Abstract
En av utfordringene i behandlingen av pasienter med kolorektal kreft er at disse svulstene viser motstand mot stråling. MicroRNAs (mirnas) er involvert i viktige biologiske aktiviteter, inkludert chemoresistance og radioresistance. Flere forskningsstudier har indikert at miRNA spilt en viktig rolle i sensibiliserende cellulær respons for ioniserende stråling (IR). I denne studien fant vi at MIR-124 var signifikant nedregulert både i CRC-avledede cellelinjer og kliniske CRC prøvene sammenlignet med tilstøtende ikke-tumor kolorektal vev, kan MiR-124 bevisstgjøre menneskelige kolorektal kreft celler til IR
i vitro Hotell og
in vivo
. Vi identifiserte PRRX1, en ny EMT induktor og stemness regulator som en roman direkte mål på MIR-124 ved å bruke target prediksjon algoritmer og luciferase assay. PRRX1 knockdown kunne bevisst CRC celler til IR ligner på effekter forårsaket av MIR-124. Overekspresjon av PRRX1 i stabilt overuttrykt-MIR-124 cellelinjer kan redde effekten av Radiosensitivity forbedring brakt av MIR-124. Tar disse observasjonene i betraktning, illustrert vi at MIR-124 kan øke Radiosensitivity av CRC celler ved å blokkere uttrykk for PRRX1, som indikerte MIR-124 kan fungere som en god terapeutisk mål for CRC pasienter
Citation.: Zhang Y, Zheng L, Huang J, Gao F, Lin X, Han L, et al. (2014) MiR-124 Radiosensitizes menneskelige tykktarmskreftceller ved målretting PRRX1. PLoS ONE 9 (4): e93917. doi: 10,1371 /journal.pone.0093917
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 03.01.2014; Godkjent: 11 mars 2014; Publisert: 04.04.2014
Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Scientific Foundation of China (Grant nr 81272507). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje største årsaken til kreft dødsfall [1]. CRC tilfeller behandles gjennom kirurgisk reseksjon som det er den eneste kurative teknikk som er tilgjengelig til dato. Likevel er kolorektal kreft forbundet med høy dødelighet som ca 30% av pasientene diagnostisert når denne kreft har nådd et avansert stadium. Disse pasientene havn en lokalavansert, operabel, ikke-metastatisk sykdom som er betegnet som «lokalavansert endetarmskreft.» Disse pasientene fikk chemoradiation terapi. Ikke desto mindre, på grunn av den iboende evne av tykktarmskreft å bli kjemoresistent og radioresistant (RR) har kombinert modalitet terapi mislyktes i å universelt forbedre resultatene. Det er vanskelig å behandle pasienter med lokal kolorektal kreft fordi disse kreftcellene viser resistens overfor strålebehandling. Dette er en av de mest utfordrende spørsmålene i behandling av tykktarmskreft. Derfor trenger vi å belyse de molekylære mekanismene som ligger til grunn stråling følsomhet eller resistens som dette vil til slutt hjelpe oss med å forbedre terapeutiske resultater.
Tidligere studier har bekreftet en sammenheng mellom radioresistance og uttrykket av gener som induserer DNA-skade sjekkpunkt reaksjon og øker DNA-reparasjon kapasitet [2] – [4]. Selv om slike funn har bedret forståelsen av molekylære mekanismer som påvirker celle Radiosensitivity, er de detaljerte mekanismer som denne prosessen er regulert ikke kjent til dato.
microRNAs (mirnas) er en klasse av små (
~ 22 nukleotider
) ikke-kodende RNA-molekyler som regulerer post-transcriptional genuttrykk. Ved å binde seg med delvis komplementære sekvenser av budbringer-RNA (mRNA), mirnas mål mRNA molekyler for nedbrytning og /eller inhibere translasjon, for derved å redusere ekspresjonen av proteiner [5]. Flere eksperimentelle bevis har antydet at flere menneskelige sykdommer, inkludert kreft er forårsaket på grunn av dereguleringen av miRNAs [6]. Noen mirnas modulerer ekspresjonen av kjente onkogener eller tumorsuppressorgener, mens andre virker som oncomiRNAs eller tumor-suppressor mirnas [7]. Flere mirnas har sammenheng med pasientens overlevelse. Disse mirnas kan være nyttig for å forutsi og modifisere kreft behandlinger (inkludert kjemoterapi, strålebehandling og immunterapi) [8], [9]. I nyere tid har vi oppdaget at mirnas spilt en viktig rolle i cellulær respons for ioniserende stråling [10] – [13].
MiR-124 er en hjerne-beriket miRNA, som er betydelig nedregulert i mange humane maligne tumorer, inkludert glioblastom, gastrisk karsinom, medulloblastom, leverkreft, og CRC [14] – [22]. Nyere studier har vist at MIR-124 radiosensitizes humane glioma celler ved å målrette CDK4 [23]. Imidlertid har funksjonen av MIR-124 på radioresistance blitt neppe forstått til dato.
PRRX1 er en nylig identifisert EMT (epitel-mesenchymale overgang) indus og stemness regulator [24], [25], som begge som er nært knyttet til radioresistence [26]. I tillegg ble rikelig PRRX1 uttrykk korrelert med dårlig prognose og metastase i CRC tilfeller. Videre rikelig uttrykk for PRRX1 var også assosiert med dårlig klinisk utfall [27]. Nyere studier har også vist at PRRX1 spilte en sentral rolle i bukspyttkjertelen regenerering og kreftutvikling [28]. I denne studien viste vi at MIR-124 forbedret følsomhet for stråling, både i CRC-celler og humane xenograft tumorer. Videre er PRRX1 en roman, direkte mål på MIR-124 som induserer bestråling motstand. PRRX1 knockdown kunne bevisst celler til ioniserende stråling. I tillegg vil den overekspresjon av MIR-124 føre til modulering av EMT og stemness-relaterte gener uttrykk, som begge er nært beslektet med radioresistence. Restaureringen av PRRX1 kunne redde effekter forårsaket av MIR-124. I denne forskningsstudien har vi illustrert at MIR-124 lysfølsomt kolorektal kreftceller til strålebehandling i noen grad av downregulating PRRX1. Disse funnene har blitt avdekket for første gang, og dermed illustrerer hvordan MIR-124 spiller en nøkkelrolle i å få celler motstand mot ioniserende stråling.
Materialer og metoder
pasientprøver
Kliniske CRC prøver ble innhentet fra Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, Kina. Pasientene hadde gjennomgått maksimal kirurgisk fjerning etterfulgt av strålebehandling og kjemoterapi. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra de fagene som deltok i denne studien. Vevsprøver ble samlet inn og brukt etter å ha innhentet godkjenning fra etikkomiteen av Nanfang Hospital.
Cellelinjer og reagenser
Menneskelig CRC cellelinjer, inkludert SW480, SW620 og Løvø celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HCT-116, ble LS-174T og HT29 kjøpt fra Shanghai Cell Biology, University of Chinese Academy of Sciences. Celler ble dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) som er supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, CA, USA) i en fuktig fuktig atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C . Annexin V-FITC /7-AAD KIT ble kjøpt fra Beckman Coulter. En full-lengde PRRX1 cDNA som helt manglet 3′-UTR ble kjøpt fra GeneCopeia (Rockville, MD, USA) og subklonet inn i eukaryote ekspresjonsvektor pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, USA). Den pre-MIR-124 sekvensen ble forsterket og klonet inn pCDH-CMV-MCS-EF1-coGFP konstruerer (System biovitenskap, California, USA). Viruspartiklene ble høstet 48 timer etter transfeksjon pCDH-CMV-MIR-124 med emballasjen plasmid pRSV /PREV, pCMV /pVSVG, og pMDLG /pRRE inn i 293T-celler ved hjelp av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, USA). PRRX1 knockdown og kontroll lentiviruses ble kjøpt fra GENECHEM (Shanghai, Kina). MiR-124 etterligne, ble en uspesifikk MIR kontroll, anti-MIR-124, og en ikke-spesifikk anti-Mir kontroll kjøpt fra Thermo Scientific Dharmacon (USA).
RNA isolering, Revers transkripsjon, og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved bruk av TRIzol reagens (Invitrogen, USA). For MIR-124, revers transkripsjon og QRT-PCR reaksjoner ble utført ved hjelp av en qSYBR-grønn-holdige PCR kit (GenePharma, Shanghai, Kina). U6 snRNA ble anvendt som en endogen kontroll. Forløperen form av MIR-124 ble forsterket. For å detektere PRRX1 mRNA, ble cDNA syntetisert fra 1 pg av total RNA ved hjelp av revers transkripsjonsreaksjon sett i overensstemmelse med produsentens instruksjoner (Promega, USA). Humant GAPDH ble amplifisert i parallell som en intern kontroll. Primerne ble oppført i Tilleggs Tabell S1. Alle disse prøvene ble normalisert til intern kontroll og fold endringer ble beregnet gjennom relativ kvantifisering (2-ΔΔCt).
Western Blot analyse
Like mengder protein ble løst ved SDS-PAGE og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Millipore, USA). Membranene ble blokkert i 5% fettfri skummet melk /TBST [20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl og 0,1% Tween-20] ved romtemperatur i 1 time. Deretter ble de påvist med primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Deretter ble de blottet i 1 time ved romtemperatur ved hjelp av et passende sekundært antistoff. Deretter ble forbedret Chemiluminescence gjenkjenning reagenser som brukes (Amersham Pharmacia Biotech, USA). Den primære antistoff PRRX1was kjøpt fra Abcam (UK). Caspase-3, ble BCL-2, andγ-H2AX kjøpt fra Epitomics (UK). E-cadherin, ZO-1, vimentin, N-cadherin ble kjøpt fra Becton, Dickinson and Company (USA). GAPDH ble kjøpt fra BOOSTER (Kina).
Luciferase Assay
full-lengde PRRX1 3′-UTR ble forsterket ved PCR og klonet nedstrøms for ildflue luciferase genet i pGL3 vektor (Promega , USA). Vektoren ble kalt villtype (wt) 3′-UTR. Den GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen, USA) ble anvendt for å utføre seterettet mutagenese av den MIR-124 bindingssete i PRRX1 3′-UTR: den resulterende blanding ble navngitt mutant (mt) 3′-UTR. Disse cellene ble transfektert med plasmider reporter og plasseres i 96-brønners plater. Etter inkubering av cellene i 48 timer, ble cellene høstet og analysert ved anvendelse av dual-luciferase reporter analysesystemet (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner. Luciferase-aktivitet ble normalisert ved β-galaktosidase-aktivitet. Hvert forsøk ble utført in triplo.
klonogene-analysen og Flow Cytometry
et forutbestemt antall celler ble utsådd i 6-brønners kulturplater. Deretter ble de inkubert i 24 timer som bidro i å bosette seg disse cellene. Cellene ble behandlet med en rekke IR doser (0, 2, 4, 6 og 8 Gy, Nasatron (Cs-137) stråle). Etter inkubering av disse cellene ved 37 ° C i 14 dager, ble de vasket to ganger med PBS og farget med krystallfiolett oppløsning. Antallet kolonier som inneholder ≥50 celler, ble tellet under et mikroskop ved hjelp av følgende formel: Plate klon formasjon effektivitet = (antall kolonier /antall celler inokulert) x 100%. Overlevelse fraksjoner (SF) ble beregnet ved normalisering til pletteringseffektiviteten av kontrollgrupper. Vi brukte GraphPad Prism (GraphPad Software, LaJolla, CA, USA) for å passe til celleoverlevelse kurve i henhold til en standard lineær kvadratisk (LQ) modell. Deretter vi erholdt verdiene av overlevelsesfraksjonen av en rekke IR doser. Det er flere viktige parametere i denne modellen som SF2 (overlevende fraksjon på 2 Gy), α (en parameter av DNA-bryter som forårsakes av et sjokk) og β (en parameter av DNA-bryter forårsaket av to støt).
For å detektere celle apoptose, ble cellene høstet og farget ved bruk av 7-AAD og Annexin-V-FITC. Flowcytometri data ble analysert ved hjelp av BD FACS Diva programvare V6.1.3 (BD Biosciences).
Animal Studies
atymiske nakne mus (Guangdong Experimental Animal Center), ble brukt for svulst implantasjon. Disse mus var omtrent 4 til 6 uker gamle. Alle dyreforsøk strengt overholdt forskrift for forvaltning av saker Angå forsøksdyr, den kinesiske nasjonale retningslinjer for dyreforsøk, utstedt i 1988. I denne studien ble alle prosedyrer som involverer dyr og deres omsorg godkjent og utført av Southern Medical University Institutional Animal Care og bruk komité. Cellene ble høstet ved trypsinering og vasket to ganger med kald serumfritt medium. Deretter disse cellene ble resuspendert i 200 ul serumfritt medium. For xenografttumorer assay, 5 x 10
6 SW480-celler ble subkutant injisert i ryggen på nakne mus. Etter at tumorene ble påvist, ble tumorstørrelse målt ved hjelp av en glideskyvelære hver tredje dag. For å evaluere tumor radioresistance
in vivo
, tumorene ble bestrålt med en enkelt dose på 10 Gy IR 11 dager etter injeksjon. Tumorvolumet ble beregnet ved anvendelse av formelen (a x b2) × 0,5, hvor a og b er de lange og korte dimensjoner, henholdsvis. Musene ble avlivet 35 dager etter injeksjon. Deretter ble tumorene fjernet. Hver gruppe inneholdt 5 mus. Disse høstet svulster ble fotografert umiddelbart etter avliving.
Statistical Analysis
Alle verdier er uttrykt i form av gjennomsnittsverdier ± standardavvik. Resultatene ble analysert ved anvendelse av ANOVA eller en to-halet Student t-test.
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
MiR-124 er ofte nedregulert i CRC cellelinjer og vev
Et panel av humane CRC cellelinjer ble kvantitativt analysert for å bestemme ekspresjonsnivået av MIR-124. Sammenlignet med den normale tarmslimhinnen samlet fra tre friske individer, uttrykket nivået av MIR-124 var lavere i de seks undersøkte CRC cellelinjer. (Fig.1A)
(A) MIR-124 ble uttrykt til betydelig lavere nivåer i seks CRC cellelinjer i forhold til normal tarmslimhinnen samlet fra tre friske individer. Figuren er representative for tre forsøk med lignende resultater **
P
. 0,01, *
P
0,05. (B) Ekspresjon av MIR-124 i CRC-vev og de samsvarende normale vev ble påvist ved QRT-PCR og normalisert til den av U6. Data er presentert som enkelte prøver (N = 24) med linjen indikerer gjennomsnittsnivået.
Videre undersøkte vi uttrykket nivået av MIR-124 i CRC prøver og de matchet normalt vev. I henhold til data fra CRC cellelinjer, gjennomsnittlig uttrykk nivået av MIR-124 var betydelig lavere i CRC specimenscampared til tilstøtende normalt vev (Fig.1B)
MiR-124 sensitizes kolorektal kreft celler til strålebehandling
kolonien overlevelse analysen er regnet som en kanonisk standard for å bestemme Radiosensitivity [29]. Så, søkte vi å utforske virkningen av MIR-124 på kolonien overlevelse av CRC-celler i nærvær av ioniserende stråling. De klonogene analyseresultatene bekreftet at overekspresjon av MIR-124 var mye mer følsomme for IR enn sine kolleger (Fig.2A og analytiker Tabell S2). Det er et godt dokumentert faktum at kapasiteten på anti-apoptose av kreftceller er nært forbundet med radioresistance. Videre har vi målt IR-indusert apoptose i CRC celler som ble transfektert med Mir-124 etterligner eller MIR kontroll. Vi har funnet at når kombinasjon med IR, overekspresjon av MIR-124 signifikant forbedret apoptose av celler i CRC-celler enn i kontrollene (Fig.2B). I tillegg observerte vi at MIR-124-behandling alene kan redusere Bcl-2, og effekten var mye sterkere når den kombineres med strålebehandling. På den annen side, caspase-3 og fosforylering av histon H2AX (γ-H2AX) [30], en indikator av den cellulære respons på DNA-skade øker når cellene ble enten behandlet med MIR-124 alene eller utsettes for en kombinert behandling av mir -124 og strålebehandling (Fig.2C). Samlet utgjør disse observasjonene illustrert en synergistisk effekt mellom MIR-124 restaurering og IR.
(A) Løvø og SW480 celler stabilt over-uttrykk for MIR-124 ble behandlet med 0, 2, 4, 6, eller 8Gy av IR. Overlevelses fraksjoner ble beregnet som beskrevet i figur 2A. Resultatene er presentert som gjennomsnitt standardavvik for verdiene oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter. Den statistiske signifikans av forskjeller mellom gruppene ble beregnet ved bruk av Student t-tester. * P 0,05. (B) apoptose analysen viser induksjon av apoptose etter MIR-124 over-uttrykk, spesielt kombinert med stråling i MIR-124-overuttrykt cellelinjer Løvø og SW480. * P 0,05. (C) Representative western blot for virkningen av MIR-124 over-ekspresjon og /eller stråling (4Gy) på ekspresjon av apoptose og DNA-skaderelaterte gener (Caspase-3, Bcl-2 andγ-H2AX).
PRRX1 er en direkte Target av MIR-124
Vi utførte en bioinformatikk analyse ved hjelp TargetScan og Pictar og spådde at MIR-124 kan målrette PRRX1 3’UTR regionen. Faktisk var det perfekt base sammenkobling mellom frø sekvens av modent MIR-124 og 3’UTR av PRRX1 mRNA, og disse frø sekvensene også på tvers av arter (Fig.3A). For å avgjøre om 3’UTR av PRRX1 mRNA er en funksjonell mål av MIR-214 i CRC celler, ble målet sekvens av PRRX1 3’UTR (wt 3’UTR) eller mutant sekvens (mt 3’UTR) klonet inn i en luciferase reporter vektor (Fig.3E). Deretter ble HEK293 celler transfektert med vekt eller mt 3’UTR vektor og Mir-124 etterligner. Resultatene viste en signifikant nedgang i luciferase-aktivitet sammenlignet med kontroll miRNA (Fig.3E, sporene 2 og 3; p 0,05). Aktiviteten til mt 3’UTR vektoren ble ikke påvirket av en samtidig transfeksjon med MIR-124 (Fig.3E, baner 7 og 8) .Hva s mer, kotransfeksjon med anti-miR124 og wt 3’UTR vektor i HEK293-celler førte til en økning av luciferase aktivitet (Fig.3E, baner 4 og 5; P 0,05). PRRX1 uttrykket ble oppdaget av QRT-PCR og Western blot etter module uttrykk for MIR-124 (Fig.3B, 3C, 3D). Til sammen alle disse resultatene indikerer sterkt at PRRX1 er et mål på MIR-124 i CRC celler.
(A) De anslåtte bindende sekvenser for MIR-124 innen den menneskelige PRRX1 3’UTR. Seed sekvenser er uthevet og understreket. (B), (C) og (D) PRRX1 ble bestemt i kolorektal kreft celler stabilt overexpressed-MIR-124 og celler transfektert med MIR-124-hemmere, eller antimiR-con ved real-time PCR og Western blot analyse. ANOVA og Student t-tester ble benyttet for å bestemme den statistiske signifikans av forskjellene mellom gruppene. * P 0,05. (E) luciferaseaktivitet analyser ved anvendelse av et luciferase reporter med villtype eller mutante humane PRRX1 3’UTRs ble utført etter ko-transfeksjon av MIR-124 etterligner eller inhibitorer inn i HEK293-celler. Og mt 3’UTR har en betydelig økning sammenlignet med vekt 3’UTR.The søylediagram viste gjennomsnittlig ± SD i tre uavhengige transfeksjon eksperimenter. * P. 0,05
PRRX1 knockdown overfører Radiosensitivity i CRC cellelinjer
stabile cellelinjer med shRNA -PRRX1 ble etablert. Den PRRX1 protein-ekspresjon i disse cellene ble bekreftet ved western blot-analyse av cellelysatene med spesifikke antistoffer (Fig. 4A). Colony overlevelse Analysen ble utført senere. Det ble funnet at de PRRX1-stilnet, overlevende fraksjoner av cellekolonier minsket mye mer signifikant sammenlignet med kontrollgruppen når de ble bestrålt i forskjellige doser IR (Fig. 4B og supplerende Tabell S3). Apoptose analysen viste at PRRX1 lyddemping kombinert med stråling resulterte i mye mer apoptose enn i tilfeller hvor bare en enkelt behandling ble brukt (Fig.4C), noe som indikerer en synergistisk effekt. Western blot-analyse viste at når kombinert med stråling, PRRX1 stanse forårsaket en betydelig nedregulering av Bcl-2 nivå, men en oppregulering av caspase-3 ekspresjon andγ-H2AX (fig. 4D).
(A ) Western blot analysert PRRX1 forstyrrelser effektivitet i Løvø og SW480 celler (B) kvantifisering av antall dannet fra CRC celler som stabilt ble infisert med tom vektor lentiviruses (kontroll shRNA) og PRRX1-shRNA lentivirus (PRRX1 shRNA) eller uten lentiviral infeksjon ( ubehandlet). (C) Den Annexin V-analyse av apoptose for PRRX1 knockdown-celler sammenlignet med kontrollcellene * p . 0,05. (E) Representant western blot for effekten av PRRX1 knockdown og /eller stråling (4Gy) på uttrykk for apoptose relaterte gener (Caspase-3, BCL-2 andγ-H2AX).
Tvungen uttrykk av PRRX1 Gjenoppretter effektene av MIR-124 på Radiosensitivity
for å belyse hvorvidt effekten av MIR-124 på Radiosensitivity ble formidlet av undertrykkelse av PRRX1 ble pcDNA3.1-PRRX1 transfektert inn i MIR-124-overuttrykt celler. PRRX1 uttrykk ble verifisert av western blot (Fig.5A). Resultatene viste at PRRX1could redde virkningene av MIR-124. Klonogene analyse og celle apoptose antydet at ektopisk uttrykk for PRRX1 betydelig redusert MIR-124-indusert Radiosensitivity (Fig.5B og analytiker TableS4, Figure.5C). Western blot-analyse indikerte også PRRX1 kunne gi ekspresjon av caspase-3 og Bcl-2, som ble utløst av MIR-124 (Fig.5D). Disse observasjonene indikerer at MIR-124 sensibiliserte celler til IR ved downregulating uttrykk for PRRX1.
(A) PRRX1 uttrykk ble oppdaget av western blot etter transfeksjon pcDNA3.1-PRRX1 inn MIR-124-overuttrykt celler. (B) Celler ble fulgt av en behandling som beskrevet i figur 2A. Overlevelses fraksjoner ble beregnet for hver gruppe. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av verdiene som ble oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter. ANOVA eller Student t-tester ble benyttet for å bestemme den statistiske signifikans av forskjellene mellom gruppene. Statistisk signifikans (*
P
0,05) indikeres vs LV-con og MIR-124 gruppen. (C) Representant western blot for effekten av PRRX1 restaurering og /eller stråling (4Gy) på uttrykk for apoptose relaterte gener (caspase-3, BCL-2 andγ-H2AX).
Ektopisk PRRX1 snur uttrykk for EMT og Stemness-relaterte gener i stabilt MIR-124-overuttrykt cellelinjer
i de senere undersøkelser, ble det funnet at PRRX1 induserer EMT og fremmer stemness fenotype i CRC cellelinjer [27]. I nyere undersøkelser, har det blitt rapportert at EMT er assosiert med kreft stamceller. Videre er tapet av E-cadherin og den etterfølgende EMT fremmet radioresistance i humane tumorceller [31] – [33]. Nyere studier har knyttet CSC fenotypen til tumorcellene gjennomgår EMT, som illustrerer det komplekse forholdet mellom EMT og cscs [34] – [40]. Vi lurer på om MIR-124 bringer om denne effekten ved downregulating PRRX1.Thereafter, transfektert vi pcDNA3.1-PRRX1 inn MIR-124-overuttrykt CRC cellelinjer SW480 og Løvø. Western blot analyse viste at PRRX1 kunne reversere uttrykk for EMT og stemness relaterte gener forårsaket av overekspresjon av MIR-124 (figur 6).
Western blot analysert EMT-relaterte gener som E-cadherin, ZO -1, vimentin og N-caherin og stemness relaterte gener som ABCG2, SOX2 og Oct4 i MIR-124-transfekterte celler og MIR-124-PRRX1 kotransfiserte celler sammenlignet med kontrollgruppen. Data foreslått over-uttrykk for MIR-124 kan nedregulerer vimentin, N-cadherin, ABCG2, SOX2 og Oct4 uttrykk og up-regulere E-cadherin, ZO-1 uttrykk, mens over-uttrykk for PRRX1 kan redde denne effekten.
in vivo tumor Xenotransplantat Radiosensitivity analysen
for å finne ut om MIR-124 sensitizes svulster til IR
in vivo
, vi bestråles tumorområdet bare en gang ved hjelp av en dose 10 Gy 11 dager etter injeksjon. Til tross for å motta den samme stråledose (d11,10Gy) (figur 7a, 7b), størrelsen på xenotransplantater avledet fra MIR-124-celler overuttrykt var mye mindre enn det som er avledet fra kontroll behandlede celler. Resultatene indikerte at MIR-124 forårsaket en
in vivo
sensibilisering av svulster for stråling.
(A) Over uttrykk for MIR-124 sensibiliserte SW480 tumorxenotransplantater til IR in vivo. Tumor størrelser ble målt med skyvelære og bestråling ble levert til svulster område på den ellevte dagen (IR: 10Gy, D11). (B) Volum kurver av xenografter generert av LV-con, LV-MIR-124, LV-con + Stråling, LV-MIR-124 + stråling. (
p
0,05).
Diskusjoner
I CRC klinisk ledelse, er en ervervet og iboende radioresistance en utfordrende hinder. Vi trenger å gjennomføre flere undersøkelser for å løse dette utfordrende problem. Kjøpet av radioresistance er en komplisert prosess, med overekspresjon av DNA-reparasjons proteiner [41], [42], avvikende aktivering av flere signalveier [43] – [45], angiogenese [46], [47], kreft stamceller [48], og autophagy [49], [50]. Flere tidligere undersøkelser har vist at mirnas var nært knyttet til tumor Radiosensitivity. Dette er fordi mirnas har evnen til å øke eller redusere radiosensitiviteten av tumorer [8], [23], [51] – [54]. Gitt at mirnas har evnen til å regulere flere onkogene prosesser som respons på terapi, må vi undersøke hvilken rolle mirnas i strålingsmotstand. Motstand mot IR har bidratt til behandling utfordringene pasientene led av CRC. Dermed forstå de molekylære mekanismene bak stråling følsomhet og resistens er fortsatt et viktig jaktstarten.
I denne studien fant vi at MIR-124 ble nedregulert i begge CRC-avledede cellelinjer og kliniske CRC prøver enn normalt vev. For å få et innblikk i funksjon av MIR-124, utførte vi
in vitro
eksperimenter og menneskelige xenograft studier. Disse undersøkelser har vist at overekspresjon av MIR-124 kan radiosensibilisere CRC celler og MIR-124 knockdown indusert celle motstand mot stråling.
Vi identifiserte PRRX1 var et direkte mål på MIR-124 ved luciferase assay. For ytterligere å vise funksjoner PRRX1 på cellen radiosensitiviteten, konstruerte vi stabile PRRX1-knockdown cellelinjer LoVo og SW480 og funnet at PRRX1 knockdown indusert celle følsomhet for bestråling på en måte som er lik den effekt indusert ved overekspresjon av MIR-124. Videre PRRX1 oppregulering reddet effektene av MIR-124-overekspresjon på Radiosensitivity av celler. Disse resultater indikerer at effekten av MIR-124 på celle-sensitivitet overfor bestråling er delvis mediert av undertrykke ekspresjon av PRRX1. Som rapportert tidligere, PRRX1 indusert EMT og forbedret selv fornye egenskaper. Våre resultater tyder på at oppregulering av MIR-124 øker ekspresjonen av epitel-markører som E-cadherin og ZO-1 samtidig redusere ekspresjonen av mesenchymale markører slik som N-cadherin og vimentin. Videre er det opp-regulering av MIR-124 førte til en samtidig nedregulering i ekspresjonen av stemness-relaterte gener, nemlig ABCG2, SOX2, og Oct4. Dessuten kan overekspresjon av PRRX1 redde virkningen av MIR-124 på EMT ved å stanse genetiske endringer. I den senere tid har det blitt rapportert at EMT var assosiert med kreft stamceller. Videre celler som gjennomgår EMT viste større radioresistance i humane tumorceller [26], [31] – [33] ta disse observasjonene i betraktning, sluttes vi at MIR-124 kunne radiosensibilisere CRC-celler ved downregulating PRRX1, som er forbundet med EMT og kreft stamceller. Men alle disse observasjonene må undersøkes nærmere og verifisert gjennom mer forskningsarbeid. Vi undersøkte rollen MIR-124 i å regulere Radiosensitivity, noe som kan ha betydelig innvirkning på kreft biologi og kreftbehandling. Basert på disse observasjonene, hypotese vi at nedregulering av PRRX1 snudd EMT og samtidig svekket selvfornyelse egenskapene til cellene, som begge er nært knyttet til radioresistence.
I konklusjonen, gir vi bevis for at MIR-124 sensitizes CRC celler til strålebehandling ved å hemme PRRX1. Dette indikerer at MIR-124 er en attraktiv prognostisk /prediktiv biomarkør, som kan brukes i diagnostisering av CRC tilfeller. Videre har vi utviklet en ny tilnærming til sensibiliserende radioresistant kreft ved å målrette MIR-124.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Grunning for MIR-124 og PRRX1 kvantifisering
Doi. 10,1371 /journal.pone.0093917.s001 plakater (DOC)
Tabell S2.
Radiosensitivity parametere etter overekspresjon av MIR-124
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0093917.s002 plakater (DOC)
tabell S3.
Radiosensitivity parametere etter PRRX1 knockdown
doi:. 10,1371 /journal.pone.0093917.s003 plakater (DOC)
Tabell S4.
Radiosensitivity parametere etter overekspresjon av PRRX1 i MIR-124-overuttrykt cellelinjer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0093917.s004 plakater (DOC)
