Abstract
Lungekreft er forårsaket av en kombinasjon av ulike genetiske mutasjoner. Her, for å forstå betydningen av nukleære reseptorer (NRS) i onkogen-assosierte lungekreft patogenese, har vi undersøkt ekspresjonsprofilen av hele 48 NR medlemmer ved hjelp av QPCR analyse i et panel av humane bronkiale epitelceller (HBECs) som inkludert forstadier og tumorigene HBECs husing onkogene
K-ras
V12
og /eller
p53
endringer. Analysen av profil viste at onkogene endringer ledsaget transkripsjonelle endringer i ekspresjonen av 19 NR’er i forstadier HBECs og 15 NR’er henhold til ondartet progresjon av HBECs. Blant disse peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor gamma (PPARy), en NR valgt som en proof-of-prinsippet studie viste økt uttrykk i forstadier HBECs, som overraskende ble reversert når disse HBECs kjøpte fullt
in vivo
tumorigenicity . Spesielt, PPARy aktivering av tiazolidindion (TZD) behandling reversert økt uttrykk av proinflammatoriske cyklooksygenase 2 (COX2) i forstadier HBECs. I fullt tumorigene HBECs med induserbar uttrykk for PPARy, TZD behandlinger hemmet tumorcellevekst, clonogenecity, og celle migrasjon i en PPARy-sumoylation avhengig måte. Mekanistisk, den sumoylation av liganded-PPARy redusert COX2 uttrykk og økt 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase uttrykk. Dette tyder på at ligand-mediert sumoylation av PPARy spiller en viktig rolle i lungekreft patogenesen ved å modulere prostaglandin metabolismen
Citation. Kim J, Sato M, Choi JW, Kim HW, Yeh BI, Larsen JE, et al . (2015) Nuclear Receptor uttrykk og funksjon i Human Lung Cancer patogenesen. PLoS ONE 10 (8): e0134842. doi: 10,1371 /journal.pone.0134842
Redaktør: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Korea, Republikken
mottatt: 04.02.2015; Godkjent: 15 juli 2015; Publisert: 05.08.2015
Copyright: © 2015 Kim et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. The National Foundation of Korea forskning finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (NRF-2013R1A1A1A05005075 til YJ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
atom~~POS=TRUNC reseptor omfatter super 48 medlemmer av transkripsjonsfaktorer som er mest ligand-aktiverte og spiller viktige roller i ulike fysiologiske prosesser, inkludert metabolisme, utvikling og differensiering i kroppen. Dysregulering av NR veier forårsaker alvorlige kroniske sykdommer så som diabetes [1-3], aterosklerose [4, 5], og flere typer kreft [6-8]. Uttrykket av hele NR super har blitt undersøkt i ulike fysiologiske og patologiske tilstander, inkludert cellulær differensiering modeller [9-12], mus anatomiske systemer [1], NCI60 panel av humane kreftcellelinjer [6], og humane lungekreftcellelinjer og pasientprøver [7, 8]. Disse studiene har vist at undergrupper av NRS er ikke bare forbundet med spesifisert vev fysiologi, men er også relevant for funksjonell differensiering i spesifikke cellulære linjene [13, 14]. Videre den genetiske signaturen til NR super eller individuelle NR er en prognostisk biomarkør for lungekreft, og noen NRS druggable mål som kan være farmakologisk utviklet seg til potensielle kreftbehandling [6-8, 15-19]. Faktisk er flere linjer med bevis viser at enkelt NR’er er forbundet med utbrudd og utvikling, så vel som behandling eller chemoprevention av kreft. For eksempel er overekspresjon av retinsyre-reseptor alfa (RARα) på grunn av sin sammensmelting til PML (RARα /PML) og østrogen reseptor alfa (ERα) ekspresjon forårsake utbruddet av leukemi og bryst kreft progresjon, henholdsvis [20-22]. Målretting ERα ved hjelp av selektiv østrogenreseptor-modulator (SERM) tamoksifen eller raloksifen og blokkering eller ablasjon av dihydrotestosteron (DHT), som er den sterkeste endogene ligand for androgenreseptoren (AR), er velkjente terapeutiske ordninger i kreft klinikker for å behandle tilsvarende kreft [19, 23-25]. Mens SERM har blitt mye brukt for behandling av brystkreft eller til og med klinisk evaluert som kjemopreventive midler mot forekomst av brystcancer, en høy risiko for uterin endometrium og forekomsten av kreft har blitt rapportert tidligere [26, 27]. På samme måte, selv om de anti-diabetiske legemidler TZDs er i kliniske studier for lungekreft behandling, molekylær funksjon av TZD aktiverte PPARy er ikke klart definert, men som et anti-tumorigen faktor i lungekreft, eller til og med hevdet som en tumorfremmende faktor i andre typer kreft, dvs. brystkreft og prostatakreft [28-30].
Vi har utviklet en preklinisk modell som involverer udødeliggjort normale menneskelige bronkiale epitelceller (HBECs) som kan være genetisk manipulert med spesifikke onkogene endringer for å studere kreft patogenese lunge og utvikling av nye og mer målrettede metoder for tidlig diagnose, forebygging og behandling av lungekreft. Nylig har vi vært i stand til å utvikle fullt utviklet og tumorigene modeller med HBECs basert på manipulering av p53, KRAS, og c-myc [31]. Disse forstadier og fullt tumorigene modellene gir et ideelt system for å studere rollen av NRS i kreft patogenesen lunge inkludert preneoplasia og tumordannelse.
I denne studien har vi profilert mRNA uttrykk av alle 48 NR’er i denne HBEC oncogene- indusert lungecancer patogenesen modell [32, 33]. Dette tillot oss å identifisere en sentral rolle PPARy i lungekreft patogenesen. I en mekanistisk proof-of-prinsippet studie fant vi at PPARy sumoylation er viktig for den anti-tumorigen effekt av TZDs i lungekreft patogenesen. Denne studien gir et innblikk i en biokjemisk modifisering av PPARy, som er nyttig for forståelsen av lungekreft patogenesen og også viser kraften i denne preklinisk system for å studere rollen av NRS i lungekreft patogenesen og disse resultatene bør være av klinisk overføringsverdi.
Materialer og metoder
Cell kultur
Som tidligere rapportert, var normale menneskelige bronkiale epitelceller udødeliggjort av CDK4 og hTERT (HBEC-KT), etterfulgt av ytterligere stabil innføring av onkogene endringer inkludert K-ras
v12 overekspresjon, knockdown av p53, eller begge deler [31-33]. En rekke HBEC-KTs inkludert HBEC-KT, HBEC-KTZ, HBEC-KT + pSRZ + pLenti-
K-ras
v12 plakater (HBEC-KTR
L ), HBEC KT + pSRZ-
p53
shRNA + pLenti-
LacZ plakater (HBEC-KT53), og HBEC KT + pSRZ-
p53
shRNA + pLenti-
K-ras
v12 plakater (HBEC-KTR
L53), hvor pSRZ og pLenti representerer stabile shRNA og lentiviral vektorer, henholdsvis [31]. Udødeliggjort HBECs og tumorigene HBEC kloner (C1 og C5) ble dyrket i K-SFM (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) supplert med 50 ug /ml bovint hypofyseekstrakt uten epidermal vekstfaktor (EGF) og RPMI supplert med 10% føtalt bovint serum, respektivt.
molekylær kloning og stabil cellelinje
Både PPARy og forbedret grønn fluorescens protein (EGFP) genene flankert av ribosomale indre innføringsstedet ble bicistronically konstruert under kontroll av tetracyklin-induserbar (Tet /på) cytomegalovirus formidler av lentiviral vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Sidestyrt mutasjoner ble introdusert i begge sumoylation sider (K79R og K367R for PPARγ1, K107R og K395R for PPARγ2) i PPARy. Lentiviruses ble produsert og transdusert inn i tumorigen HBEC-C1 cellelinjer. Ytterligere screening prosessen ble utført for å velge en HBEC-C1-PPARy klone der både PPARy og EGFP uttrykk er strengt regulert på tetracyklin behandling.
immunoblotanalyse
Et panel av udødelig HBEC cellelinjer ble dyrket i nærvær eller fravær av PPARy agonist troglitazon eller pioglitazon i 48 timer og deretter totale cellelysatene ble fremstilt som beskrevet tidligere [7]. Primære antistoffer for cellesignalisering inkludert for antistoffer mot p53 (sc-126, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), K-ras (sc-30, Santa Cruz), fosfor-MEK1 /2 (# 9121, cellesignalisering teknologi, Beverly, MA, USA), MEK1 /2 (# 9122, Cell Signaling), COX2 (sc-19999, Santa Cruz), fosfor-ERK1 /2 (# 9101, Cell Signaling), ERK1 /2 (# 9102, Cell Signaling), β-aktin (Ab6276, Abcam, Cambridge, Cambridgeshire, UK), Lamin A /C (sc-7292, Santa Cruz), og PPARy (# 2435, Cell signalering). Primære antistoffer for cellecyklusprogresjonen inkludert antistoffer mot cyclinD1 (# 2926, Cell Signaling), cyclin A (sc-239, Santa Cruz), p16
INK (sc-468, Santa Cruz), og p21
WAF1 ( OP64, Calbiochem, La Jolla, CA, USA).
Cell vekst og kolonidannelse analysen
Cell teller analysen ble utført for å måle cellevekst svar. For celle-telling assay, ble to hundre HBECs sådd ut i 96-brønners plater i et endelig medievolum på 100 ul per brønn, etterfulgt av troglitazon behandling ved konsentrasjoner på 3 uM i nærvær av 100 nM kunststoff RXR-liganden LG268. Celle nummer ble regnet på fem dager etter behandling. Relativ% vekst ble normalisert for hver dose av kjøretøy behandling. For kolonidannelse analysen, ble fem tusen HBEC celler delt i seks-brønns plater og behandlet med PPARy eller PPARa ligander. Koloniene ble farget med metylenblått etter 7 til 10 dager ligand behandling.
Cellemigrering assay
HBECs med induserbar ekspresjon av vill-type PPARy eller SUMO-PPARy ble sådd i 6-brønns plater og fullt dyrket med 100% konfluens, etterfulgt av mitomycin C-behandling for å undertrykke celledeling. Et sår ble dannet ved å skrape celle laget med steril pipette tips. Cellene ble deretter inkubert i RPMI 1640-medium inneholdende 5% føtalt bovint serum med eller uten tetracyklin induksjon for reseptorekspresjon, og etterfulgt av ligand behandling. Cellemigrering ble målt etter 24 timer av PPARy ligand behandling ved å telle antall celler migrert i de sårede områder.
Luciferase rapport assay
HEK 293-celler ble ko-transfektert med den ekvivalente mengde (15 ng ) av enten kontroll-plasmid eller ekspresjonsplasmider for villtype (wt-PPARy) eller sumoylation mutant (SUMO-PPARy) av PPARy i kombinasjon med et luciferase reporter plasmid av PPAR-responselement (TK-PPRE3x-Luc, 50 ng) og en beta- galaktosidase plasmid (β-Gal, 20 ng) for normalisering av transfeksjonseffektivitet. Cellene ble deretter behandlet med kjøretøy (EtOH), 1fiM pioglitazon eller troglitazon og analysert for luciferase aktivitet.
revers transkripsjon og QPCR analyse
Alle RNA ble fremstilt ved bruk av Qiagen kit og reverse transkribert inn i cDNA for QPCR analysen (TaqMan-metoden) som tidligere beskrevet [12]. Revers transkripsjon av 2 pg total RNA i 100 pl reaksjonsvolum ble ytterligere justert til en 200 ul sluttvolum. SDS versjon 2,1 software ble benyttet for å detektere real-time PCR reaksjonen utført i ABI 7900HT system. Effektivitet-korrigerte standardkurve analysene ble optimalisert for nonbiased, multiplate sammenligning som tidligere beskrevet [8].
qPCR analyse av data
En Macro ble opprettet for å analysere rådata importeres til Microsoft Excel. PCR-effektivitet (e), ble beregnet som e = 10
[- 1 /skråning] hvor helningen er oppnådd fra standardkurven ved SDS 2,1 programvare, for 18S referanse og NR er av interesse. Makro omfattet følgende statistiske beregninger. Den gjennomsnittlige (. Avg) kvantum for enkelte prøver ble hentet fra gjennomsnittlig relative mengden av tre paralleller, hvor mengden er lik e
-Ct (dvs.
kvantitet
= (10
[- 1 /skråning])
-Ct). Variasjonskoeffisienten (CV) kan bli ytterligere fås ved å dividere standardavviket for gjennomsnittet (STDEV) med gjennomsnittlig mengde (avg.), CV = stdav /avg. Den statistiske uteliggeren punktet ble ekskludert hvis det var 17% CV. Ved å bruke disse mengder for både 18S og NR av interesse, ble normalisert verdi for hver NR uttrykk videre beregnet ut fra fordeling av NR mengde avg ved henvisning kvantitet avg. (Dvs. normalisert verdi = NR mengde avg /referanse kvantum avg). Videre ble standardavviket for den normaliserte verdien beregnes som S.D. = (Normalisert verdi) X {(CV referanse)
2 + (CV NR)
2}
1/2.
Resultater
Karakterisering av udødelig HBECs
Det overordnede skjemaet for å generere udødeliggjort og tumorigene HBECs er vist i figur 1A. For å forstå effekten av onkogene endringer på karsinogent potensial av bronkial epitelceller, vi tidligere genererte et panel av udødelig HBECs huse enten
K-ras
V12
uttrykk, p53 knockdown, eller begge forandringer, som er store mutasjoner i lungekreft [32, 33]. Ved hjelp av en mus xenograft modell, HBEC kloner, C1 og C5, ble identifisert til å være tumorigent og karakterisert. Stabil knockdown av p53 ble bekreftet for både mRNA og protein uttrykk ved hjelp QPCR analyse og immunoblot analyse, henholdsvis (figur 1B og S1 fig). Aktiviteten av onkogene
K-ras
V12
stabilt innført i udødelig HBEC cellelinjer ble bekreftet av fosforylering av MEK, en nedstrøms mål kinase av K-ras (fig 1B) . Disse genetiske endringer klart induserte en vacuole-lignende mobil morfologisk endring som syntes å være mobilnettet senescence, som er konsistent med resultatene fra en tidligere rapport [31] (figur 1C).
(A) Skjema for å generere et panel av HBEC celler. (B, C)
In vitro
karakterisering av HBECs. (B) Immunoblotanalyse ble utført for ekspresjon av K-ras
V12, p53, pMEK, total MEK, og beta-aktin i HBEC celler. (C) En mikroskopisk riss av HBEC celler (forstørrelse, 1x). Merk at HBEC-KT står for HBEC cellelinjer udødeliggjort av
CDK4
pluss
hTERt
; KTR
L, KT pluss onkogene
K-ras
V12
; KT53, KT pluss
p53
knock-down; KTR
L53, KTR
L pluss
p53
knock-down.
NR uttrykk i HBEC panel
Siden vi nylig demonstrert at uttrykk mønster for de 48 NRS er en prognostisk biomarkør satt samt potensielt være terapeutiske mål for lungekreft [6-8], vi lurte på om noen NRS assosiert med lungekreft patogenesen. Derfor, for å undersøke om innføringen av
K-ras
V12 Hotell og
p53
onkogene endringer påvirket uttrykket av NRS i human lunge bronkial epitelceller, vi første profilert mRNA uttrykk av alle 48 medlemmer av NR super ved QPCR i isogen HBEC panel som er oncogent veldefinerte og består av genetisk identiske bronkial epiteliale cellelinjer (figur 2 og S2 fig). Vi har funnet 31 ut av 50 NRS (inkludert PPARδ2 og PPARγ2, isoformer av PPARδ og PPARy, henholdsvis) for å oppvise ingen forskjeller i isogene panelet (enten hadde ingen ekspresjon eller ingen endring i ekspresjon) (S2 Fig). Derimot, 19 NR’er viste tydelige uttrykk mønstre på tvers av isogene HBEC paneler, som falt inn i tre ulike grupper. Den første gruppen (p53 avhengig) inkludert to medlemmer, kylling ovalbumin oppstrøms promoter-transkripsjonsfaktor (Coup-TF) α, østrogen reseptor (ER) β NRS viser en p53-avhengig uttrykk mønster (figur 2A). Den andre gruppen var representert fra NRS med en K-ras
V12-avhengige uttrykk mønster inkludert Coup-TFβ, østrogen-relaterte reseptor (ERR) α, bakterie cell nuclear factor (GCNF), nervevekstfaktor indusert gen B (NGFIB ) 3, nevron-avledet orphan reseptor 1 (NOR1), PPARa, PPARδ, PPARδ2, reverse-erb (Rev-erb) α, og retinsyre relaterte orphan reseptor (ROR) α, skjoldbruskkjertel hormon reseptor (TR) β (fig 2B). Den tredje gruppen (K-ras
V12 og p53 avhengige) var ERα, hepatocytter nukleær faktor 4 (HNF4) γ, nur relatert faktor 1 (NURR1), PPARy, Retinoid syre reseptor (RAR) β, RAR-relaterte foreldreløs reseptor (ROR) β, som var NR’er med en dual onkogen-avhengig ekspresjon mønster (figur 2C). I tråd med resultatene fra vår forrige rapport hvor NR uttrykk var sterkt assosiert med lungekreft progresjon [7], støtter dette resultatet forestillingen om at undergrupper av NRS kan også være involvert i lungekreft patogenesen indusert av
K-ras
V12
overekspresjon og /eller tap av p53-funksjon.
qPCR analysen ble utført for mRNA uttrykk for hele NR super i udødelig HBEC panel. (A)
p53
knockdown-avhengige uttrykk. (B) onkogene
K-ras
V12
-avhengig uttrykk. (C)
p53
knockdown og
K-ras
V12
-avhengig uttrykk. Merk at HBEC-KT står for HBEC cellelinjer udødeliggjort av
CDK4
pluss
hTERT
; KTZ, KT pluss kontroll plasmid med zeocin seleksjonsmarkør; KTR
L, KT pluss onkogene
K-ras
V12
; KT53Z, KTZ pluss
p53
knock-down; KTR
L53, KTR
L pluss
p53
knockdown. Data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 3). Stjernene viser statistisk signifikante poeng som vurderes av
ANOVA
. *
P
0,05, **
P
0,01 og ***
P
0.001 sammenlignet med HBEC-KT.
PPARy aktivering snudd onkogene
K-ras
V12
indusert uttrykk for COX2 protein
Siden PPARy er forholdsvis godt undersøkt blant annet NR’er i ulike fysiologiske funksjoner (f.eks adipocyttdifferensiering, betennelse kontroll) og dets ligand TZDs tilgjengelig i klinikken av type II diabetes, ved bestemte vi oss for å undersøke den molekylære studier av PPARy , som et proof-of-concept, av de 48 NR’er i den molekylære patogenesen av lungekreft [11, 34, 35]. I samsvar med tidligere rapporter som viser at COX2 ekspresjon er assosiert med lungecancer progresjon [36, 37], ble det observert en dramatisk økning i COX2 ekspresjon i HBECs modifisert til å inneholde onkogene
K-ras
V12
(figur 3A og 3B). Mens PPARy mRNA økt parallelt med COX2 uttrykk, PPARy proteinuttrykk var sammenlignbare i alle 4 HBEC celler som tyder posttranskripsjonelt regulering av PPARy mRNA (Fig 3B). Gitt at PPARy spiller en betydelig rolle i anti-inflammatorisk respons [34, 35], ønsket vi å teste om PPARy aktivering hemmer pro-inflammatorisk COX2 uttrykk i lungekreft patogenesen modell. Faktisk, PPARy agonist troglitazon reverseres den økte ekspresjon av COX2 mRNA og protein (figur 3A og 3B). Sammen med PPARy hemming av lungekreft spredning som tidligere rapportert [38, 39], antyder dette resultatet at PPARy undertrykkelse av COX2 ekspresjon kan være viktig ved modulering av onkogen-indusert ondartet transformasjon av HBECs inn i lungekreft. Med tap av p53-funksjon, ekspresjon av cyclin D1 protein, en nøkkelfaktor i cellesyklusprogresjon fra G1 til S-fasen, ble redusert i HBECs med p53 knockdown og redusert enda mer i HBECs med dobbel
p53
og
K-ras
V12
onkogene endringer kombinert med troglitazon behandling (figur 3B). I motsetning cyklin D1 oppviste ingen endring i HBECs med bare K-ras
V12 uttrykk med eller uten troglitazon. Disse dataene antyder at i løpet av forstadier til kreft (preget av HBEC celler med
p53
tap og
K-ras
V12
endringer), er PPARy uttrykt og dens ligand-avhengig aktivering kan føre til dramatiske endringer i COX-2 og cyclin D1 ekspresjon (fig 3A og 3B). Men troglitazon behandling viste lik hemming av HBEC-KT spredning over isogen panelet (fig 3C). Dette tyder på at ytterligere faktorer, sammen med COX-2 og cyclin D1, kan være involvert i PPARy-mediert veksthemming av HBEC celler.
(A) PPARy og COX2 mRNA-ekspresjon ble målt ved anvendelse QPCR analyse i HBEC linjer med eller uten troglitazon behandling. (B) immunoblot ved å bruke antistoffer mot COX2, cyklin D1, PPARy eller beta-aktin ble benyttet for å måle den tilsvarende proteinet uttrykket i HBEC panel når de ble behandlet eller ikke behandlet med 1 pM av troglitazon. (C) Vekst reaksjon av HBEC-KT cellelinjer til den kombinerte behandling av PPARy ligand troglitazon (3 uM) og RXR-liganden LG268 (100 nM). Data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 3). Stjernene viser statistisk signifikante poeng som vurderes av
ANOVA
. *
P
0,05, **
P
0,01 og ***
P
0.001 sammenlignet med HBEC-KT kontroll,
###
P
0.001 sammenlignet med K-ras
V12 kontroll,
+++
P
0.001 sammenlignet med K-ras
V12 + p53shRNA kontroll.
Karakterisering av tumorigene HBEC kloner
Siden ulike nivåer av PPARy uttrykk reflekterte ingen forskjell i veksthemming av ikke-tumorigent HBECs ved behandling med troglitazon (fig 3C), vi lurte på om de transform HBECs viser en annen reaksjon på PPARy ligand behandling og distinkte uttrykk mønstre av andre NR’er sammenlignet med forstadier til kreft HBECs. Vi først preget de to tumorigene kloner, HBEC-C1 og C5, på cellenivå og vev nivåer. Histologisk karakterisering av xenografttumorer avslørt, som vist nylig av oss, at HBEC-KT med p53 knockdown og K-ras
V12 høyt uttrykk manipulasjon kan føre til klonal derivater med forskjellig histologies- plateepitelkarsinom (SCC, HBEC-C1 ) og adenokarsinom (ADK, HBEC-C5) [31] (figur 4A). Biokjemisk analyse bekreftet at begge onkogene endringer,
K-ras
V12
aktivitet samt tap av
p53
uttrykk, ble like opprettholdt i tumorigent HBEC- C1-C5 og kloner (figur 4B). Overraskende, både PPARy og COX2 uttrykk var dramatisk redusert i tumorigen HBEC kloner (figur 4B og S3 fig) og tumorigene klonene var konsekvent resistente overfor PPARy vekstinhibering (figur 4C). Disse dataene antyder muligheten for at i løpet premalignancy drevet av
p53 Hotell og
K-ras
onkogene endringer som PPARy og COX2 kan være terapeutiske mål, men som med utviklingen av full malignitet at svulstene omgå dette kontroll, som i noen tilfeller forekommer ved nedregulering av PPARy. Slike resultater ville være i overensstemmelse med rapporter om at bruken av ikke-steroide anti-inflammatorisk legemiddel (NSAID) kan beskytte mot utvikling av lungekreft hos menn, mens deres anvendelse i fullt utviklede lunge cancer synes ikke å være terapeutisk [40].
(A) Histologisk analyse av tumorigene kloner; C1 svulst dårlig differensiert karsinom med store celler som tyder på plateepitelkarsinom (H E, x40) (til venstre) og C5 svulst dårlig differensiert karsinom med funksjoner av adenokarsinom (H E, x40) (til høyre). (B)
In vitro
karakterisering av HBEC tumorigene kloner C1 og C5. Immunoblotanalyse analysene ble utført ved hjelp av antistoffer mot K-ras, p53, Perk, total ERK, og beta-aktin i tumorigene HBEC kloner. Ved hjelp av QPCR assay, ble mRNA-ekspresjon av PPARy målt i tumorigen kloner (nederst i B). (C) Vekst reaksjon av tumorigene HBEC kloner for den kombinerte behandling av PPARy (3 uM troglitazon) og RXR (100 nM) LG268 ligander. Data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 3). Stjernene viser en statistisk signifikant punkt som vurderes av
ANOVA
. *
P
0.001 sammenlignet med HBEC-KT kontroll.
NR uttrykk i tumorigen HBEC kloner
Siden PPARy uttrykk ble bemerkelsesverdig undertrykt i fullt ondartede HBECs, vi lurte på om noen andre NRS forskjellig uttrykt med den samme tumorigen progresjon. Dermed vi ferdig mRNA uttrykk profil av hele NR super i panelet av ikke-tumorigent HBEC-KTR
L53 celler og tumorigen klonale derivater inkl tumorigene cellelinjer etablert fra C1 og C5 svulster, og C5 svulst selv (Fig 5A og S4 fig). Femten av de 50 NR’er viste uttrykk mønstre potensielt knyttet til ondartet progresjon av HBEC-KTR
L53 celler i HBEC svulster (Fig 5A). Inkludert i denne gruppen var AR, Coup-TFα, Coup-TFβ, dosering følsomme sex reversering-binyre hypoplasi medfødt kritisk region på X-kromosomet, gen 1 (DAX1), ERα, ERRα, HNF4γ, lever reseptor homolog-en (LRH1 ), NOR1, NURR1, PPARy, RARβ, RORα, RORβ, og VDR (fig 5A). Interessant, ni av de 15 NRS (AR, Coup-TFα, DAX1, HNF4γ, LRH1, NOR1, NURR1, RORα, og RORβ) viste stadig økende uttrykk mønster på tumorigent progresjon (Fig 5B). AR og DAX1 viste dramatisk økt ekspresjon bare i HBEC tumorer, men ikke i de immortaliserte HBEC cellelinjer. ERRα og VDR viste redusert uttrykk under tumorigenesis fra ikke-onkogene HBEC-KT, gjennom HBEC-KTR
L53 til HBEC tumorer (figur 5B). Coup-TFβ, ERα, og RARβ viste en bifasisk uttrykk mønster, hvor den opprinnelige uttrykket av NRS i HBEC-KT redusert i HBEC-KTR
L53, men opp igjen HBEC svulster, som er motsatt til fullstendig tap av PPARy uttrykk i HBEC tumorer (figur 5B). Mer interessant, adenokarsinom typen HBEC-C5-celler og tumor, men ikke den squamous cell carcinoma HBEC-C1, viste økt ekspresjon av Coup-TFα og β, og redusert ekspresjon av ERRα og VDR, hvilket antyder at disse fire NR’er kan være spesielt involvert i adenokarsinom typespesifikk lungekreft patogenesen.
qPCR analysen ble utført for mRNA uttrykk for hele NR super i ikke-tumorigent HBEC-KTR
L53 celler med
p53 Hotell og
K-ras
V12
endringer, to tumorigene kloner C1 og C5, og xenograft C5 svulst vev. (A) Kvantitativ mRNA uttrykk profiler av NR undergruppene med distinkte uttrykk mønster over hele panelet. Legg merke til at resten av NR-profilen ble vist i S4 fig. (B) Oppsummering av NR uttrykk fra panel A og figur 2 vise NR uttrykk kaskader korrelerte med tumorigent progresjon. Data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 3). Stjernene viser statistisk signifikante poeng som vurderes av
ANOVA
. *
P
0,05, **
P
0,01 og ***
P
0.001 sammenlignet med HBEC-KTR
L53.
PPARy sumoylation avhengig hemming av tumorigent HBEC vekst og migrasjon
Som ligand-mediert PPARy sumoylation undertrykker uttrykk for induserbar nitrogenoksid syntase (iNOS), et velkjent proinflammatorisk enzym som produserer nitrogenoksid, og den anti-inflammatoriske rolle av PPARy som antas å bidra til dens tumor undertrykkende funksjon av den reseptor [34], testet vi om PPARy sumoylation er kritisk for anti -tumorigenic funksjon av den reseptor i HBEC progresjon serien. For å gjøre dette, etablerte vi tumorigene stabile cellelinjer (HBEC-C1) som uttrykker villtype (wt-PPARy) eller sumoylation mutant (SUMO-PPARy) form av PPARy å studere hvis gain-of-funksjon av ulike former for PPARy ( wt-PPARy vs. SUMO-PPARy) kunne reversere veksten motstand av tumorigent HBEC-C1 til ligand behandling. Vi har funnet ut at både PPARy formene viste ingen forskjell i ligand-mediert transaktiveringsfunksjonen for target-genekspresjon ved anvendelse av en luciferase-assay (fig 6A). HBEC-C1-celler stramt regulert ekspresjon av vill-type PPARy eller SUMO-PPARy under kontroll av tetracyklin-induserbar promoter operasjons (Tet /ON) (figur 6B). HBEC-C1 celler med indusert ekspresjon av vill-type PPARy viste signifikant vekstinhibering med mer enn 50% når de ble behandlet med pioglitazon eller troglitazon (TZDs) (figur 7A). Men denne veksten hemmende respons ble sterkt redusert i HBEC-C1 celler med induserbar uttrykk for SUMO-PPARy under samme behandlingsforhold som de tilsvarende HBEC-C1 celler som uttrykker wt-PPARy (Fig 7A og 7B). Tilsvarende væske kolonidannelse analysen viste at PPARy ligand behandlinger hemmet clonogenecity av HBECs uttrykke wt-PPARy og andre lungekreftcellelinjer som calu6 og H2347 uttrykke endogenouse PPARy, men ikke fra den ene med SUMO-PPARy (Fig 7B og 7C). Men behandling av PPARa ligand WY-14643 viste ingen colonogenic effekt i både vekt-PPARy og SUMO-PPARy uttrykker HBECs (Fig 7C). Dette tyder på at hemmende effekt av TZDs er spesielt avhengig av PPARy sumoylation. PPARy-aktivering også hemmet cellemigrering i et sumoylation avhengig måte (figur 7D). I samsvar med dette uttrykk for både cyclin A og cyclin D1 redusert i HBEC-C1-celler som uttrykker wt-PPARy, men ble ikke endret i HBEC-C1-celler som uttrykker SUMO-PPARy, når de ble behandlet med TZDs (Fig 8A og s5a Fig). Legg merke til at uttrykket av cyclin-avhengige kinase-inhibitorer, p16 og p21, ble ikke signifikant endret i de samme behandlingsbetingelser (fig 8A og S5a Fig). I tillegg, undersøkte vi flere inflammatoriske signalbaner som er involvert i nitrogenoksidproduksjon, prostaglandin biokjemi, og TNFa signaltransduksjon. Forbløffende nok fant vi at TZD aktivering av wt-PPARy redusert proinflammatory COX2 uttrykk ved tre ganger, mens SUMO-PPARy aktivisering, spesielt, økt uttrykk av COX2 protein ved seksdoblet i HBEC-C1 celler (figur 8b). Videre er ekspresjon av 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (HPGD), en prostaglandin-metaboliserende enzym, ble dramatisk indusert av atten ganger når wt-PPARy ble aktivert ved TZDs. Men HBEC-C1-SUMO-PPARy celler indusert HPGD uttrykket betydelig mindre (fem til syv ganger) når de behandles med TZDs. PPARy-aktivering har også i betydelig grad undertrykkes TNFa ekspresjon, men ikke annet NFkB signale faktorer, i en sumoylation avhengig måte (fig S5b). Merk at iNOS ikke ble uttrykt i tumorigen HBEC kloner (S5C Fig). Tatt sammen tyder dette på at ligand-induserte PPARy sumoylation er spesielt involvert i undertrykkelse av inflammatorisk COX2 og TNFa signalveier, men ikke den iNOS vei, i lungekreft patogenesen.
(A) luciferase reporter analysen av villtype og sumoylation mutant PPARy plasmider. RLU, relative luciferase enhet. (B) Tetracycline-indusert uttrykk for PPARy og EGFP protein i stabilt transfektert HBEC-C1-vekt-PPARy klone. En mikroskopisk visning av tetracyklin-indusert EFGP uttrykk (øverst i B). Immunoblotanalyse analyser for ekspresjonen av lamin A /C og tetracyklin-indusert PPARy (nederst i B). En bicistronisk konstruksjon av PPARy og EGFP ble stabilt innført i en tumorigen HBEC klon for å generere HBEC-C1-PPARy cellelinjer som beskrevet i Materialer og Metoder. Data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 3). Stjernene viser statistisk signifikante poeng som vurderes av
ANOVA
. *
P
0.001 sammenlignet med HBEC-KT kontroll.
Vekst respons og celle migrasjon av lungekreft ble analysert til behandling med PPARy ligander. (A) Cellevekst respons.
