Abstract
onkogen, aktive mutasjoner i
KRAS
initiere kreft i bukspyttkjertelen. Det er imidlertid to andre
Ras
familiemedlemmer,
Nras Hotell og
HRAS
, som kan aktiveres i nærvær av onkogene
Kras
. Rollen til disse villtype
Ras
proteiner i kreft er fortsatt uklar, som deres avbrudd har vist seg å forbedre eller hemme tumordannelse avhengig av sammenhengen. Som kreft i bukspyttkjertelen er kritisk avhengig av
Ras
signalering, vi testet og nå rapporterer at tap av
HRAS
øker tumor belastning og reduserer overlevelse i et onkogen
Kras
-driven bukspyttkjertelen adenokarsinom musemodell. Disse effektene ble sporet tilbake til de tidligste stadier av kreft i bukspyttkjertelen, noe som tyder på at villtype
HRAS
kan undertrykke startfasen. I normale celler, aktiveres
Ras
kan undertrykke spredning gjennom p53-avhengige mekanismer. Vi finner at kreft undertrykkende effekten av
HRAS
er opphevet i en homozygot mutert p53 bakgrunn. Som sådan, tap av villtype
HRAS
fremmer de tidligste stadier av kreft i bukspyttkjertelen i en p53-avhengig måte
Citation. Weyandt JD, Lampson BL, Tang S, Mastrodomenico M, Cardona DM, Counter CM (2015) Wild-Type
HRAS
undertrykker de tidligste stadiene av tumordannelse i et genmanipulert musemodell for kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 10 (10): e0140253. doi: 10,1371 /journal.pone.0140253
Redaktør: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Tyskland
mottatt: 27 februar 2015; Godkjent: 23 september 2015; Publisert: 09.10.2015
Copyright: © 2015 Weyandt et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute, USA (https://www.cancer.gov) stipend CA123031. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det er anslått at ca 1,5% av amerikanerne vil utvikle kreft i bukspyttkjertelen, primært
p
ancreatic
d
uctal
en
Deno
c
arcinoma (PDAC). De aller fleste av disse personene vil gi etter for denne sykdommen, med en fem-års overlevelse på bare 6,7% [1]. Således er det viktig å belyse de signalbaner som ligger til grunn for denne utrolig dødelige kreft. Aktivering mutasjoner i
KRAS
er den vanligste genetiske endringer som finnes i menneskets PDAC, å være til stede i over 90% av alle tilfeller. Faktisk er det Ras veien hevdet å være engasjert i hovedsak alle PDAC [2].
KRAS
, og de andre familiemedlemmene Ras
NRAS Hotell og
HRAS
, kode svært knyttet små GTPases. Normalt stimulering av guanin nukleotid-utvekslings faktorer [GEFs] fremmer omdannelsen av Ras fra en inaktiv, GDP-bundet tilstand til en aktiv, GTP-bundet tilstand. Ras-GTP binder seg til og aktiverer effektor proteiner som engasjerer MAPK, PI3K, RalGEF og andre signalveier involvert i cellevekst og overlevelse. GTPase aktiverende proteiner (hull) og deretter forbedre hydrolyse av GTP og gå Ras tilbake til en inaktiv tilstand [3].
De somatiske mutasjoner oppdaget i
KRAS
genet inaktivere endogen eller Luft stimulert GTPase aktivitet av det kodede protein, noe som resulterer i konstitutivt GTP-bundet og aktivert Kras [3]. I tillegg til å være vanligvis påvist i PDAC [2], er disse mutasjoner også funnet i de tidligste stadiene av sykdommen [4] og, når det innføres i den murine
Kras
genet, indusere tidlig fase kreft i bukspyttkjertelen som kan fremdriften til frank PDAC [5]. Som sådan, onkogene mutasjoner i
KRAS
er tenkt å være driver mutasjoner i PDAC.
Selv om involvering av onkogene mutant form av Kras i kreft i bukspyttkjertelen er godt beskrevet, de resterende vill skriver Ras isoformer kan også aktiveres. De første tips i denne forbindelse var de funn som rettet mot negativ regulator RasGAP til plasmamembranen [6] eller redusere villtype Nras uttrykk [7] fuktet onkogen HRAS signalering. Faktisk, vill-type Nras og HRAS har blitt funnet å være aktivert på nedstrømssiden av onkogene Kras på en måte som er avhengig av
S
-nitrosylation [8] eller ekspresjon av GEF son-i-sevenless [SOS] [9 ]. Videre villtype Ras-proteiner er fortsatt utsatt for aktivering ved vekstfaktorer, selv i nærvær av onkogene Kras [10].
Wild-type Ras-proteiner kan ha avvikende effekter avhengig av innstillingen. På den ene side kan de inhiberer tumorigenesis. Nærmere bestemt, kan onkogen Ras indusere en senescent vekststans når det uttrykkes i normale celler [11] og hemme tumordannelse [12], som tyder på en tumorundertrykkende rolle for villtype-Ras-proteiner. I avtalen, carcinogen-indusert onkogene mutasjoner i
Kras
eller
HRAS
i lunge- og hudkreft hos mus er ofte ledsaget av tap av den gjensidige villtype-allelet [13-15]. Tilsvarende tap av heterozygositet av onkogene
RAS
genet har blitt rapportert i kreft hos mennesker [16]. Videre mus som manglet ett allel av villtype
Kras product: [15], eller begge alleler av enten
HRAS
eller
Nras
, utvikle mer
Kras
mutasjon-positive lungesvulster [17]. En svulst-undertrykkende rolle for villtype
Nras
ble også observert i en musemodell for thymus lymfomer drevet av onkogene
Nras product: [18]. Dermed kan villtype Ras-proteiner være svulst undertrykkende, spesielt i innstillingene for tidlig tumorigenesis.
Wild-type Ras-proteiner kan også fostre tumorigenesis. Spesielt mus mangler en eller begge alleler av villtype
HRAS
eller
Nras
utvikle færre kreftfremkallende utløst
HRAS
mutasjon-positive hudkreft [17]. Knocking ned uttrykket av villtype Ras-proteiner [8, 19], eller redusere deres aktivering av eNOS [8] eller SOS [9], hemmer celle levedyktighet, transformasjon, og /eller tumorigent vekst av
KRAS
mutasjon-positive humane kreftcellelinjer. Omvendt, stimulering av villtype-Ras-proteiner av EGF fremmer proliferasjon av slike celler [10]. Således, spesielt i modeller for mer avansert sykdom, villtype-Ras-proteiner kan forbedre tumorgenese.
Gitt at villtype-Ras-proteiner kan aktiveres nedstrøms for onkogen Kras, men likevel gi opphav til motsatte effekter på tumorigenesis avhengig den forbindelse er det viktig å fastslå deres rolle i kreft oftest assosiert med
KRAS
mutasjoner, nemlig i bukspyttkjertelen. Dermed vurderte vi konsekvensen av å forstyrre den endogene, villtype
HRAS
genet på utvikling av onkogene
Kras
-driven tumorigenesis i bukspyttkjertelen hos mus. Vi rapporterer at tap av villtype
HRAS
fremmer tumordannelse i denne modellen, noe som tyder på en svulst undertrykkende rolle for villtype
HRAS
på tidlige stadier av kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og metoder
Mus bukspyttkjertelkreft modeller
Kras
LSL-G12D /+
,
Trp53
LSL-R172 /+
, og
PDX-en-Cre
tg /+
mus ble hentet fra Jackson Labs og som en slags gave fra David Kirsch.
HRAS
– /-
mus var en slags gave fra NCI og Eugenio Santos.
Kras
LSL-G12D /+
; HRAS
+/- Hotell og
PDX-en-Cre
tg /+
; HRAS
+/-
mus ble avlet for å generere
HRAS
+ /+ Hotell og
HRAS
– /-
KC (
LSL-Kras
G12D /+
, PDX-en-Cre
tg /+
) kullsøsken.
Kras
LSL-G12D/+
;Trp53
LSL-R172/+
;Hras
+/+
og
PDX-en-Cre
tg /+
; HRAS
+ /+
mus ble avlet for å generere
HRAS
+ /+
KPC (
LSL-Kras
G12D/+
;Trp53
LSL-R172/+
;Pdx-1-Cre
tg/+
) mus.
Kras
LSL-G12D/+
;Trp53
LSL-R172/+
;Hras
-/-
og
PDX-en-Cre
tg /+
; HRAS
– /-
mus ble avlet for å generere
HRAS
– /-
KPC mus.
Kras
LSL-G12D/+
;Trp53
LSL-R172/+
;Hras
+/+
og
PDX-en-Cre
tg /+
; Trp53
LSL-R172 /+
; HRAS
+ /+
mus ble avlet for å generere
HRAS
+ /+
KPPC (
LSL-Kras
G12D /+
; Trp53
LSL-R172 /LSL-R172H
, PDX-en-Cre
tg /+
) mus.
Kras
LSL-G12D/+
;Trp53
LSL-R172/+
;Hras
-/-
og
PDX-en-Cre
tg /+
; Trp53
LSL-R172 /+
; HRAS
– /-
mus ble avlet for å generere
HRAS
– /-
KPPC mus. De beskrevne Musene ble overvåket for helse og vekt tre ganger per uke og ble avlivet på enten de angitte faste tidspunkter eller ved å nå en moribundity endepunkt. Moribundity endepunkter ble definert som vekttap overstiger 15% av total kroppsvekt, indikasjoner på mage ascites eller hevelse, eller tegn på smerte eller ubehag. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. En protokoll for denne studien ble spesielt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Duke University (protokoll A279-13-11).
Mus PDAC cellelinjer
Bukspyttkjertel svulstvev fra tre
HRAS
+ /+ Hotell og tre
HRAS
– /-
KPC mus ble hakket i kollagenase V (Sigma-Aldrich ) i 30 minutter ved 37 ° C, og resulterende celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles Media (DMEM) + 10% FBS i minst 4 passeringer.
Kvantifisering av normal pankreas acinar område
prosent~~POS=TRUNC av normal acinar området ble kvantifisert ved 8 og 36 ukers tidspunkter i KC mus i en blindet studie av 4-5 tilfeldig utvalgte høy effekt felt av H E-farget i bukspyttkjertelen seksjon per mus. Mengden av acinar areal per avsnitt ble uttrykt som en prosentandel av det totale arealet av vev i feltet, bestemmes ved hjelp av Adobe Photoshop frihåndsmarkeringsverktøy
Gradering av bukspyttkjertelen lesjoner
H . E farget seksjonene ble blindt anmeldt av patologer (S. Tang, M. Mastrodomenico og D. Cardona) på 4, 8 og 36 ukers tidspunkter. Hver lobule i bukspyttkjertelen fra hver seksjon ble undersøkt, og høyeste karakter lesjon (ADM eller Panin) fra hver lobule ble identifisert, og prosent av lobules med den høyeste karakteren av hver type lesjon ble fastsatt basert på det totale antallet lobules telles.
ADM immunoflourescent farging
bukspyttkjertelen prøver fra
KC
mus ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og 8 um tykke seksjoner ble kuttet ved hjelp av en cryotome. Prøvene ble fiksert med 4% paraformaldehyd og permeabilisert i 0,2% Triton-X-100. Prøvene ble blokkert i normalt serum esel deretter inkubert med 1: 100 fortynning av de primære antistoffene geite-anti-amylase C-20 og sc-12821 kanin-anti-CK-19 H-60 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) over natten ved 4
° C. Prøvene ble deretter inkubert med de sekundære antistoffer Alexa fluor 488 Esel-anti-kanin IgG (Invitrogen A-21206) eller Alexa-fluor 594 esel anti-geit IgG (Invitrogen A-11058) ved en 1: 500 fortynning i 1 time ved romtemperatur , deretter montert med forlenge Gold antifade reagens med DAPI (Life Technologies P36931). Totalt antall lesjoner med celler co-farging for amylase og CK-19 ble kvantifisert per høy effekt felt i fusjonerte bilder fra en Zeiss Axio Imager Widefield fluorescens mikroskop blindt.
Senescence-forbundet β-galaktosidase farging
Snap-frosne bukspyttkjertelen prøver ble farget som beskrevet av Debacq-Chainiaux
et al product: [20] og 5 tilfeldig valgt, høy effekt, ble bilder fra en Olympus Vanox X mikroskop kvantifisert ved hjelp av Image J programvare blindt. Color thresholding ble benyttet for å bestemme den totale mengden av flekker per høy effekt felt, og frihåndsmarkeringsverktøy ble brukt til å velge bare de lesjoner, hvor farge thresholding ble brukt til å beregne hvor stor andel av positiv farging området fra bare de lesjoner.
Ki67, CC3, og p16 immunhistokjemi
Heat-indusert antigen henting ble utført på formalinfiksert, parafininnstøpte seksjoner, etterfulgt av farging med en anti-Ki67 primær antistoff i en 1:50 fortynning ( Dako M7249), et anti-CC3 primært antistoff ved en 1: 100 fortynning (Cell Signaling, D175), eller anti-p16 primære antistoff (BD Biosciences, 551 153) ved en 1: 100 fortynning. Peroksidase-basert gjenkjenning ble utført ved hjelp Vectastain Elite ABC Kit (Vector labs). Det totale antall Ki67-positiv farging celler per felt i hvert av 5 tilfeldig valgte, høy strøm felt ble tellet på en blindet måte, så vel som antall lesjoner med i det minste en positiv-farging celle og kvantifisert som en prosentandel av det totale antall lesjoner. For CC3 og p16, ble 5 tilfeldig utvalgte, høy effekt felt kvantifisert på en blindet måte ved hjelp av Image J programvare. Color thresholding ble benyttet for å bestemme den totale mengden av CC3 og p16 flekker per høy effekt felt, og frihåndsmarkeringsverktøy ble brukt til å velge bare de lesjoner, hvor farge thresholding ble brukt til å beregne hvor stor andel av positiv farging området fra kun lesjoner .
HRAS
-GTP analyse
Tidlig passasje (innen 5 passasjer fra tilpasning til kultur)
HRAS
– /-
KPC cellelinjer ble stabilt infisert med retrovirus avledet fra pBabePuro (vektorkontroll) eller pBabePuroFLAG-HRAS som koder for villtype-mus
HRAS
cDNA, og valgt med puromycin, som tidligere beskrevet [21]. Stabile linjer ble deretter testet innen 2 passasjer for HRAS GTP nivåer av affinitet fangst med RBD av Raf, etterfulgt av immunblot for HRAS med en α-HRAS antistoff (Santa Cruz, sc520), som tidligere beskrevet [21].
PCR av
Kras
alleler
DNA ble isolert fra bukspyttkjertelen vev, ansikts papillomer, eller vulva svulster og forsterket av PCR for å påvise villtype og saman
Kras
alleler som tidligere beskrevet [5].
statistikker
statistiske analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism v5 (GraphPad Software). En 2-sidig, uparet
t
-test ble brukt for å sammenligne mengden av normal acinar vev igjen i pankreata i
HRAS
+ /+ Hotell og
HRAS
– /-
KC Hotell og
KPPC
mus, og sammenligne nivåer av Ki67, p16, ADM, SA-β gal, og CC3 flekker i hver årsklasse. En to-sidig uparet
t-
test ble også brukt til å sammenligne nivået av hver type gradert lesjoner ved de angitte tidspunkter og antall ansikts papillomer mellom kohorter. Disse resultatene ble deretter bekreftet ved Mann-Whitney-test ved anvendelse av den samme programvare. Kaplan-Meier overlevelseskurver ble generert for hver av
KPC Hotell og
KPPC
kohorter, samt for utvikling av ansikts- og vulva papillomer over tid i
KPC
årsklasse, og
P
-verdier ble beregnet ved bruk av log-rank (Mantel-Cox) test.
Resultater
Økt antall Panin lesjoner i fravær av vill skriv
HRAS
for å vurdere rollen til villtype Ras-proteiner på onkogene
Kras
-driven bukspyttkjertelen tumorigenesis
in vivo
, mus ble generert med enten homozygot null
HRAS
– /- product: [22] eller villtype
HRAS
+ /+
alleler i en
K
ras
LSL-G12D /+
, PDX-1-
C
re
tg /+ product: (KC) bakgrunn [5]. Vi valgte HRAS, som det er aktivert på nedstrømssiden av onkogene Kras i PDAC cellelinjer [8-10], og av de tre
Ras
gener, er den eneste som ikke er embryonisk dødelig i en bakgrunn som det av KC mus som koder for bare en funksjonell
Kras
allel [22]. Vi valgte KC modellen fordi aktiveringen av en endogen onkogen (G12D)
Kras
i utviklings bukspyttkjertelen til disse mus resultater i utviklingen av pre-invasive bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi (PanINs) at fremgangen til en lav frekvens til PDAC gjennom en rekke histologiske forandringer som ligner de man ser hos mennesker [5]. Årskull av 12
HRAS
+ /+ Hotell og
HRAS
– /-
KC mus ble generert og deretter avlives på 36 ukers alder, en tid da et spekter av Panin lesjoner er lett oppdages [5]. H E farging av pankreas seksjoner avdekket en ærlig tap av normalt vev og utvidelse av Panin lesjoner i
HRAS
– /-
KC mus (fig 1A). Kvantifisering av mengden av normal acinar vev avdekket at
HRAS
+ /+
KC mus hadde et gjennomsnitt på 14,5% normalt vev /felt, mens
HRAS
– /-
KC mus hadde 2,9%, en betydelig nedgang på nesten fem ganger i
HRAS
– /-
KC mus (fig 1B). Denne effekten var mer tydelig når prosentandelen av de delene som mangler normal acinar vev ble kvantifisert. 5% av delene i
HRAS
+ /+
KC mus manglet normal acinar vev mens denne verdien var 55,1% i
HRAS
– /-
KC mus, en økning på over 11 ganger i
HRAS
– /-
KC mus (fig 1C). Patologisk gradering av 2146 bukspyttkjertelen lappene fra
HRAS
+ /+
KC mus og 1419 lapper fra
HRAS
– /-
KC mus viste 27,4% færre lapper uten lesjoner og 30% flere lapper med høyeste karakter vesen Panin 1A i
HRAS
– /-
KC mus (fig 1D). Dermed villtype
HRAS
undertrykker tumorigent aktiviteten av onkogene
Kras
under bukspyttkjertelen tumorigenesis
(A) Representant H E farget seksjoner (pilspisser: normal acinar celler), (B) kvantifisering av% total normal acinar område rester per feltet (ved 4x forstørrelse, 4-5 felt fra 12 mus, bar: gjennomsnitt ± SEM), (C)% av felt (ved 4x forstørrelse) uten normal acinar vev (basert på data fra B) og (D)% av lobules med den angitte høyeste karakter lesjon (NML: normal, 1A: Panin-1A, 1B: Panin-1B, bar : gjennomsnitt ± SEM) av pankreata isolert fra
HRAS
+ /+
versus
HRAS
– /-
KC mus 9 måneders alder. (E) Kaplan-Meier kurve for
HRAS
+ /+ product: (n = 45) versus
HRAS
– /-
(n = 23) KPC mus. ns: ikke signifikant. * P 0,05. *** P . 0,0001
Redusert overlevelse i fravær av villtype
HRAS
Riktignok ovenfor tilnærmingen ikke bestemme effekten av
HRAS
tap på vanligste diagnosen fasen av PDAC [23] eller på overlevelse, den mest klinisk relevant endepunkt. For å overvinne disse svakhetene, genererte vi
HRAS
+ /+ Hotell og
HRAS
– /-
mus i en
K
ras
LSL-G12D/+
;Tr
p
53
LSL-R172H/+
;Pdx-1-
C
re
tg/+
[KPC] innstillingen [24]. Disse musene er basert på KC genetisk bakgrunn, men inneholder en ytterligere induserbar dominant-negativ
Trp53
R172H
allele, som fremmer PDAC at patologisk ligner den humane sykdommen [24]. Årskull av 45
HRAS
+ /+ Hotell og 23
HRAS
– /-
KPC mus ble generert og overvåkes regelmessig . Musene ble avlivet ved oppnådd humane moribundity endepunkter for å fastslå deres levetid. Denne analysen viste at median overlevelse i
HRAS
+ /+
KPC mus var 183 dager, men 141 dager i
HRAS
– /-
KPC mus, en betydelig reduksjon på nesten en fjerdedel i
HRAS
– /-
KPC mus (fig 1E). Dermed tap av villtype
HRAS
ikke bare forsterker tidlig onkogene
Kras-
drevet bukspyttkjertelen tumorigenesis, men er også assosiert med en reduksjon i levetid hos mus utviklings PDAC.
Økt antall hud papillomer i fravær av villtype
HRAS
i tillegg til Panin lesjoner, KC mus er utsatt for å utvikle hud papillomer i ansiktet og vulva vev på grunn av Cre uttrykk av
PDX-en
i disse vev [5, 25-27]. Utviklingen av papillomer i de samme KC-mus gir en godt kontrollert system for å vurdere rollen til villtype HRAS i en andre uavhengig vevstype [25]. For å oppnå dette, overvåket vi antall ansikts papillomer utvikling i kohorter av 24
HRAS
+ /+ Hotell og 27
HRAS
– /-
KC mus. Visuell inspeksjon avdekket en tydelig økning i antall ansikts lesjoner (fig 2A) av papilloma patologi (Fig 2B) i
HRAS
– /-
KC mus. Kvantifisering avdekket at det var et gjennomsnitt på 0,7 ansikts papillomer /mus i
HRAS
+ /+
KC årsklasse, men 2,5 i
HRAS
– /-
KC kohort, en betydelig økning på nesten fire ganger i
HRAS
– /-
KC mus (fig 2C). Videre, mens bare omtrent halvparten av
HRAS
+ /+
KC mus utviklet en papilloma ved studieslutt, all den
HRAS
– /-
KC mus utviklet minst en papilloma (figur 2D). PCR av DNA fra en undergruppe av disse papillomer avslørte den forventede rekombinasjon av
LSL-Kras
G12D
allel (S1 fig). Kanskje mest talende, gjennomsnittlig tid når disse lesjonene først dukket opp i
HRAS
+ /+
KPC mus var 123 dager, men 80,5 dager i
HRAS
– /-
KPC mus, en betydelig nedgang på 42,5 dager i
HRAS
– /-
KPC mus (fig 2D). Tilsvarende vulva papillomer også dukket opp i gjennomsnitt 8 dager tidligere i
HRAS
– /-
KPC mus (Fig 2E). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at tap av HRAS fremmer onkogen Kras-drevet hud tumorigenesis, potensielt på et svært tidlig stadium som innvier
(A) Representant fotografi (hvit pil) og (B) H E farget delen av ansikts papillomer som utvikler seg i KC mus. (C) Antall ansikts papillomer per
HRAS
+ /+ product: (n = 31) versus
HRAS
– /-
(n = 28) KC mus (bar: gjennomsnitt ± SEM). (D)% av total
HRAS
+ /+ Hotell og
HRAS
– /-
KC mus (fra C ) som utviklet ansikts papillomer. (E)% ansikts papilloma overlevelse av
HRAS
+ /+ product: (n = 45) versus
HRAS
– /- product: (n = 23) KPC mus. (F)% vulva papilloma overlevelse av
HRAS
+ /+ product: (n = 19) versus
HRAS
– /- product: (n = 11) kvinnelige KPC mus. *** P . 0,0001
Tap av villtype
HRAS
påvirker tidlig bukspyttkjertelen tumorigenesis
De ovennevnte observasjoner peker mot
HRAS
null bakgrunn påvirker et tidlig stadium av tumorigenesis, som innvielse. For å vurdere om dette kan forklare den observerte økningen i bukspyttkjertelen lesjoner i KC mus og redusert levetid i KPC mus ved tap av villtype
HRAS
, bukspyttkjertel tumorigenesis ble analysert ved 8 ukers alder, da KC mus typisk har færre og lavere klasse lesjoner [5]. H E farging av pankreas seksjoner igjen viste en reduksjon i normalt vev og utvidelse av Panin lesjoner i
HRAS
– /-
KC mus (fig 3A). Kvantifisering av mengden av normal acinar vev avdekket at
HRAS
+ /+
KC mus hadde et gjennomsnitt på 94,6% normalt vev /felt, mens
HRAS
– /-
KC mus hadde 75,9%, en betydelig reduksjon av nesten 20% i
HRAS
– /-
KC mus (fig 3B ). Denne virkning var spesielt tydelig når analysen ble gjentatt ved å kvantifisere antallet seksjoner med gjenværende alle normale acinar vev. 24% av delene i
HRAS
+ /+
KC mus hadde all normal acinar vev, sammenlignet med 4% i
HRAS
– /-
KC mus, en reduksjon på 6 ganger i
HRAS
– /-
KC mus (fig 3C). Patologisk gradering av 1566 bukspyttkjertelen lapper fra
HRAS
+ /+
KC mus og 1544 bukspyttkjertelen lapper fra
HRAS
– /-
KC mus viste 18,7% flere lapper uten lesjoner og en trend mot mer Panin 1A lesjoner i
HRAS
– /-
KC mus (fig 3D). Interessant, patologisk gradering viste også en betydelig økning på over 2 ganger i antall lobules med acinar-til-ductal metaplasi (ADM) som den høyeste grad av lesjon i
HRAS
– /-
KC mus (fig 3D). ADM (
e
.
g
Fig. 3E) er en av de tidligste endringene i bukspyttkjertelen av PDAC musemodeller, og har blitt foreslått som en mulig forløper til Panins lesjoner [28, 29]
(A) representant H E farget seksjon (pilspiss: Panin lesjon), (B) kvantifisering av% total normal acinar område rester per feltet (ved 4x forstørrelse, 5 felt fra 10 mus, bar: gjennomsnitt ± SEM), (C)% av felt med alle normale acinar vev (fra B), og (D)% av lobules med den angitte høyeste karakter lesjon (NML: normal, ADM: acinar-til-ductal metaplasi, 1A: Panin-1A, bar: gjennomsnitt ± SEM) av pankreata isolert fra
HRAS
+ /+
versus
HRAS
– /-
KC mus ved 8 ukers alder. (E) Representant H E farget del av en bukspyttkjertel fra en 8-ukers gamle KC mus (pilspiss: acinar-til-ductal metaplasi). (F)% av lobules med den angitte høyeste karakter lesjon (NML: normal, ADM: acinar-til-ductal metaplasi, 1A: Panin-1A bar: gjennomsnitt ± SEM) av pankreata isolert fra
HRAS
+ /+
versus
HRAS
– /-
KC mus ved 4 ukers alder. (G) Representant bukspyttkjertel delen fra en 4-ukers gamle
HRAS
+ /+
versus
HRAS
– /-
KC mus immunostained for celler (DAPI, blå) og markører for acinar (amylase, rød) og duktalt (CK-19, grønn) celler for å markere ADM lesjoner (co-flekker, gul). (H) Antall amylase
+ /CK-19
+ positive (ADM) celler per felt (til 4x forstørrelse, (på 4x forstørrelse, 5 felt fra 10 mus) fra pankreata isolert fra
HRAS
+ /+
versus
HRAS
– /-
KC mus ved 4 ukers alder (bar: gjennomsnitt ± SEM). * . P 0,05 *** P . 0,0001
Gitt økningen i de tidlige karakteren lesjoner på 8 uker i
HRAS
– /-
KC mus, vi utforsket virkningen av
HRAS
null genotype ved 4 ukers alder når vanligvis er det lite eller ingen bevis for bukspyttkjertel lesjoner i KC mus. Patologisk gradering av 867 lapper fra
HRAS
+ /+
KC mus viste, som forventet, nesten alle lappene (95,6%) manglet noen lesjon (fig 3F). i kontrast, var det en betydelig økning på nesten fem ganger i antall lapper med høyeste grad av ADM lesjoner og nesten 7 ganger i antall lapper med Panin 1A lesjoner i
HRAS
– /-
KC mus (fig . 3F) Denne forskjellen ble ikke rekapitulert i kultur, som antall ADM hendelser var lik mellom kultivert
HRAS
– /-
versus
HRAS
+ /+
akinærceller når
LSL-Kras
G12D
ble aktivert ved Ad-Cre (ikke vist). Men vi uavhengig og direkte validert økningen i ADM lesjoner
in vivo
i
HRAS
– /-
KC mus ved å kvantifisere antall celler co -staining for immunoflourescent markører acinar (amylase) og duktalt (CK-19) celler (fig 3G). Kvantifisering viste et gjennomsnitt på 4,7 amylase /CK-19 co-farging bukspyttkjertelen lesjoner /felt i
HRAS
+ /+
KC mus, men 6,6 i
HRAS
– /-
KC mus, en betydelig økning i
HRAS
– /-
KC mus (fig 3H). Det var ingen forskjell i mengden av Ki67 (en markør for celleproliferasjon), CC3 (en markør for apoptose), SA-β-gal eller P16 (markører for senescence) positiv-flekker lesjoner mellom
HRAS
+ /+ Hotell og
HRAS
– /-
KC mus (S2A-S2D Fig), noe som tyder på at forskjellen formidles av tap av HRAS hadde allerede skjedd etter den tid lesjoner ble oppdaget. Samlet utgjør disse data tyder på at HRAS undertrykker tidlig bukspyttkjertelen tumorigenesis, kanskje på scenen for innvielse.
Wild-type
HRAS
er aktivert i PDAC
Wild-type Ras kan aktiveres i nærvær av et mutant allel onkogen i cancercellelinjer [8-10, 19]. I bukspyttkjertelen vev ved 8 ukers alder, da det er få Panin lesjoner i
HRAS
+ /+
KC mus (fig 3A og 3B), HRAS ble ikke oppdaget på nevne nivåer (ikke vist). For å vurdere status for HRAS i senere stadier av sykdommen, ble PDAC cellelinjer etablert fra tre forskjellige
HRAS
+ /+ Hotell og
HRAS
– /-
KPC mus. GTP-bundet HRAS ble deretter affinitet tatt med Raf-RBD, etterfulgt av immunblotting med et anti-HRAS antistoff for å påvise proteinet. I alle tre
HRAS
+ /+
KPC cellelinjer, HRAS-GTP ble gjenvunnet. I kontrast til dette bassenget av aktiv HRAS var helt fraværende i PDAC tumor celler avledet fra de tre
HRAS
– /-
KPC mus (Fig 4A). Dessuten var dette pool av aktiv Ras restaurert ved re-uttrykke villtype HRAS i to
HRAS
– /-
KPC cellelinjer ved tidlig passasje (fig 4B), selv om denne effekten ble tapt når cellene ble passert (ikke vist). Dermed tap av HRAS fjerner en pool av aktiv Ras fra bukspyttkjertelen kreftceller.
immunoblotanalyse av HRAS og HRAS-GTP i PDAC cellelinjer avledet fra (A)
HRAS
– /- plakater (cellelinjer 1-3) og
HRAS
+ /+ plakater (cellelinjer 4-6) KPC mus eller (B) PDAC celle linje 1 og 3 er avledet fra
HRAS
– /-
KPC mus stabilt infisert med et retrovirus som koder for ikke transgene (vektor, V) eller vill-type HRAS (H). Tubulin tjener som en lasting kontroll. (C) Representant H E farget seksjoner fra pankreata av
HRAS
+ /+
versus
HRAS
– /-
KPPC mus ved 14 dagers alder. (4x forstørrelse) (D) Kvantifisering av% normal acinar område rester per feltet (ved 4x forstørrelse, 5 felt fra 10 mus) fra
HRAS
+ /+
versus
HRAS
– /-
KPPC mus (bar: gjennomsnitt ± SEM). (E) Kaplan-Meier overlevelseskurven for
HRAS
+ /+ product: (n = 20) versus
HRAS
– /- product: (n = 11) KPPC mus. ns. uvesentlig
Tap av villtype
HRAS
har ingen åpenbar effekt på bukspyttkjerteltumordannelse i en homozygot mutert p53 bakgrunn
Effekten på bukspyttkjertelen tumorigenesis ved å miste HRAS i en homozygot
Trp53
R172H
bakgrunn, som har blitt rapportert å undertrykke et tap av bukspyttkjertelen celler når
LSL-Kras
G12D
allelet er aktivert [30], var neste bestemt. Årskull av 10
HRAS
+ /+
versus
HRAS
– /-
mus i en
Kras
LSL-G12D/+
;Trp53
LSL-R172H/LSL-R172H
;Pdx-1-Cre
tg/+
(KPPC) bakgrunn ble avlivet ved et fast tidspunkt av 14 dager gamle, og mengden av normalt vev acinar igjen i pankreas ble undersøkt (Fig 4C). Kvantifisering av H E farget pankreas seksjoner viste ingen signifikant forskjell i mengden av normalt vev som gjenstår mellom de to gruppene (figur 4D). Årskull av 20
HRAS
+ /+ Hotell og 11
HRAS
– /-
KPPC mus fikk også lov til alder inntil moribundity endepunkter, avslører en nesten identisk median overlevelse på 50 og 47,5 dager, henholdsvis (figur 4E).
