Abstract
Photoimmunotherapy (PIT) av kreft benytter tumor-spesifikke monoklonale antistoffer konjugert til en fotosensibilisator ftalocyanin farvestoff IR700 som blir cytotoksiske ved bestråling med nær infrarødt lys. I denne studien ønsket vi å evaluere effekten av PIT på menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler in vitro og in vivo i en orthotopic naken mus modell. Bindingskapasiteten av anti-CEA-antistoff til BxPC-3 human kreft i bukspyttkjertelen celler ble bestemt ved FACS-analyse. En in vitro cytotoksisitets-analysen ble anvendt for å bestemme celledød etter behandling med PIT. For in vivo bestemmelse av PIT effekt, ble nakne mus orthotopically implantert med BxPC-3 pankreastumorer uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP). Etter tumor-innpoding ble musene delt i to grupper: (1) behandling med anti-CEA-IR700 + 690 nm laser og (2) behandling med 690 nm laser bare. Anti-CEA-IR700 (100 mikrogram) ble administrert til gruppe (1) via halevenen injeksjon 24 timer før behandling. Tumorer ble deretter kirurgisk eksponert og behandlet med fototerapi med en intensitet på 150 mW /cm
2 i 30 minutter. Hele kroppen avbildning ble det deretter i 5 uker ved bruk av en OV-100 små dyr avbildningssystem. Anti-CEA-IR700 antistoff bundet til de BxPC3 cellene i stor grad, som vist ved FACS-analyse. Anti-CEA-IR700 forårsaket omfattende kreftcelle drap etter lysaktivering sammenlignet med kontrollceller i cytotoksisitetsassayer. I ortotopiske modeller av kreft i bukspyttkjertelen, anti-CEA-IR700 gruppen hadde signifikant mindre svulster enn kontrollgruppen etter 5 uker (p 0,001). Det var ingen signifikant forskjell i kroppsvekt av mus i anti-CEA-IR700 og kontrollgrupper som indikerer at PIT ble godt tolerert av mus
Citation. Maawy AA, Hiroshima Y, Zhang Y, Heim R , makings L, Garcia-Guzman M, et al. (2015) i nærheten av Infra-Red Photoimmunotherapy med Anti-CEA-IR700 Resultater i Omfattende tumorlyse og en betydelig reduksjon i tumorbyrde i ortotopiske mus modeller av kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 10 (3): e0121989. doi: 10,1371 /journal.pone.0121989
Academic Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 30 november 2014; Godkjent: 09.02.2015; Publisert: 23 mars 2015
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Cancer Institute CA142669 og CA132971 (til MB og Anticancer cancer~~POS=HEADCOMP, Inc). Anticancer, Inc. og Aspyrian Therapeutics gitt støtte i form av lønn for forfattere YZ, RH, LM, og MG-G, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Robert M. Hoffman er en aksjonær og ikke-lønnet medarbeider av Anticancer cancer~~POS=HEADCOMP, Inc. Yukihiko Hiroshima et ikke-lønnet medarbeider av Anticancer cancer~~POS=HEADCOMP, Inc. George A. Luiken en aksjonær og ikke-lønnet medarbeider av OncoFluor, Inc. forfatterne bekrefte at dette ikke endrer forfatterne etterle- til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Photoimmunotherapy (PIT) bruker tumor spesifikke monoklonale antistoffer som er konjugert til det foto ftalocyanin farvestoff, IR700, som er cytotoksiske ved bestråling med nær-infrarødt (NIR) lys [1-3].
en rekke monoklonale antistoffer (mAbs) har vært brukt med PIT i musemodeller av brystkreft, inkludert trastuzumab, et monoklonalt antistoff (mAb) rettet mot human epidermal vekstfaktor-reseptor-2 (HER-2), og panitumumabs, et monoklonalt antistoff rettet mot human epidermal vekstfaktor-reseptor-1 (HER-1) [ ,,,0],4,5]. Celledød ble indusert umiddelbart etter bestråling mAb-IR700-bundet målceller med NIR lys. In vivo tumorkrymping etter bestråling med NIR-lys ble påvist i målceller som uttrykker epidermal vekstfaktor-reseptor. MAb-konjugater IR700 var effektive når de er bundet til cellemembranen, og fremkalte ingen fototoksisitet når det ikke er bundet, noe som tyder på en annen mekanisme for PIT, sammenlignet med konvensjonelle fotodynamisk terapi [1].
Kreft i bukspyttkjertelen er en dødelig svulst med høy forekomst av lokal og fjernmetastaser [6,7]. I denne studien brukte vi en kimære monoklonalt antistoff mot carcinoembryonic antigen (CEA) for PIT, som ofte overuttrykt i kreft i bukspyttkjertelen og har tidligere vært benyttet av vårt laboratorium for fluorescens styrt kirurgi og fluorescens laparoskopi [8-17]. Den anti-CEA antistoff ble konjugert til IR700 og brukes til PIT behandling av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen i ortotopiske musemodeller samt kreft i bukspyttkjertelen celler in vitro.
Materialer og metoder
Cell Culture
Den menneskelige kreft i bukspyttkjertelen cellelinje BxPC-3 ble stabilt omformet til å uttrykke grønne fluorescerende protein (GFP) som tidligere beskrevet [18,19]. Celler ble opprettholdt i RPMI 1640-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT), penicillin /streptomycin (Gibco-BRL, Carlsbad, CA), natriumpyruvat (Gibco-BRL), natriumbikarbonat (Cellgro, Manassas, VA), L-glutamin (Gibco-BRL), og minimale essensielle medium ikke-essensielle aminosyrer (Gibco-BRL). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator.
Bestemmelse av CEA antigen ekspresjonsnivået
BxPC-3-GFP-celler fra en 75 cm
2 kolbe ble høstet med enzym-fri celledissosiasjon buffer, vasket en gang med inkuberingsbuffer (PBS + 0,5% FBS + 0,1% natriumazid), og gjenfunnet i inkubasjonsbuffer ved 2 x 10
6 celler /ml og holdt ved 4 ° C. Cellene (5 x 10
5) ble inkubert med kimære anti-CEA-antistoff (Genara Biosciences LLC, Morgan Hill, CA) (10 ug /ml) i 300 ul inkubasjonsbuffer i 1 time ved 4 ° C, vasket tre ganger med PBS og farget med en Alexa488-konjugert esel antihuman IgG (H + L) antistoff (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) i 45 minutter, etterfulgt av tre vaskinger med PBS. En kontroll uten anti-CEA ble fremstilt i parallell. Flowcytometri profiler fra de anti-CEA antistoff-behandlede celler og ubehandlede celler ble etablert på en Guava EasyCyte Plus flowcytometer (EMD Millipore, Billerica, MA). Antistoffet bindingskapasitet for anti-CEA ble bestemt ved hjelp av referanse perler (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN) og geometrisk gjennomsnitt i henhold til produsentens protokoll.
Dyr
athymiske nu /nu nakne mus (Anticancer cancer~~POS=HEADCOMP Inc., San Diego, CA), 4-6 uker gamle, ble anvendt i denne studien. Mus ble oppbevart i en barriere anlegg under HEPA filtrering. Mus ble matet med en Autoclaved laboratorium gnagerdiett. Alle mus kirurgiske prosedyrer og avbildning ble utført med dyrene bedøvet ved intramuskulær injeksjon av ketamin 50%, 38% xylazin, og 12% acepromazin maleat (0,02 ml). Dyr mottok buprenorfin (0,10 mg /kg ip) umiddelbart før operasjonen og en gang om dagen i løpet av de neste 3 dager for å lindre smerte. CO
2 inhalering ble brukt for avliving av alle dyrene på 5 uker etter operasjonen. For å sikre død etter CO
2 kvelning, ble halshugging utført. Alle dyrestudier ble gjennomført med en anticancer, -protocol Inc. Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) spesielt godkjent for denne studien og i samsvar med de prinsipper og prosedyrer som er skissert i National Institute of Health Guide for omsorg og bruk av dyr henhold Assurance Antall A3873-1.
antistoff-Dye Bøyning
En vannløselig silikon-phthalocyanine derivat, IRDye 700DX NHS ester ble hentet fra LI-COR Biovitenskap (Lincoln, Nebraska). chimerisk anti-CEA-antistoff (Genara Biosciences LLC) (2 mg [~ 14 nmol]) ved en konsentrasjon på 2 mg /ml i 0,1 M Na
2HPO
4 (pH = 8,6) ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur med IR700dye NHS-ester (135 ug, 70 nmol) fremstilt i vannfritt DMSO ved 5 mmol /l. Etter inkubasjonsperioden, den IR700-konjugatet var buffer utvekslet og renset med fosfatbuffer saltvann (PBS, pH = 7,1) ved anvendelse av Amicon ultra sentrifugalfilter enheter (EMD Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts). Den IR700-mAb-konjugat ble gjentatte ganger fortynnet med 10 ml volumer av PBS og ble deretter konsentrert ved hjelp av filterenhetene til mindre enn 2% av det ukonjugerte IR700 fargestoff arter forble, som bestemt ved størrelseseksklusjons-HPLC (SE-HPLC). Analyse av konjugatene av SE-HPLC ble utført ved anvendelse av et Agilent 1100 HPLC-system utstyrt med en TSKgel G2000SWxl kolonne (Tosoh Biosciences, Tokyo, Japan). SE-HPLC-eluering buffer var 1 x PBS (pH = 7,1) med en strømningshastighet på 1 ml /min. UV /Vis påvisning ved 280 nm og 690 nm ble anvendt for å bestemme den gjennomsnittlige fargestoff-til-antistoff-forhold (DAR) for hver konjugater. Med denne prøven, ble en renhet på 97,6% med 0,5% gratis fargestoff og en DAR på 4,1 oppnådd.
Tumor implantasjon
Etter Confluence, BxPC-3-GFP menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler (en x 10
6) ble injisert subkutant inn i flankene av nakne mus og tillatt å innpode og vokse over en periode på 4-6 uker. Svulster ble deretter høstet og tumorfragmenter (1 mm
3) fra subkutane tumorer ble suturert til halen i bukspyttkjertelen ved hjelp 8-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon, Ethicon Inc., Somerville, NJ). Ved fullføring ble returnert halen av bukspyttkjertelen til magen, og snittet ble lukket i ett lag ved hjelp av 6-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon) [20,21]. Tumorfragmenter ble tillatt å vokse i løpet av en periode på 2 uker.
Cytotoksisitetsdata studier
BxPC-3-celler ble sådd ut i white-vegg 96-brønners plater (4000 /brønn) og fikk feste natten. Celler ble inkubert med antistoff-konjugat, anti-CEA-IR700, (fargestoff-antistoff-forhold på 5,1) ved 10 mg /ml i 2 timer ved 37 ° C. Fire brønner på en gang ble underkastet behandling med 690 nm lys fra en lysdiode (Marubeni Corporation, Tokyo, Japan) ved en effekttetthet på 50 mW /cm
2 som ble kalibrert med en kraftmåler utstyrt med en fotodiode kraftsensor (Thorlabs Inc., Newton, NJ). Etter lysbehandling, ble antistoffløsningen erstattet med fullstendig RPMI 1640 medium inneholdende CytoTox Grønn (Promega, Madison, WI) for å overvåke celledreping.
Photoimmunotherapy in vivo
Anti-CEA antistoff ( 100 ug) (Genara Biosciences LLC, Morgan Hill, CA) konjugert til IR700DX rekonstituert til 100 ul ble injisert via halevenen i behandlingsgruppen 24 timer før inngrep, mens kontrollgruppen hadde 100 ul PBS på lignende måte injisert 24 timer før injeksjonen . Hver gruppe besto av 10 mus med ortotopiske BxPC-3-GFP tumorer.
Etter 24 timer, de pankreatiske tumorer i alle 10 mus i behandlingsgruppen ble eksponert gjennom en venstre lateral snitt og avbildes for å detektere både GFP signal og 700 nm signalet. Alle musene ble deretter underkastet photoimmunotherapy ved å eksponere tumor til en 690 nm laser på 150 mW /cm2 i 30 minutter for en total på 270 J /cm2. De omkringliggende normalt vev ble beskyttet med aluminiumsfolie under PIT. Mus ble fotografert ved tidspunktet for behandlingen, og deretter ukentlig med tumor utsatt for å evaluere respons på behandling. Etter 5 uker ble musene avlivet, noe som medførte at de ble fotografert og hadde sine svulster resected og veies.
Animal Imaging
Mus ble fotografert ukentlig bruker Olympus OV100 små dyr bildesystem (Olympus Corp. Tokyo, Japan), inneholdende en MT-20 lyskilde (Olympus Biosystems Planegg, Tyskland) og DP70 CCD-kamera (Olympus Corp. Tokyo, Japan) [22]. Alle bildene ble analysert ved hjelp av Image-J (National Institute of Health Bethesda, MD) og ble behandlet med bruk av Photoshop Elements-11 (Adobe Systems Inc. San Jose, California).
Tumor størrelse besluttsomhet
musene i begge gruppene hadde ukentlig laparotomi å avsløre pankreastumorer via en venstre lateral snitt. Tumorer ble fotografert med OV-100 ved GFP uttrykk. Tumorstørrelse ble vurdert ved hjelp av Image-J programvare (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).
Statistical Analysis
All statistisk analyse ble gjort ved hjelp av SPSS programvareversjon 21 (IBM, Armonk, NY ). For parvise sammenligninger ble kvantitative variabler beregnet ved bruk av parvise prøver t-test og bekreftet med Wilcoxon rank-sum test. En p-verdi ≤0.05 ble betraktet som signifikant. 95% konfidensintervall oppnås på analyse av dataene ble konfigurert til feil barer av de aktuelle tall og grafer.
Diskusjon
Anti-CEA-IR700 binder til
Resultater og CEA-uttrykke kreft i bukspyttkjertelen celler in vitro og forårsaker omfattende celledød etter lys-aktivering sammenlignet med kontroll
anti-CEA-antistoff bindingskapasitet til BxPC3 humane kreft i bukspyttkjertelen celler var 2,227,000 bindingsseter per celle ved FACS-analyse (fig. 1). Celler ble inkubert med anti-CEA-IR700 og behandlet med 690 nm lys. Ved slutten av inkuberingen, var 100% celledød i anti-CEA IR700 + 690 nm lys gruppe sammenlignet med en ubetydelig mengde av celledød i no-690 nm lys gruppe (Fig. 2). Død av 690 nm lys-behandlede celler i fravær av Anti-CEA-IR700 var ubetydelig (data ikke vist).
BxPC-3-celler ble behandlet med anti-CEA antistoff og farget med en fluorokromkonjugerte konjugert sekundært antistoff mot anti-CEA (rød, fylt), eller kontroll-farget med sekundært antistoff bare (svart, åpen) og analysert ved flowcytometri. Gating var for hoved befolkningen (A). Den anti-CEA-antistoff bindingskapasitet, bestemt med referanse perler, var svært høy (2,227,000 bindingsseter per celle) (B).
BxPC-3-celler ble inkubert med anti-CEA-IR700 konjugat ( 10 ug /ml). Hurtig celledreping ble observert med en dose på 32 J /cm
2 av 690 nm nær-infrarødt lys (blå sirkler), mens bare lite celledreping skjedd uten belysning (grønne trekanter). Døden i lys-behandlede celler i fravær av anti-CEA-IR700 var ubetydelig (data ikke vist).
PIT resulterer i en betydelig reduksjon i tumorstørrelse og vekt i en orthotopic musemodell for bukspyttkjertel kreft
To uker etter ortotopisk implantasjon av BxPC-3-GFP tumorer, innpoding var sikret, og musene ble oppdelt i 2 grupper med behandlingsgruppen mottok anti-CEA-IR700-konjugat (100 ug) og kontrollgruppen mottaker PBS (fig. 3). Tumorstørrelse ble vurdert på en ukentlig basis for å evaluere effekten av behandlingen og generelle forskjeller i progresjon. I kontrollgruppen var det en innledende eksponentiell økning i tumorstørrelse som begynte å flate ut i uke 4 oppnå maksimalt gjennomsnitt på 390,7 mm
2 (95% KI [
