigenene er tatt opp og behandles ved lokale dendrittiske celler (DC) og presentert for T-lymfocytter i tumor-drenerende lymfeknuter (TdLN), og dermed fører til utvidelse av et tumorspesifikt CD8
+ effektor-T-celle-basseng [8 , 12, 13]. Spesielt, en tett CD3
+ T-celle infiltrere har blitt rapportert hos kreft områder etter RFA, i samsvar med lokale antitumor immun reaktivitet [14, 15]. Ytterligere bevis for RFA-indusert systemisk immunitet stammer fra prekliniske og kliniske rapporter om abscopal effekter som involverer spontan regresjon av fjerne metastatiske lesjoner etter primærtumor ablasjon [16-20]. Men den T-celleavhengige antitumorimmunrespons generert av RFA i pasienter og musemodeller synes å være forholdsvis svak [11, 14, 15] og et stort problem forblir den høye frekvensen av lokale tilbakefall på behandlingsstedet, særlig for tumorer 3 cm eller nær store vaskulære nettverk der blod tilsig grenser termisk konsentrasjons i målet vev via varme vask effekter [2, 8]
Bekymringer om svulst gjenvekst i overgangssonen av sublethal hypertermi (≤45. ° C) som omgir det sentrale nekrotiske sone har begrenset bruken av RFA hovedsakelig til lindring eller til pasienter som ikke kan tolerere resectional kirurgi. Her, testet vi hypotesen om at lokal kirurgisk resultat kan forbedres hvis RFA ble anvendt som et pre-resectional immunogent strategi for å øke antitumorimmunitet. Vi rapporterer at lokal og systemisk tumorkontroll og total overlevelse ble vesentlig forbedret som følge av induksjon av en CD8
+ T-celle-mediert adaptive immunrespons etter pre-resectional RFA i en musemodell for kolorektal kreft.
Materialer og metoder
mus
Kvinne BALB /c og C57BL /6 mus (8-12 uker) var fra National Cancer Institute eller Charles River. Alvorlig kombinert immunsvikt mus (CbySmn.CB17-Prkdc
SCID /J SCID /BALB /c, Jackson Laboratory) og Clone fire transgene mus (CBy.Cg-
Thy1a
Tg (Tcra (C14, TcrbC14) 1Shrm /ShrmJ) som uttrykker en α /β T-celle reseptor spesifikt for influensa hemagglutinin (HA;. fra Linda Sherman, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) ble avlet i Roswell Park Institutt for laboratorie Animal Resources Mus ble opprettholdt i pathogen- gratis barriere forhold. Alle dyr omsorg og prosedyrer var i samsvar med institusjonelle reglene for dyrehelse og trivsel og godkjent av Roswell Park Cancer Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
transplanttumormodeller og CD8
+ T-celle-uttømming
tumorceller (CT26 tykktarm adenokarsinomceller og den CT26-HA-derivat transfektert med et gen som koder for hemagglutinin [21, 22] syngenisk til BALB /c eller SCID-mus; B16.F10 melanom syngenisk til C56BL /6 mus) ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum (Life Technologies, Carlsbad, CA), 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin, 50 uM β-merkaptoetanol, og G418 (400 ug /ml; for CT26-HA). Tumorceller (10
6 for CT26 eller 3×10
5 for B16, i 100 mL PBS) ble injisert subkutant i flanken av syngeniske mus, med mindre annet er angitt. Tumorvolumer (varierende 150-500 mm
3) var ikke signifikant forskjellig mellom gruppene som er tilordnet ved tidspunktet for innledende behandling. Tumor volum ble beregnet ved å bestemme lengden på kort (
l
) og lang (
L
) diametre (volum = l
2 x L /2). Eksperimentelle sluttpunkt ble nådd når tumorene over 20 mm i diameter, eller når mus ble døende og viste tegn til lateral recumbancy, kakeksi, mangel på respons på skadelige stimuli eller observerbar vekttap. Den ipsilaterale lyske noden ble identifisert som fast punkt TdLN ved lokalisering av Evans blå fargestoff ett minutt etter injeksjon av fargestoff nær s.c. svulst nettstedet. For å modellere slutten stadium lungemetastaser, 10
5 CT26 celler ble injisert i halevenen 7 dager etter primær, subkutan svulst injeksjon; 30 dager senere ble CT26 knuter nummerert av etterforskere blindet å prøve identitet i oppblåste lunger farget med en 15% løsning av India blekk, og bleket av Fekete løsning. For uttømming av CD8
+ T-celler in vivo, ble mus injisert i.p. med 400 mikrogram av anti-CD8a mAb (53 til 6,72, BioXCell) hver 7. dag starter umiddelbart etter RFA behandling. CD8
+ T-celle uttømming ble bekreftet ved flowcytometri hjelp av anti-CD8β mAb (YTS156.7.7, Pe-Cy7) (BioLegend); 2% av CD3
+ T-celler var CD8
+ etter antistoff behandling
RFA
Mus ble bedøvet med inhalativ isofluran gass (4% isofluran for anestesi induksjon. 1,5% for vedlikehold). Mus ble plassert liggende på et elektrisk ledende jordingsplaten, og tumorområdet var fuktet med destillert vann før innføring av starburst SDE sonden (AngioDynamics) i sentrum av tumoren. Maintining en sondespisstemperatur på 90 ° C i ett minutt ved hjelp av RFA RITA 1500 generator (AngioDynamics) simulert klinisk setting av tumor tilbakefall etter RFA, som tidligere beskrevet av Johnson et al [23]. Sham RFA ble utført ved å sette sonden inn i svulsten uten elektrisk strøm. For ytterligere kontrollgrupper RFA ble administrert i huden vekk fra subkutant tumor (dvs. øvre rygg). Mus ble gjenfunnet på en varmende teppe og gitt smertestillende (buprenorfin 0,05 mg /kg kroppsvekt) subkutant for smertekontroll.
Kirurgisk reseksjon
Mus ble bedøvet med inhalativ isofluran gass og svulster ble skåret ut med 1 mm marger rundt den synlige grensen av svulsten. Fascia ble resected sammen med tumor (
en bloc
) i alle tilfeller å redusere tilbakefall fra dypet margin. Patologisk evaluering av tumor /stromal-grensesnittet ved eksisjon i Sentinel mus viste infiltrerende tumor i grensene på 40-60% av musene, uansett hvorvidt pre-resectional RFA ble administrert. Snittene ble lukket med 4-0 Vicryl® sutur (Ethicon, Inc., Somerville, NJ) og /eller stål viklede klemmer som ble fjernet etter 7-10 dager. Som et kirurgisk humbug kontroll, mus gjennomgikk en 1 cm hud snitt og lukking i motsatt flanke uten manipulering av svulsten nettstedet. I utvalgte forsøk ble utført delvis reseksjon, klassifisert etter detekterbare makroskopisk og mikroskopisk restsykdom i hvilken ~ 50% av tumormassen ble skåret ut. Mus ble gjenfunnet på en varmende teppe og gitt smertestillende (buprenorfin 0,05 mg /kg kroppsvekt) subkutant for smertekontroll.
adoptiv overføring av Clone 4 CD8
+ T-celler
Poolede splenocytes og lymfeknute (LN) celler fra Clone fire T-celle reseptor transgene mus ble positivt beriket av magnetisk celle sortering ved hjelp av en CD8a T-celle isolasjon kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Isolerte bestander besto av ~ 85-90% L-selektin
hi CD44
lav naive CD8
+ T-celler som bestemt flowcytometrisk analyse. Tilsvarende tall for Clone 4 CD8
+ T celler (5-10 x 10
6) merket med sporing fargestoff (4 mikrometer TRITC, molekylære prober) [22, 24] ble injisert intravenøst inn i individuelle mus 6 timer etter RFA eller humbug behandling. TdLN og tumorvev ble frosset i optimal skjæring temperatur forbindelse (Sakura Finetek).
Serum IFN-γ analyse
Serum ble kjøpt fra mus 1 dag og 7 dager-post RFA eller sham behandling via retro-orbital blødning. Prøvene ble lagret frosset ved -80 ° C inntil analyse av kommersielle ELISA for IFN-γ (R anti-foxp3 (FJK-16, PE) (eBioscience); anti-CD8β (YTS156.7.7, Pe-Cy7), og anti-CD206 (C068C2, BV421) (BioLegend). Flowcytometrisk analyse ble utført med en LSR II eller LSRFortessa med FACSDiva programvare (BD Biosciences) og WinList behandlingsprogram (Verity Software House).
Statistisk analyse
Statistisk signifikans av tumorvekst ble bestemt av 2-veis ANOVA for repeterte målinger. Overlevelse ble analysert med Kaplan-Meier metoden og grupper ble sammenliknet med log-rank test eller ved Gehan-Breslow-Wilcoxon test. Alle andre gruppeforskjeller ble evaluert av to-tailed uparede Student
t
-test. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM og
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Forhånds resectional RFA bedrer lokal tumorkontroll og overlevelse
for å avgjøre om RFA behandling før kirurgisk fjerning kan redusere lokalt residiv og bedre overlevelse, vi brukte en musemodell for CT26 kolon adenokarsinom å simulere klinisk setting der RFA gir innledende tumorkontroll, men er ofte etterfulgt av lokalt residiv. I pilotstudier optimalisert vi størrelsen på tumoren på tidspunktet for ablasjon sammen med temperatur og varighet av RFA. For disse studiene subkutant CT26 tumorer på omtrent samme størrelse (~ 150-500 mm
3 i volum) ble behandlet med RFA (1 minutt for ablasjon ved 90 ° C) på dag 10 etter implantasjon. Reseksjon av samme lesjon ble utført på dag 17, som vist i skjematisk vist i figur 1A og 1B. Vi har valgt å bruke den 7-dagers intervall mellom RFA og kirurgi for å gi tilstrekkelig tid for en primær antitumorimmunrespons blir generert etter ablasjon [11, 13, 26]. Kontroll mus hadde reseksjon eller RFA bare på dag 10, etterfulgt av humbug kirurgi (utenfor svulst region) på dag 17, eller simulert operasjoner på både dag 10 og 17 (figur 1A).
(A) Tidsplan skisserte ulike behandlinger som brukes. BALB /c-mus (10-12 mus /gruppe) ble injisert s.c. med 10
6 CT26 celler i venstre flanke på dag 0. behandlinger ble utført 10 dager etter tumor innpoding. Primære tumorer ble behandlet som indikert med sham kirurgi, reseksjon (Rxn), eller RFA på dager 10 eller 17. (B) Skjematisk viser rekkefølgen av administreringen av RFA (90 ° C i 1 minutt) 7 dager før kirurgisk reseksjon. Tumorvekstkurver (C) og overlevelseskurver (D) av mus med CT26 tumorer i forskjellige behandlingsgrupper. I (C), er antallet langtidsoverlevende uten tumorresidiv 150 dager indikert for hver forsøksgruppe; for (D) *
P
0,001 for salg resectional RFA gruppe i forhold til alle andre grupper. (E) Overlevende mus (n = 9) i den forhånds resectional RFA gruppe ble gjenopptatt 10
6 CT26 celler i den kontralaterale (høyre) flanke på dag 150. tumorvekstkurver er vist i hvilke
T
= 0 svarer til tidspunktet for injeksjon av sekundære svulster. Som en kontroll, ble tumorvekst overvåkes etter inokulering av den samme tumorcelle dose inn i ikke-tumor (NT) -experienced naive BALB /c-mus (n = 10); *
P
0,005 som bestemt ved Kaplan-Meier-analysen. En representant eksperiment av ≥ tre uavhengige eksperimenter er vist.
Ved hjelp av denne eksperimentelle plan har vi funnet at behandling av CT26 med RFA alene resulterte i 60-80% nekrose av individuelle tumorlesjoner fulgt av ≥ 75% svulst gjentakelse hvis ingen ytterligere behandling ble gitt (figur 1C). Tilsvarende kirurgisk inngrep alene var forbundet med en ≥ 75% lokalt tilbakefall. I motsetning til dette, en kombinasjon av RFA fulgt av reseksjon markert forsinket tumorutvekst sammenlignet med enkelt behandlingsgrupper eller simulert beskjæring kontrollgrupper (figur 1C). Spesielt, tumorresidiv ble ikke påvist i mer enn 150 dager i ~ 80% (9 av 11 mus) av musene behandlet med kombinasjonen av RFA og påfølgende operasjon. RFA fulgt av reseksjon videre viste signifikant bedret overlevelse sammenlignet med alle andre grupper i denne dødelige CT26 tumormodellen (fig 1D). I denne forbindelse, etterfulgt av RFA reseksjon resulterte i ~ 80% lokalt tilbakefall overlevelse sammenlignet med ~ 20% overlevelse etter en enkelt behandling med enten RFA eller reseksjon alene.
Ytterligere eksperimenter utelukkes muligheten for at den observerte terapeutisk fordel av kombinert RFA og reseksjon kunne tilskrives
(1)
forskjeller i den totale tiden verten ble utsatt for tumorantigener i ulike behandlingsgrupper (dvs. 10 dager for reseksjon fulgt av humbug kirurgi gruppe versus 17 dager for RFA + reseksjon gruppe),
(2)
mer effektiv operasjon på grunn av første tumor debulking under pre-resectional RFA, eller
(3)
betennelse utløst av probe innsetting (S1A fig). For disse eksperimentene, observerte vi ingen forbedring i CT26 tumorvekstforsinkelse eller overlevelse hvis initial tumor-debulking ble oppnådd på dag 10 etter delvis reseksjon (dvs. 50% reduksjon i tumormasse), etterfulgt av excisional reseksjon på dag 17 eller senere sham RFA i som ablasjon sonde ble innført i tumorer uten elektrisk strøm (S1B og S1C fig). Ytterligere studier i B16 melanom i syngene C57BL /6 mus (S2A-S2C figur) fastslått at RFA i neoadjuvant innstillingen før operasjonen har en lignende terapeutisk effekt som observeres for CT26 colontumorer. Således er de beskyttende aktivitetene til pre-resectional RFA ikke begrenset til en bestemt histologisk tumortypen.
Et kjennetegn på adaptiv immunitet er utviklingen av immunologisk hukommelse definert ved evnen til tidligere eksponering for tumorantigener for å utløse en husker respons ved re-eksponering. Derfor, undersøkte vi hvorvidt musene overlevde etter kombinert RFA og reseksjon av CT26 tumorer utviklet antitumor-reaktivitet med rechallenging langtidsoverlevende (dvs. 150 dager etter primærtumor implantasjon) med s.c. CT26 tumor i den kontralaterale flanke. Alderstilpassede, ubehandlet ikke-tumor (NT) -experienced naive mus ble benyttet som kontroller. Som vist i figur 1E, ble en signifikant forsinkelse i utvekst av CT26 tumor observert i eksponeres mus som tidligere var blitt behandlet med RFA fulgt av kirurgisk fjerning. Samlet utgjør disse dataene er i samsvar med utviklingen av en adaptiv immunrespons etter pre-resectional RFA som reduserer lokale tilbakefall og forbedrer overlevelse ved å fremme langvarig, systemisk immunitet.
Survival nytte av pre-resectional RFA avhenger på adaptiv immunitet
for å formelt undersøke om RFA aktivering av en tumor-spesifikke adaptiv immunrespons før kirurgisk inngrep er årsaks å begrense tumorvekst vi undersøkte effekten av denne kombinerte behandlingsregime på CT26 tumorprogresjon hos alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus som mangler funksjonelle T-celler og B-celler (figur 2A). Overlevelse ble anvendt som det primære sluttpunkt for bestemmelse av effekten siden analysen av primær tumorvolum var ikke informative i immundefekte mus som ofte bukket under for disseminert sykdom (dvs. i peritoneum) uavhengig av primær tumorstørrelse eller den type terapi. I skarp kontrast til overlevelsesgevinst observert hos immunkompetente mus (fig 1D), vi klarte å oppdage eventuelle overlevelse fordel i SCID-mus behandlet med kombinert RFA og reseksjon sammenlignet med hver behandling alene (figur 2B). Denne avhengighet av den adaptive immunrespons gir ytterligere bevis for at fordelen av pre-resectional RFA ikke kan forklares utelukkende på grunnlag av de cytoreduktiv virkningene av termisk ablasjon.
(A) Tid plan som beskriver behandlingsgruppene. SCID-mus (5 mus /gruppe) ble implantert subkutant med 10
6 CT26 celler i venstre flanke på dag 0. Behandling grupper incuded humbug kirurgi, reseksjon (Rxn), eller RFA på dager 10 eller 17. (B) Overlevelseskurver er representative for to uavhengige eksperimenter; ns, ikke signifikant bestemt ved Kaplan-Meier-analysen.
Pre-resectional RFA forsterker sirkulerende Th1 /CD8
+ T-celle-rettet cytokiner og forholdet mellom CD8
+ T-celler regulatoriske T-celler i svulsten mikromiljøet
for å få innsikt i hvilken rolle immunresponsen i formidling antitumor aktivitet av pre-resectional RFA vi vurdert sirkulerende immun cytokin nivåer etter administrering av RFA i CT26 svulster. Vi har funnet en trend mot en økning i sirkulerende konsentrasjoner av det prototypiske Th1 /CD8
+ T-cellestyrt cytokin IFN-γ så tidlig som 1 dag etter RFA sammenlignet med narrebehandlede mus og enda sterkere IFN-γ induksjon var tydelig 7 dager etter behandling RFA (figur 3A). Disse data er i samsvar med bidrag av Th1 /CD8
+ T-cellestyrt cytokiner i generering av en systemisk antitumorimmunrespons.
(A) IFN-γ profil i serum av CT26 tumorbærende mus ved 1 og 7 dager etter RFA behandling. *
P
0,02, humbug versus RFA. (B) Representative photomicrographs av immunostained endogene CD8
+ T-celler og kvantifisering av CD8
+ T-celle infiltrasjon i tumor vevssnitt 7 dager etter humbug kirurgi eller RFA. Scale bar, 100 mikrometer. (C)
Venstre panel
, kvantifisering av infiltrerende leukocytter i svulster 7 dager etter behandling ved flowcytometri; CD8
+ T-celler (CD3
+ CD8
+), CD4
+ T-celler (CD3
+ CD4
+), regulatoriske T-celler (CD3
+ CD4
+ foxp3
+ CD25
+ T
reg), myeloid-avledet suppressor celler (CD11b
+ Gr-1
+ F4 /80
-); M1 (CD11b
+ Gr-1
-F4 /80
+ CD206
loMHCII
hi) og M2 (CD11b
+ Gr-1
-F4 /80
+ CD206
hiMHCII
lo) makrofager. Dataene er i 10
3 totalt celler i vevsprøver.
Høyre panel
, forholdet mellom CD8
+ T-celler (T
eff, L-selectin
lav CD44
hi): T
reg i tumorer bestemmes av flyt cytometri. (D)
Venstre panel
, kvantifisering av totalt antall leukocytter i milten av tumorbærende mus ved 7 dager etter behandling RFA ved strømningscytometri.
Høyre panel
, forholdet mellom CD8
+ T-celler (T
eff, L-selectin
lav CD44
hi): T
reg i milten. Data (B-D) er representative for ≥ to uavhengige eksperimenter (
n
= 3-5 mus per gruppe); tumorvolumer varierte fra 1,100-1,700 mm
3) ved tidspunktet for RFA behandling. *
P
0,05, humbug versus RFA; ns, ikke signifikant.
Disse funnene, sammen med bevis for langsiktig tumorkontroll etter kombinert RFA og kirurgi, ledet oss til hypoteser om at den forbedrede lokal tumorkontroll kan medføre endringer i andelen intratumoral T-celler delmengder som ikke tidligere har vært undersøkt følgende RFA. Prekliniske studier på kaniner har rapportert økt intratumoral infiltrasjon av CD3
+ T-celler i behandlede lesjoner etter RFA selv om spesifikke CD4
+ eller CD8
+ T-celle undergrupper ble ikke undersøkt [14, 27]. Kliniske studier har også vist en økning i sirkulerende tumorspesifikt CD4
+ og CD8
+ -T-celler i pasienter med leverkreft (HCC) i 4 uker etterbehandling RFA [15]. Omvendt, RFA velig fører til en reduksjon i sirkulerende CD4
+ CD25
+ foxp3
+ immunsuppressive regulatoriske T-celler (T
reg) 30 dager etter behandling i lungekreftpasienter som er bemerkelsesverdig, siden T
reg motvirke funksjonen av cytotoksiske CD8
+ effektor-T-celler [6, 28]. Videre høye sirkulerende nivåer av suppressive immune celler, inkludert T
reg eller myeloid-avledet suppressorceller (MDSC) har nylig vist seg å være prognostisk for tumor tilbakefall etter RFA i ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) pasienter og HCC pasienter [29, 30]. Imidlertid har implikasjonene av disse resultatene forble uklart siden svingninger i sirkulerende immunceller er ikke nødvendigvis gjenspeiler deres nivå av intratumoral lokalisering etter RFA.
For å avgjøre om pre-resectional RFA påvirket intratumoral infiltrasjon av spesifikke immuncelle undergrupper på tidspunktet for kirurgisk inngrep, kvantifisert vi CD8
+ T-celler 7 dager etter ablasjon i resekterte CT26 tumorer, så vel som i milten som et eksempel på en perifer lymfoid organ som er et område av aktivering av immunsystemet. Immunhistokjemisk analyse viste minimal baseline intratumoral infiltrasjon av endogene CD8
+ T celler i humbug-behandlede mus (figur 3B), i tråd med rapporter fra vår gruppe og andre som CT26 svulster ikke er ettergivende til intensiv T-celle akkumulering [21, 22 , 31]. Det ble imidlertid en markert økning i intratumoral CD8
+ T-celle-infiltrasjon detektert etter RFA behandling sammenlignet med sham kontroller (figur 3B). Flowcytometrisk analyse videre avslørt at infiltrering av CD8
+ T-celler i forhold til den totale intratumoral cellepopulasjon ble betydelig forbedret 7 dager etter RFA mens den relative tetthet av total CD4
+ T-celler eller CD4
+ CD25
+ foxp3
+ T
reg undergruppe forble uendret (figur 3C)
Vi har undersøkt effekten av RFA på CD8
+ T-celle:. T
reg forhold innen svulster siden dette er angivelig en sterk prognostisk indikator på et positivt resultat i metastatisk kolorektalcancer [32]. RFA ble funnet å øke den generelle forholdet mellom CD8
+ effektor (L-selektin
lav CD44
hi) T-celle: T
reg innen RFA behandlet svulster (Fig 3C). En betydelig økning i CD8
+ T-celle: treg-forholdet ble også observert i milten 7 dager post-rfa (figur 3D); men dette gunstigere forholdet var en konsekvens av en samlet reduksjon i andelen av T
reg i miltrommet i stedet for en økning i CD8
+ -T-celler som ble observert i tumormikromiljøet (figur 3C). Redusert T
reg i milten potensielt kan reflektere den reduserte tumorbyrde som skyldes ablasjon terapi. Den relative tettheten av myeloide celler som uttrykker fenotypiske markører for CD11b
+ GR1
+ MDSC, CD11b
+ Gr-1
-F4 /80
+ CD206
loMHCII
hi M1 makrofager, eller CD11b
+ Gr-1
-F4 /80
+ CD206
hiMHCII
lo M2 makrofager undergrupper var uendret ved RFA behandling enten innenfor svulster eller milten. (Fig 3C og 3D). Til sammen tyder disse resultater på at RFA-induserer endringer i immun contexture favorisere Th1 /CD8
+ T-celleaktivering innen tumormikromiljøet og perifere lymfoide organer bidrar til forbedret lokal og systemisk tumorkontroll etter kirurgisk reseksjon.
Antigen-avhengige utvidelse av CD8
+ T-celler oppstår i tumordrenerende lymfeknuter og svulsten mikromiljøet følgende forhånds resectional RFA
Vi tenkte at økningen i CD8
+ T-celler påvises i tumorer etter RFA kan resultere fra dannelse av en antigen-spesifikk adaptiv immunrespons, som tidligere rapportert [11, 14, 15], eller alternativt fra en økning i ikke-antigen-begrenset lokalisasjon på grunn av den akutte betennelsen som følger etter den katastrofale celledød forårsaket av termisk ablasjon. For å skille mellom disse mulighetene, ble mus implantert subkutant med murine CT26 kolon adenokarsinom konstruert for å uttrykke en surrogat tumorassosiert antigen, hemagglutinin (CT26-HA), og dermed gjør oss til å overvåke svulsten-antigen (HA) -spesifikk CD8
+ T celle respons. En andre gruppe av mus ble implantert med den paren CT26 tumorcellelinjer som mangler HA-antigenet. *
P
0,001; *
P
0,001;
