Abstract
microRNAs kan fungere som viktige tumor suppressors eller onkogener og fungere som biomarkører for kreft diagnose eller prognose. Selv om high-throughput analyser har avdekket mange miRNA biomarkører for bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC), bare noen få har blitt validert i uavhengige populasjoner eller etterforsket for funksjonell betydning i PDAC patogenesen. I denne studien korrelert vi uttrykket av 36 potensielt prognostiske mirnas innenfor PDAC vev med klinisk-patologisk funksjoner og overlevelse hos 151 kinesiske pasienter. Vi deretter analysert de funksjonelle roller og målgener av to mirnas i PDAC utvikling. Vi fant at høyt uttrykk av MIR-186 og MIR-326 forutsi fattige og bedret overlevelse, henholdsvis. MIR-186 var over-uttrykt i PDAC pasienter sammenlignet med kontroller, spesielt hos pasienter med store svulster ( 2 cm), lymfeknutemetastaser, eller kortsiktig overlevelse ( 24 måneder). I kontrast, MIR-326 ble nedregulert i pasienter sammenlignet med kontroller og vises relativt økt uttrykk i pasienter med langtidsoverlevelse eller uten venøs invasjon. Funksjonelle eksperimenter viste at PDAC celleproliferasjon og migrasjon ble redusert etter hemming og forbedret etter over-uttrykk for MIR-186. I kontrast, ble det forsterket etter hemming og redusert etter overuttrykk av MIR-326. En luciferase assay viste at MIR-186 kan binde direkte til 3′-UTR av
NR5A2
å undertrykke genekspresjon. Disse funnene tyder på at Mir-186 over-uttrykk bidrar til invasiv potensialet i PDAC, trolig via undertrykkelse av NR5A2, og dermed føre til en dårlig prognose; høy MIR-326 uttrykk forlenger overlevelsen sannsynlig via den synkende invasiv potensialet i PDAC celler. Disse to mirnas kan brukes som markører for klinisk diagnose og prognose, og de representerer terapeutiske mål for PDAC
Citation. Zhang Zl, Bai Zh, Wang Xb, Bai L, Miao F, Pei Hh (2015) MIR-186 og 326 Tipp Prognose av bukspyttkjertelen Ductal Adenocarcinoma og påvirke spredning og migrasjon av kreftceller. PLoS ONE 10 (3): e0118814. doi: 10,1371 /journal.pone.0118814
Academic Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 08.07.2014; Godkjent: 06.01.2015; Publisert: 05.03.2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. prosjektet ble støttet av Social Development guide Plan of Xi’an (SF1203 (5)) og Support Project for Youth of The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (YJ (QN) 201 204). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i den industrialiserte verden og sjette i Kina [1,2]. Gitt en mangel på forskjellige kliniske manifestasjoner og praktiske metoder for tidlig påvisning, de fleste pasienter ikke har mulighet til kirurgisk reseksjon når diagnosen [2]. Videre er ca 70% av pasientene som får kirurgi fremdeles gjennomgår tidlig tilbakefall i løpet av 6-12 måneder som følge av den svært aggressive egenskaper PDAC [3]. For tiden er den totale 5 års overlevelse av pasienter med PDAC er mindre enn 5%, uavhengig av behandlings [3]. Forbedre PC dødeligheten nødvendig oppdagelsen av nye verktøy for tidlig deteksjon, diagnose og overvåkning av terapeutisk effekt.
Flere tiår med studier viste at vedvarende endringer i genuttrykk mønstre på grunn av epigenetiske modifikasjoner, genmutasjoner og slettinger er avgjørende for utvikling, progresjon og vedlikehold av bukspyttkjertelsvulster [4]. Selv om en rekke endringer i genuttrykk har blitt funnet i PDAC, har det vært en utfordring å identifisere viktige gener som er ansvarlige for kreftutvikling og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen. En strategi for å sile ut kreftfremmende gener eller onkogener er å korrelere post-transkripsjons biomarkører med klinisk-patologisk funksjoner og overlevelse. Et gen som i vesentlig grad predikerer kreft progresjon og prognose kan direkte delta i karsinogenese eller samhandler med et gen som fungerer i patogenesen av kreft [5]. Videre identifisere nye markører er nyttig for å utvikle nye metoder for tidlig diagnose og bedre den dystre prognosen [6].
microRNAs (mirnas) er en ny familie av små (vanligvis 18-25 nukleotider), enkeltkjedet ikke-kodende RNA. mirnas binde spesifikke mål mRNA i 3’uoversatt regionen (UTR) med perfekt eller nesten perfekt komplementaritet, som resulterer i mål mRNA degradering eller oversettelse hemming, henholdsvis. Det er 2.042 modne humane mirnas for tiden er identifisert som er forutsagt for å regulere mer enn 30% av mål-human mRNA [7]. Nylig, viser økende bevis for at miRNA deregulering bidrar til kreftutvikling ved å fremme uttrykket av proto-onkogener eller ved å hemme uttrykket av tumorsuppressorgener [8]. Slike «Onco-mirnas» har også blitt demonstrert i PDAC: MIR-196a fremmer kreft progresjon ved å målrette NFKBIA, og miRNA-126 og 148a hemme kreft celle vekst ved å nedregulere CDC25B og ADAM9 henholdsvis [9-12]. Dessuten ble mange microRNAs funnet å være abnormt uttrykt i PDAC bruker uttrykket profilanalyse, selv om deres funksjonelle roller i bukspyttkjertelen kreftutvikling er fortsatt uklart [13-17]. Tatt i betraktning de deregulerte genuttrykk nettverk i bukspyttkjertelen kreft [18], er verdig videre leting ettertranskripsjonsregulering for målet genet i PDAC av mirnas.
Den prediktive betydning mikroRNA uttrykk for klinisk-patologisk funksjoner og klinisk resultatene av PDAC har også tiltrukket seg stor oppmerksomhet. Ved hjelp av high-throughput microarray chips, har tusenvis av microRNAs blitt evaluert i små prøver av pasienter med PDAC, og noen ble rapportert å være statistisk signifikante biomarkører for overlevelse [17,19,20]. Bloomston på el. profilert miRNA uttrykket i 65 par av PDAC vev og matchet godartede tilstøtende prøver bukspyttkjertelen vev [17]. De fant at 21 mirnas var oppregulert og fire mirnas ble nedregulert i PDAC og at en undergruppe av seks mirnas (MIR-452, MIR-105, MIR-127, MIR-518a-2, MIR-187, og MIR -30a-3p) var i stand til å skille langsiktige overlevende med lymfeknutepositiv sykdom fra de som døde i løpet av 24 måneder. Jamieson et al. assosiert miRNA uttrykk profiler i 48 PDAC vev med sin clinicopathologic funksjon og prognose, og funnet ut at 20 mirnas, inkludert MIR-21 og MIR-34a, spådde total overlevelse [20]. Det bør bemerkes at de mikroRNA biomarkører avdekket av disse undersøkelsene er ikke konsistente, som er delvis tilbakeføres til heterogenitet i egenskapene til de pasienter, så vel som variable studiedesign og statistiske analysemetoder. De fleste biomarkører avdekket av disse high-throughput studier har ikke validert i andre uavhengige studier, og deres funksjonelle rolle i PDAC utvikling er heller ikke klart [17,19,20]. Disse uoverensstemmelsene markere et behov for replikering av resultatene i en stor utvalgsstørrelsen for å validere prediktive betydninger av disse microRNAs. I denne studien, valgte vi 36 mirnas som ble rapportert å være deregulert i PDAC eller betydelig forutsi prognose i tidligere studier og evaluert deres prediktive betydning for overlevelse i 151 kinesiske pasienter med PDAC. Videre har vi analysert funksjonell rolle og målgener av to potensielle miRNA biomarkører i PDAC utvikling.
Materialer og metoder
2.1 Pasienter og prøvetaking
Denne studien registrert 151 pasienter som gjennomgikk kurativ pancreatectomy på The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University i perioden fra 2005 til 2010. Alle pasientene ble patologisk diagnostisert med primær menneskelig bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) ifølge WHO klassifisering. Ingen av pasientene hadde fått preoperativ kjemoterapi. De demografiske og klinisk-patologiske kjennetegn ved pasientene ble oppnådd ved å gjennomgå den medisinske poster og kontakter leger som har ansvaret. Den totale overlevelsestiden ble beregnet fra tidspunktet for diagnosen til døden for kreft i bukspyttkjertelen dødsfall eller datoen for siste kontakt eller død av andre årsaker til sensurert tilfeller. Totalt 151 formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) PDAC vev fra resected vevsprøver av disse pasientene ble brukt for miRNA uttrykk analyse. I tillegg ble 15 kreftvev og 14 tilstøtende normale pankreas vev oppnådd fra dissekerte kirurgiske prøver av 15 pasienter med PDAC. Alle studie prosedyrene ble godkjent av Medical Ethics Committee of The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (sertifikat nr MEC2012023). Alle deltagerne forutsatt informert skriftlig samtykke.
2,2 miRNA utvalg
Vi vurderte litteraturen om den prediktive betydning mirnas for kreft i bukspyttkjertelen overlevelse publisert 2007-2012 i PubMed database. Totalt 36 miRNAs ble valgt for validering i vår pasient kohort basert på to kriterier: 1) de ble rapportert å bli deregulert i PDAC eller forutsi overlevelse av PDAC; 2) de ble ikke validert i noen selvstendig pasient kohort. De undersøkte mirnas inkludert MIR-196a-2, MIR-219, MIR-452, MIR-105, MIR-127, MIR-518a-2, MIR-187, MIR-30a-3p, MIR-17-5p, speil 125b, MIR-141, MIR-154 *, MIR-181b, MIR-186, MIR-193, MIR-221, MIR-223, MIR-224, MIR-29C, MIR-30a, MIR-30c, MIR-30d , MIR-31, MIR-33a, MIR-34a, MIR-378, MIR-423, MIR-455, la-7b *, MIR-1207-3p, MIR-1296, MIR-1914 *, MIR-197, MIR -326, MIR-3610, MIR-4290.
2,3 cellelinjer
Den menneskelige PDAC cellelinjer, MiaPaca-2, BxPC3, Panc-1, og human bukspyttkjertel ductal epitel (HPDE) celler ble kjøpt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Cellene ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco, Life Technologies, Shanghai, Kina), supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin (Life Technologies, Shanghai, Kina). Celler ble holdt ved 37 ° C med 5% CO
2 i en fuktet inkubator og høstet med trypsin-EDTA i en eksponentielt voksende fase.
2,4 RNA isolering og kvantitative RT-PCR
mirnas ble isolert fra FFPE- delene med en Qiagen miRNeasy FFPE Kit (Hilden, Tyskland) etter produsentens protokoll. Kort, kreft vev var makro dissekert fra 4-6 lysbilder av FFPE PDAC prøver etter en gjennomgang av representative H E-fargede objektglass. De isolerte vev ble deparaffinized med xylen og vasket med etanol og tørket; De ble deretter behandlet med proteinase K ved 37 ° C over natten. Lysatet ble blandet med bindingsbuffer RBC og overført til en gDNA eliminator spinnkolonne for å fjerne genomisk DNA. Deretter ble en RNeasy MinElute kolonne benyttes for å binde total RNA fra den gjenværende væske. Det rensede RNA ble eluert fra denne kolonnen med RNase-fritt vann og ble kvantifisert ved absorbansen ved 260 nm med en ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop, Wilmington, DE, USA). Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler og microdissected cellene ved hjelp av en Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA). Uttrykket nivåer av hver miRNA ble undersøkt med en TaqMan kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) analyse ved hjelp av individuelle spesifikke primere og prober i henhold til produsentens instruksjoner (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). For mRNA kvantifisering, ble cDNA syntetisert fra 2 mikrogram av den store RNA brøkdel hjelp av M-MLV revers transkriptase, og real-time PCR-analyser ble utført med SYBR
Premiks Ex Taq
kit (Takara Bio, Otsu, Japan ). Primerne for mRNA kvantifisering ble innkjøpt fra AuGCT, Inc. (Beijing, Kina), og sekvensene er vist i tabell S1. Uttrykket nivåer av hver modne miRNA og mRNA ble evaluert ved hjelp av sammenlignende terskel syklus (Ct) metode og normalisert til U6 snRNA (2
-ΔCt). Folden endring av hvert miRNA /mRNA ble beregnet ut fra tumorvev /celler sammenlignet med normale vev /celler og behandlede celler versus ubehandlede celler. miRNA uttrykket ble bestemt å være høy når uttrykket nivået var høyere eller lik gjennomsnittet av kohorten og lavt når det var under gjennomsnittet for kullet.
2,5 miRNA etterligne og hemmer transfeksjon
funksjonelle konsekvenser av avvikende MIR-186 og Mir-326 uttrykk ble studert ved forbigående transfeksjon sine etterligner (MIR-186 etterligne og Mir-326 etterligne) hemmere (Anti-MIR-186 og Anti-MIR-326, Mirvana miRNA etterligner /hemmer , Life-teknologi, Shanghai, Kina), og tilsvarende negative kontroller (Anti-MIR-NC og MIR-NC for hver miRNA, GenePharma, Shanghai, Kina) inn MiaPaca-2, BxPC3, Panc-1 celler. Celler ble sådd på en 24-brønn plate med 10.000 celler per brønn og transfekteres 24 timer senere med en miRNA inhibitor eller etterligner ved en sluttkonsentrasjon på 10 nm ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Ved 48 timer etter transfeksjon ble cellene høstet for western blot eller QRT-PCR-analyser.
2,6 Cell Proliferation Assay
Celleproliferering ble testet ved kolo analyse ved hjelp av en WST-1 reagens Kit (Roche Applied Science, Basel, Sveits). En total på 5000 celler som hadde gjennomgått 48 timer etter transfeksjon ble plassert i hver brønn av en 24-brønnplate og inkubert i ytterligere 48 timer. Deretter ble 10 ul WST-1-reagens tilsatt og inkubert i 3 timer. Absorbansen ved 450 nm ble målt og sammenlignet med referanseverdien ved 650 nm ved anvendelse av en mikroplateavleser og analysert med Softmax Pro-5-programvaren. Hver eksperimentelle gruppe inkludert minst 8 replikate brønner, og alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger uavhengig av hverandre. Den relative celleproliferasjon ble normalisert med tilsvarende kontroll.
2,7 Transwell Cell Invasion analysen
BD Falcon 8,0-mm pore Transwell cellekulturinnsatser (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) var brukes til å evaluere invasivitet av PDAC celler transfektert med forskjellige mirnas eller negative kontroller. Innsatsene ble plassert i en 24-brønners plate i 30 minutter før utsåing celler. Totalt 3 x 10
4-celler ble plassert i hver brønn av det øvre kammer og ble inkubert i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO
2. Etter inkubering ble overført celler som forble på bunnflaten fiksert med 4% paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, Shanghai) løsning i 10 minutter, vasket med PBS og farget med 0,5% krystallfiolett (Sigma-Aldrich, Shanghai ) i 10 minutter. Celletelling ble utført ved anvendelse av en mikroplateleser. Alle forsøkene ble utført uavhengig i tre eksemplarer.
2,8 MiR-186 mål prediksjon
De antatte miRNA målene ble spådd av TargetScan [21], Miranda [22], og PITA [23 ], RNAhybrid algoritmer [24] med standardparameterne som inngår i programmet for hver. Den antatte målgener ble videre vist ut ved å vurdere bukspyttkjertelen uttrykk database (https://www.pancreasexpression.org) [18]. Vi valgte de genene som møtte to standarder: 1) de ble identifisert ved alle fire algoritmer; 2) de ble avslørt for å bli regulert sammen med PDAC utvikling i tidligere studier.
2,9 Luciferase assay
For å konstruere den grønne fluorescerende protein (GFP) reporter plasmid, 3′-UTR av fragment av den NR5A2 mRNA som inneholder den forutsagte MIR-186 bindingssete ble amplifisert ved PCR ved bruk av primerne som er oppført i tabell S1 og satt inn nedstrøms av GFP-genet i pcDNA3.1 /CT-GFP-TOPO vektor (Promega, Madison, WI, USA) . Den resulterende vektor ble kåret pGFP-NR5A2 3′-UTR. Seterettet mutagenese av MIR-186 målområde i NR5A2 3′-UTR ble utført ved hjelp av en Quickchange mutagenese kit (Stratagene, San Diego, CA, USA) med NR5A2 3′-UTR som en mal og ble kåret NR5A2 3 «-UTR-Mut. I den muterte konstruere, Mir-186 målområde 5»-ATTCTTT-3 «ble byttet ut med en 5′-ACTGAAT-3′ fragment. NR5A2 3′-UTR-Mut ble klonet inn i pcDNA3.1 /CT-GFP-TOPO-plasmid for å konstruere pGFP-NR5A2 3′-UTR-Mut. Alle de innsettinger ble bekreftet ved sekvensering. MiaPaca-2, BxPC3, og Panc-1 celler ble transfektert med pGFP-NR5A2 3»-UTR eller-Mut sammen med Mir-186 etterligner /Anti-MIR-186 eller tilsvarende kontroll vektorer (MIR-NC eller Anti-speil NC). Alle transfeksjoner ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble luciferase aktiviteter målt ved Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega, Madison, WI, USA). Hver Forsøket ble gjentatt tre ganger.
2,10 Western blot analyse
Western blotting ble utført for å bestemme NR5A2 protein uttrykk. Den totale proteinet ble ekstrahert fra PDAC vev og normale vev. Proteiner ble kvantifisert ved hjelp av Bradford-metoden i henhold til produsentens protokoll (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Prøver (50 pg protein) ble løst i en 10% SDS-PAGE og overført på en nitrocellulosemembran. Membranene ble probet med antistoffer for NR5A2 og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH). Alle antistoffer ble innkjøpt fra Abcam selskapet og ble anvendt ved en fortynning på 1: 500 for anti-NR5A2 og 1: 1000 for anti-GAPDH. Den LabWorks bilde oppkjøpet og analyse programvare (UVP, Upland, CA, USA) ble brukt til å kvantifisere bandet intensiteter.
2.11 Statistisk analyse
Overlevelseskurver ble konstruert med Kaplan-Meier analyse og sammenlignet ved hjelp en log-rank test for å vurdere påvirkning av individuelle miRNA og klinisk kovariat på utfallet. Vi brukte en multivariat Cox-modus for å vurdere samlet overlevelse risiko via beregne hazard ratio (HR) med 95% konfidensielle intervaller (CIS) med justering for å konkurrere risikofaktorer i en baklengs trinnvis måte. Variablene med
P
0,1 på univariat analyse ble inkludert i multivariat analyse. En χ
2 test ble utført for å gjøre en sammenligning av de kategoriske variabler. T-test, Mann-Whitney U-test og variansanalyse ble utført for å sammenligne kontinuerlige variabler når det passer. Alle de
in vitro
eksperimenter ble utført in triplo, og ble gjentatt minst to ganger, med data uttrykk som gjennomsnitt ± SD. Alle
P
-verdier er tosidig og anses statistisk signifikant når det er mindre enn 0,05. For fler testing ble falsk funnraten (FDR) beregnet ved hjelp av metoden beskrevet av Benjamini og Hochberg [25]. FDR anslår andelen av resultatene som ble erklært positive som faktisk er falske, og resultatene med FDR 0,05 for flere tester blir betraktet som statistisk signifikant. Statistisk analyse ble gjennomført på SPSS 16.0 programvare.
Resultater
3.1 Kjennetegn på pasientenes
Tabell 1 oppsummerer demografiske og klinisk-patologisk karakteristikk av de 151 PDAC pasienter inkludert i vår studie. De fleste pasientene hadde scene-T2 /3 klasse-1/2 svulster, med perinevral og venøs invasjon, positive lymfeknuter, og positive reseksjonskanten. Median total overlevelse var 16,2 måneder. Blant disse pasientene 110 pasienter døde innen 24 måneder etter reseksjon (definert som kortsiktig overlevende), og 41 pasienter overlevde 24 måneder etter reseksjon (definert som langsiktige overlevende). Det var ikke signifikante forskjeller i demografiske og klinisk-patologisk variabler mellom kortsiktige overlevende og langtidsoverlevende (FDR 0,05, tabell 1). Videre univariat analyse for disse 11 variabler med en log-rank test avslørte at dårlig total overlevelse var signifikant assosiert med venøs invasjon (
P
= 0,006, FDR = 0,033, fig. 1A) og reseksjon margin engasjement (
P
= 0,004, FDR = 0,033, fig. 1B), men ble nominelt assosiert med tumor differensiering (
P
= 0,021, FDR = 0,077, fig. 1C) og adjuvant kjemoterapi (
P
= 0,042, FDR = 0,116, fig. 1 D). De klinisk-patologiske faktorer med
P
verdi mindre enn 0,10 ble brukt for etterfølgende multivariat analyse.
Overlevelseskurver ble sammenlignet med log-rank-analyse for 11 demografiske og klinisk-patologisk variabler , og de med
P
0.05 er vist i denne figuren. FDR for hvert testresultat ble beregnet ved Benjamini og Hochberg metode.
3,2 miRNA uttrykket i PDAC prøver og deres klinisk-patologisk og prognostisk betydning
Vi målte uttrykket nivåer av 36 mirnas i 151 FFPE- vev av PDAC ved QRT-PCR og korrelert deres uttrykk nivåer med klinisk-patologiske funksjoner. Vi fant 1 miRNA uttrykt forskjellig basert på tumorstørrelse, 2 for lymfeknutemetastaser, og 3 for venøs invasjon etter kontroll for FDR 0.05 (tabell 2). Kreft vev med en størrelse som var større enn 2 cm uttrykt økt MIR-186 enn de som var mindre enn 2 cm (
P
0,0001, FDR = 0,004). Lymfeknutemetastaser signifikant korrelert med forhøyede MIR-186 (
P
= 0,002, FDR = 0,030) og Mir-224 (
P
= 0,0001, FDR = 0,002). Tumorprogresjon stadium hadde en signifikant sammenheng med økt Mir-186 uttrykk (stadium I ~ II vs III ~ IV;
P
≤ 0,0001, FDR = 0,004). Venøs invasjonen ble ledsaget av økt MIR-224 (
P
= 0,001, FDR = 0,012) og redusert MIR-326 (
P
0,0001, FDR = 0,001) og Mir-452 (
P
. 0,0001, FDR = 0,001)
Vi har evaluert senere den prognostiske verdien av disse 36 miRNA uttrykk nivåer i PDAC ved hjelp av to metoder beskrevet av Bloomston et al. [17]. Først vurderte vi de mirnas som hadde et absolutt uttrykk nivå som kan skille mellom kortsiktige og langsiktige overlevende. Vi fant ut at MIR-186, MIR-221, og MIR-224 var forskjellig over-uttrykt i pasienter med kortere overlevelse, mens MIR-125b og MIR-326 var over-uttrykt i pasienter med lengre overlevelse med
P
verdier av 3,3 × 10
-6 til 0,005 og FDR 0,0001 til 0,036 (tabell 3). Deretter gjennomførte vi en log-rank-analyse for å sammenligne Kaplan-Meier overlevelseskurver av to pasientgrupper som ble definert som høy eller lav uttrykk i forhold til gjennomsnitts uttrykk for hver miRNA på QRT-PCR. Fem mirnas vises nominell forskjell i overlevelseskurver om høy vs lav uttrykk (
P
0,05, figur 2.), Men bare miR186 og MIR-326 er fortsatt statistisk signifikant etter korrigering for FDR. Høy uttrykk for MIR-186 betydelig spådd en dårligere prognose (median overlevelse på 13,8 måneder for høyt uttrykk vs. 22,5 måneder for lavt uttrykk,
P
0,0001, FDR = 0,001). Høy uttrykk for MIR-326 korrelert med en bedre prognose (median overlevelse på 17,5 måneder for høyt uttrykk vs. 8,8 måneder for lavt uttrykk,
P
= 0,0005, FDR = 0,009). Til slutt, syv mirnas med
P
0,1 i de to foregående testene av overlevelse ble inkludert i en multivariat modell sammen med potensielle prognostiske klinisk-patologiske faktorer. Den Cox regresjonsanalyse bekreftet at høy ekspresjon av MIR-186 (HR = 1,655, 95% KI: 1,137 til 2,410,
P
= 0,009), MIR-224 (HR = 1,445, 95% KI: 1,033 til 2,021,
P
= 0,032) og Mir-221 (HR = 1,432, 95% KI: 1,007 til 2,036,
P
= 0,046) forble uavhengige prediktorer for dårlig resultat, mens høy uttrykk for MIR-326 (HR = 0,476, 95% KI: 0,317 til 0,715,
P
0,001) og adjuvant kjemoterapi (HR = 0,649, 95% KI: 0,443 til 0,950,
P
= 0,026) uavhengig spådd bedre overlevelse (tabell 4).
overlevelses~~POS=TRUNC kurver~~POS=HEADCOMP ble sammenlignet med log-rank-analyse for 36 mirnas, og de med
P
0.05 er vist i denne figuren. FDR for hvert testresultat ble beregnet ved Benjamini og Hochberg metode.
3.3 Funksjonelle konsekvenser av MIR-186 og MIR-326 regulering i humane PDAC celler
Først vi målt MIR-186 og MIR-326 nivåer på tre PDAC cellelinjer, HPDE celler, PDAC vev og tilstøtende normale vev ved QRT-PCR. Sammenlignet med normal bukspyttkjertelen vev eller HPDE celler, økt MIR-186 uttrykket nivå mer enn 4,4 ganger både i PDAC vevsprøver og cellelinjer. Omvendt, redusert MIR-326 uttrykk mer enn 0,5 ganger i både PDAC vev og cellelinjer (Fig. 3A og B). Videre ble 48 timer etter transfeksjon i tre PDAC cellelinjer, MIR-186 og MIR-326 redusert med ca 0,3-0,6 ganger etter transfeksjon av sine hemmere og økte 5-30 ganger etter transfeksjon med sine etterligner (Fig. 3C og D). Neste vi undersøkt effekten av nedregulering av disse to mirnas eller deres over-ekspresjon på celleformering, kolonidannelsen, og migrasjon i disse tre PDAC cellelinjer. Det ble observert at inhibering av MIR-186-ekspresjon i alle tre cellelinjer førte til en signifikant reduksjon i cellevekst (~ 50-79%;
P
0,01), mens overekspresjon av MIR-186 i disse cellene resulterte i en betydelig økning i celleformering (~ 96-420%;
P
0,05) sammenlignet med de respektive negative kontroller (figur 3E.). I motsetning til de MIR-186 resultater, MIR-326-inhibering forårsaket en signifikant økning i cellevekst (~ 19-35%;
P
0,001), mens det er opp-regulering ved transfeksjon førte til signifikant reduksjon av celleproliferasjon (ca. 21-32%;
P
0,01) sammenlignet med de respektive negative kontroller (figur 3F.). Til sammen både gevinst-og tap-av-funksjon eksperimenter konsekvent støttet de medvirkende effektene av MIR-186 og undertrykkende effekter av MIR-326 på PDAC celleproliferasjon. Transwell analyser ble utført for å fastslå effekten av MIR-186 eller MIR-326 regulering på celle migrasjon. Våre data indikerte at migrering av alle tre PDAC cellelinjer ble betydelig forbedret via MIR-186 over-ekspresjon ble indusert ved dens etterligner (omtrentlig 250-900%;
P
0,001) og ble inhibert av sin undertrykkelse (omtrentlig 35-62%;
P
0,01; fig. 3G). I motsetning til dette, MIR-326 over-ekspresjon resulterte i en betydelig reduksjon i migrering av BxPC3 celler (ca. 43%,
P
0,01), og dens undertrykkelse forårsaket en signifikant økning av migrasjon i alle tre PDAC cellelinjer (omtrentlig 150-500%,
P
0,001 fig. 3 H).
Analyse av MIR-186 (A) og Mir-326 (B) uttrykk i tre PDAC cellelinjer, HPDE celler, vev og PDAC tilstøtende normale bukspyttkjertelvev. (C) Analyse av Mir-186 uttrykk i tre PDAC cellelinjer etter transfeksjon av Mir-186 etterligne, Anti-MIR-186, og respektive negative kontroller. (D) Analyse av Mir-326 uttrykk i tre PDAC cellelinjer etter transfeksjon av Mir-326 etterligne, Anti-MIR-326, og respektive negative kontroller. Celleproliferasjon ble vurdert i PDAC cellelinjer transfektert med Mir-186 etterligner, Anti-MIR-186 eller tilsvarende negativ kontroll (E) og i PDAC cellelinjer transfektert med Mir-326 etterligner, Anti-MIR-326 eller tilsvarende negativ kontroll (F) ved hjelp av WST-1-assay. Relativ cellevekst ble normalisert til sine respektive styrebehandlet celler. Figurene viser relative cellemigrasjon etter enten hemming eller over-ekspresjon eksperimenter for MIR-186 (G) og MIR-326 (H), som evalueres av Transwell migrasjon analysen. Relativ cellemigrasjon ble normalisert til sine respektive styrebehandlet celler. Dataene presentert er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer standardavvik fra gjennomsnittet. *,
P
0,05, **,
P
0,01 og **,
P
0,001.
3.4 Validering av NR5A2 som MIR-186 Target Gene
Tre målgener for Mir-186 (NR5A2, FAM150B, CTNND2) og seks målgener for MIR-326 (PLXNA2, CUGBP2, RUNX3, HSD11B1, PKIA, SULF1) ble valgt av et kombinert søk i bioinformatikk databaser av antatte miRNA mål og bukspyttkjertelen uttrykk database. Foregående bevis antydet at disse genene kan bli regulert under PDAC utvikling. Flere algoritmer også spådd at de kan være mål for disse to miRNAs. For å finne ut om de kan være regulert av de to mirnas, vi først utført en QRT-PCR-analyse for å observere uttrykk endring av disse genene i PDAC celler ved hver miRNA gevinst-og tap-av-funksjon. Blant disse genene, vises bare den NR5A2 genet tilsvarende endringer i uttrykket i henhold til MIR-186 over-uttrykk og undertrykkelse. MiR-186 over-ekspresjon i MiaPaca-2, BxPC3, Panc-1-celler resulterte i en signifikant reduksjon i NR5A2 uttrykket (ca. 24-58%,
P
0,01). Hemming av endogen Mir-186 uttrykk i disse cellene betydelig økt NR5A2 mRNA nivå (omtrentlig 124-142%,
P
0,001 Fig. 4A).
(A) QRT-PCR analyser av NR5A2 uttrykk nivåer etter behandlingen av MiaPaca-2, BxPC3, Panc-1 celler med MIR-186 hemmere eller etterligner. (B) humant NR5A2 3′-UTR-fragment inneholdende en villtype (WT) og mutant (Mut) MIR-186-bindende sekvens ble klonet nedstrøms for luciferase reporter-genet. (C) Intensiteten av EGFP fluorescens ble redusert i kreftceller transfektert med både MIR-186 etterligner og NR5A2 WT 3′-UTR, men var uforandret i de transfektert med både MIR-186 etterligner og 3′-UTR mutant vektor. (D) Relativt lavere ekspresjon av NR5A2 ble funnet i cancerprøver, sammenlignet med deres normale motstykker ved hjelp av western blot-analyse. (E) det er en invers korrelasjon mellom ekspresjonsnivået av MIR-186 og NR5A2. Uttrykket Forholdet ble evaluert ved Pearsons korrelasjonsanalyse.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. *,
P
0,05, **,
P
0,01 og **,
P
0,001. HSA, Homo sapiens; PTR, Pan troglodytes; Mml Macaca Mulatta; Oga, Otolemur garnettii; MMU, mus.
Deretter brukte vi en EGFP reporter analyse for å validere målområde i NR5A2 mRNA 3′-UTR. Vi konstruerte plasmidene som inneholdt EGFP og enten en MIR-186-bindingssete (pEGFP-NR5A2 3′-UTR) eller en mutant område (pEGFP-NR5A2 3′-UTR-Mut) (Fig. 4B). Vi observerte om MIR-186 modulering av dens etterligner eller Anti-MIR-186 kan regulere EGFP reporter uttrykk. Når NR5A2 3′-UTR ble transfektert ble intensiteten av EGFP fluorescens betydelig redusert ved Mir-186 etterligner i MiaPaca-2, BxPC3, Panc-1 celler.
