Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen har en 5-års overlevelse på mindre enn 4%. Til tross for fremskritt innen diagnostisk teknologi, fortsetter kreft i bukspyttkjertelen for å bli diagnostisert på et sent og uhelbredelig stadium. Nøyaktig biomarkører for tidlig diagnose og å forutsi behandlingsrespons er sterkt behov. Siden endring av glukosemetabolismen er en av kjennetegnene til kreftceller, foreslo vi at pyruvat kinase typen M2 (M2PK) og laktat dehydrogenase A (LDHA) enzymer kan representere nye diagnostiske markører og potensielle terapeutiske mål i bukspyttkjertelkreft. I 266 vevssnitt fra normal bukspyttkjertelen, bukspyttkjertel cystisk svulster, bukspyttkjertel intraepitelial neoplasi (Panin) og kreft, vurderte vi uttrykk for PKM2, LDHA, Ki-67 og CD8 + ved immunhistokjemi og korrelert disse markørene med clinicopathological egenskaper og pasient overlevelse. PKM2 og LDHA uttrykk ble også vurdert ved Western blot i 10 menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. PKM2 uttrykk økt gradvis fra cyste gjennom Panin til kreft, mens LDHA ble overuttrykt i hele kreftfremkallende prosessen. Alle bortsett fra en cellelinje som viste høy ekspresjon av begge proteiner. Pasienter med sterk PKM2 og LDHA uttrykk hadde signifikant lavere overlevelse enn de med svake PKM2 og /eller LDHA uttrykk (7,0 måneder versus 27,9 måneder, henholdsvis p = 0,003, log rank test). Uttrykket av både PKM2 og LDHA korrelert direkte med Ki-67 uttrykk, og omvendt med intratumoral CD8 + celletall. PKM2 ble betydelig overuttrykt i dårlig differensierte svulster og både PKM2 og LDHA ble overexpressed i større svulster. Multivariabel analyse viste at kombinert uttrykk for PKM2 og LDHA var en uavhengig dårlig prognostisk markør for å overleve. I konklusjonen, våre resultater viser et høyt uttrykk mønster av to store glykolytiske enzymer i bukspyttkjertelen carcinogenesen, med økt uttrykk i aggressive svulster og en vesentlig negativ effekt på overlevelse
Citation. Mohammad GH, Olde Damink SWM, Malago M , Dhar DK, Pereira SP (2016) pyruvatkinasepåviser M2 og laktatdehydrogenase En Er overexpressed i kreft i bukspyttkjertelen og Correlate med dårlig resultat. PLoS ONE 11 (3): e0151635. doi: 10,1371 /journal.pone.0151635
Redaktør: Michael Muders, Universitetssykehuset Carl Gustav Carus Dresden, Tyskland
mottatt: 05.08.2015; Godkjent: 02.03.2016; Publisert: 18 mars 2016
Copyright: © 2016 Mohammad et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av bukspyttkjertelen Cancer Research Fund, The Jason Boas Foundation, NIH stipend P01 CA084203 og UCLH /UCL Omfattende Biomedical Centre, som mottar en andel av midler fra Department of Health National Institute for Health forskning (NIHR) Biomedical Research Centres støtteordning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av de vanligste gastrointestinale kreftformer og den fjerde vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i verden [1]. Kirurgisk reseksjon er den mest effektive behandlingen, men pasientene er vanligvis diagnostisert på et avansert stadium når kirurgisk fjerning er ikke gjennomførbart, noe som resulterer i en fem års overlevelse på mindre enn 4% [2]. Det er få andre effektive behandlinger, med palliativ mono eller kombinasjonskjemoterapi som den viktigste behandlingsalternativ for pasienter med avansert sykdom [3,4].
Aerobic glykolysen er et kjennetegn på kreftceller, med produksjon av laktat selv i nærvær av rikelig mengder oksygen, et fenomen kjent som Warburg virkning [5-7]. En viktig fordel med øket glykolyse i kreftceller er produksjon av energi uten forbruk av oksygen og glykolytiske mellomprodukter, slik som aminosyrer, nukleotider, fosfolipider og triglycerider, som brukes som makromolekyler for syntesen av strukturelle elementer av nye celler [5, 6,8,9].
pyruvat-kinase (PK) er en tett regulert glykolytisk enzym som katalyserer det siste trinnet i glykolysen og formidler overføringen av fosfat fra fosfoenolpyruvat (PEP) til adenosin-difosfat (ADP) til å produsere pyruvat og energi (ATP) [10-12]. PK har fire forskjellige isoenzymer PKM1, PKM2, PKL og PKR, hvis ekspresjon avhenger av metabolsk respons av celler. Både L og M genene koder PK isoenzymer. Den L-genet koder både L og R-PK isoenzymer, mens M-genet koder både M1 og M2 isoenzymer (PKM2) [13-17]. Under tumorgenese, ekspresjonen av spesifikke PK isoenzymer, for eksempel PK-M1 i hjernen og PK-L i leveren, forsvinner og PKM2 uttrykk dominerer [18]. PKM2 uttrykk kan oscillere mellom den meget aktive tetra isoformen og den nesten inaktive dimerisk isoform, avhengig av den cellulære etterspørselen av energi eller produksjon av anabolske mellomprodukter for celleproliferasjon. Den tetramerisk isoform av PKM2 hovedsakelig uttrykt i normale celler, mens dimer isoform er vanligvis funnet i kreftceller, derav navnet svulst PKM2 [11,14,19].
En annen nedstrøms komponent i glykolysen er den laktatdehydrogenase A (LDHA) enzym, som er en del av LDH familien av 2-hydroksysyre oksidoreduktaser. LDHs er homo- og hetero- tetramer enzymer som består av to store subenheter, A og B, noe som resulterer i fem isoenzymer som katalyserer den reversible omdannelse av pyruvat og laktat. LDHA (også kjent som LDH-5, LDH-M eller A4) er kodet av
LDH-en
genet og dominerer i skjelettmuskulatur og lever, mens LDHB (også kjent som LDH-en, LDH-H eller B4) er kodet av
LDH-b
genet og finnes hovedsakelig i hjertet og hjernen [20-24]. LDH-C består hovedsakelig av X-subenheter og er funnet i menneskelige sædceller [22,25]. LDHA katalyserer omdannelsen av pyruvat til laktat med regenerering av NAD
+ for å fortsette energiproduksjon ved glykolyse [26-29]. Laktat produsert av LDHA benyttes som et alternativt drivstoff av celler som er tilstøtende til blodårer, og glukose er spart for mer fjernt celler som er hypoksiske.
Overekspresjon av PKM2 eller LDHA har blitt rapportert i vevet i en rekke kreftformer, inkludert kolangiokarsinom, tykktarmskreft, ikke-småcellet lungekreft og kreft i bukspyttkjertelen. Overekspresjon er assosiert med startfasen, progresjon og motstand mot kjemoterapi [27,30-32]. I teorien kan uttrykket profilen til disse enzymene også representere nyttige diagnostiske eller prognostiske markører i bukspyttkjertelkreft [15,23,33].
CD8 + T-celler (cytotoksiske T-lymfocytter) er en viktig undergruppe av tumor infiltrerende lymfocytter som spiller en nøkkelrolle i anti-tumor immunrespons. Immunhistokjemi studier har vist en anti-tumor effekt av infiltrerende CD8 + lymfocytter, med bedre overlevelse hos pasienter med bukspyttkjertel, lunge, eggstokkreft, tykktarms, nyre- og øsofagus svulster [34-39], og en direkte sammenheng mellom økende antall CD8 + tumor infiltrerer lymfocytter (Tīlss) og tumor celle apoptose [40,41].
Målet med vår studie var å evaluere uttrykk for PKM2 og LDHA i bukspyttkjertelen pre-neoplastiske lesjoner (cyster og pancreatic intraepitelial neoplasi, Panin) og kreft og å relatere det med pasienten utfallet. Gitt at PKM2 og LDHA er involvert i flere celleformering signalveier [42], vi også undersøkt hvorvidt ekspresjonen av disse glykolytiske enzymer korrelert med antall CD8 + Tīls og markører for tumor proliferasjon (Ki-67).
Materialer og metoder
pasienter
Denne studien inkluderte bukspyttkjertel biopsi eller kirurgisk fjerning prøver fra 266 pasienter; 136 fra University College London Hospital NHS Foundation Trust (UCLH) og en annen 130 fra en kommersielt tilgjengelig vev microarray (TMA) (AccuMaxArray, ISU ABXIS CO., LTD, USA, og Insight Bioteknologi Limited, UK). Den UCLH kohorten besto av 136 pasienter med bekreftet bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDAC) (n = 61), ampullary adenokarsinom (n = 11), bukspyttkjertelen cystisk lesjoner (n = 49), kronisk pankreatitt (n = 11) og normal bukspyttkjertelen vev ( n = 4). Disse pasientene hadde blitt behandlet på UCLH mellom januar 2005 og januar 2010. En klinisk database over UCLH pasientene ble skapt gjennom CoPath histologi database, som omfattet følgende clinicopathological parametere: kjønn, alder diagnose, prøvetype (biopsi eller reseksjon), type svulst (ampullary eller ductal), utfall (levende eller døde), dødsårsak, lengde på oppfølging hvis live, tilstedeværelse eller fravær av metastatisk sykdom ved histologisk diagnose, enten reseksjon ble utført, restsykdom ( R) status, post-reseksjon tilbakefall, tid til å poste-reseksjon tilbakefall (hvis noen), kreft stadium, spredning til lymfeknuter, tilstedeværelse av perinevral eller lymphovascular invasjon, graden av tumor differensiering, og om pasienter fikk kjemoterapi (tabell 1). Alle data ble samlet fra datoen for histologisk diagnose til datoen for død eller slutten av datainnsamling 1. februar 2015. Etikk komité godkjenning er innhentet fra det sentrale London REC tre forskningsetiske komité for å utføre immunhistokjemi på lagrede biopsi og reseksjon prøver knyttet med en klinisk database med behovet for samtykke fravikes (REC referanse 06 /Q0512 /106, endringstidspunktet 30 juli 2010). Alle pasientprøver ble anonymisert og avidentifisert før analysen.
Tissue microarray
Et annet validering sett 130 vevsprøver ble avledet fra kommersielt tilgjengelig bukspyttkjertelen TMA. Totalt 206 vev kjerner fra 130 pasienter (83 menn, 47 kvinner, median alder 59, range 32-80 år) var tilstede på TMA, som omfattet 63 tilfeller av PDAC i duplikat, 19 Panin (10 Panin-1, 7 Panins-2 og 2 Panins-3), 10 kronisk pankreatitt og 38 normale kjerner pankreatiske vev. Histologisk diagnose av alle tilfeller ble bekreftet ved hematoksylin og eosin-farging. Kliniske data som følger med TMA inkludert tumorstørrelse og scene, graden av tumor differensiering, spredning til lymfeknuter, metastatisk status og kreft nettsider.
Immunohistochemistry
Standard immunhistokjemi metoder ble brukt for å påvise uttrykk av PKM2, LDHA, CD8 og Ki-67. I korthet, parafin innebygde seksjoner ble forvarmet i en ovn i 30 minutter ved 60 ° C, og deretter deparaffinised i xylen og hydrert gjennom en serie av gradert etanol (70% -95%). Seksjonene ble utsatt for varme-mediert antigen gjenfinning med citratbuffer (pH 4,0) i en autoklav. Endogen peroksidase-aktivitet ble inhibert med 3% hydrogenperoksid i 20 minutter, etterfulgt av inkubasjon med 2,5% normalt hesteserum blokkering i 20 minutter. Snittene ble deretter inkubert med primært antistoff i en time ved romtemperatur i CD8 (CD8A Kanin polyklonalt antistoff, Abnova, Storbritannia, Cat # PAB11235, 1: 200) og Ki-67 (kanin polyklonalt til Ki-67, Abcam, Storbritannia, Cat # ab15580, 1: 300), og over natten ved 4 ° C i PKM2 (monoklonale mus anti-human og rotte PKM2, ScheBo®Biotech, Giessen, Tyskland, Cat # S-1, 1: 100) og LDHA (LDHA /LDHC (C28H7) Rabbit monoklonalt antistoff, Cell Signaling, UK, Cat # 3558, 1: 250) i PBS. Etter tre vaskinger med PBS inneholdende 0,5% Tween 20, ble seksjonene inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff i 30 minutter. Primært antistoff ble påvist ved hjelp av 3, 3′-diaminobenzidin (DAB) eller 3-amino-9-etyl-karbazol (AEC) detection system kit. Seksjonene ble plassert i haematoxylin i 3 minutter, deretter forsiktig vasket og montert.
Double immunhistokjemi
En dobbel farging kit (bildet dobbeltfarging kit, Invitrogen, UK) ble brukt for samlokalisering av PKM2 og CD8 eller Ki-67. Kort beskrevet, ble to forskjellige enzym-deteksjonssystemer som brukes for sekvensiell dobbel farging med førstegangs bruk av pepperrot peroksidase-systemet etterfulgt av alkalisk fosfat-systemet. Seksjoner ble inkubert med anti-PKM2 primært antistoff og HRP-sekundært antistoff, og visualisering ble utviklet med DAB deteksjonssystemet. Etter dette trinnet ble snittene vasket med PBS, inkubert med blokkerende serum, etterfulgt av primære antistoff (anti-CD8 eller Ki-67) og geit anti-kanin IgG-alkalisk fosfatase sekundært antistoff. Farge ble utviklet av rask rød med telleren farging av haematoxylin.
Evaluering av immunhistokjemi flekker
Immunohistochemistry ble evaluert med en konferanse lysmikroskop (AXIO Scope, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen, Tyskland). Vurderingen av De immun lysbilder ble utført uavhengig av to observatører, blindet for pasientens bakgrunnsinformasjon, og eventuelle misforhold mellom observatørene ble løst ved hjelp av en konferanse mikroskop. En omfattende scoring formel ble anvendt for semikvantitativ evaluering av PKM2 uttrykk som tidligere beskrevet [43], med intensiteten av fargingen mottok som: 1, svak ekspresjon; 2, moderat uttrykk; eller tre, sterkt uttrykk; graden av farging scoret som en, 33% av tumorcellene positive; 2, 33-67% av tumorcellene positive eller; 3, 67% av tumorcellene positive. Intensiteten og omfang score ble deretter multiplisert for å oppnå en enkelt skala fra score på 1, 2, 3, 4, 6 og 9. De score til 1-3 ble definert som svak (eller negative) flekker, mens score 4, 6 og ni ble ansett som sterk (eller positive) farging.
antallet CD8 + Tīlss og Ki-67 positive tumorceller ble også telles uavhengig av to observatører. I første omgang ble det hele lysbildet skannes ved lav forstørrelse (x40) for å identifisere den regionen med høyest tetthet av intratumoural CD8 eller Ki-67-positive tumorceller og deretter fem tilfeldige områder innenfor den regionen ble telt ved høy forstørrelse (x400). Det gjennomsnittlige antall CD8 + Tīls ble beregnet og uttrykt som tall pr høy effekt felt (HPF). Den celleproliferasjon indeksen (PI) ble uttrykt som en prosentandel av antallet kjerner farget positivt for Ki-67 mellom 1000 tumorceller ved hjelp av en standardisert gitter.
Cellekulturer
Ni human bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble kjøpt fra Riken Bioresource Centre (Riken BRC, Tsukuba, Japan) og BxPc-tre cellelinje ble kjøpt fra PerknElmer (Caliper Lifesciences, Hopkinton, MA, USA). PANC-en, PK-en, PK-59, ble PK-45H, PK45P, KLM-en, NOR-P1 og BxPc-3 opprettholdt i RPMI-1640, Miapaca-2 i DMED og KP-4 i DMEM /F12 medium . Alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin /streptomycin og 2 mM glutamin (Gibco, Life Technologies, UK). Celler ble holdt i en fuktig atmosfære med 21% O
2, 5% CO
2 ved 37 ° C og høstet med trypsin-EDTA.
Western Blot
PKM2 og LDHA uttrykk ble evaluert i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ved Western blotting. I korthet følgende proteinekstraksjon, ble proteinkonsentrasjonen målt ved Bicinchoninic Acid (BCA) analyse og 15μg protein ble kjørt på en forhåndsstøpt gel (Novex NuPAGE 4-12% Bis-Tris 1,0 mm, 10 brønner gel, Invitrogen, USA) og overført til en 0,45 um porestørrelse Polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Invitrogen, USA). Membranen ble blokkert med 5% bovint serumalbumin (BSA) løsning og inkubert over natten ved 4 ° C, enten med mus anti-PKM2 (DF-4, ScheBo®Biotech, Giessen, Tyskland, 1: 1000) eller kanin-anti-antistoff LDHA (Cell Signaling, Storbritannia, 1: 1000), og deretter inkubert med passende pepperrot peroksidase konjugert sekundært antistoff (Cell Signaling, UK, 1: 2000). Den antigen-antistoff reaksjon ble påvist ved forsterket kjemiluminescens substrat (Thermo Scientific, USA). Anti-β aktin antistoff (Cell Signaling, UK) ble brukt som et protein lasting kontroll.
Statistisk analyse
IBM SPSS Statistisk programvare (versjon 22, SPSS Inc., Chicago, IL, USA ) ble anvendt for dataanalyse og grafikk. Kaplan-Meier plott og log-rank tester ble brukt til å analysere overlevelse og for å identifisere forskjeller mellom gruppene. En måte ANOVA med Bonferroni post-hoc test ble brukt for generell sammenligning av flere grupper, med Mann-Whitney U-test for metriske tester og Chi kvadrat-test for forskjeller mellom kategoriske data. Ikke-parametrisk korrelasjonsanalyser mellom to kontinuerlige variabler ble utført av Spearman test. Alle testresultater var to-tailed, med effekter oppsummert ved hjelp av 95% konfidensintervall. Statistisk signifikans ble satt til p. 0,05
Resultater
Uttrykk for PKM2 og LDHA i bukspyttkjertelkreft
Både PKM2 og LDHA ble overexpressed i tumorceller sammenlignet med vanlig bukspyttkjertelen vev . En variabel uttrykk mønster av PKM2 ble observert i tumorvev, med relativt høyere uttrykk i dårlig differensierte områder, i å fremme marginer på tumornoduler og i invasiv (muskel- og blodkar) svulster (fig 1A, 1B, 1E og 1F). Totalt sett PKM2 uttrykk var hovedsakelig forbundet med aggressive svulster. Fortrinnsrett uttrykk for PKM2 ble observert i binucleated prolifererende celler i tumornoduler (fig 1D). Ekspresjon av PKM2 ble notert i alle cellekamre, inkludert cellemembranen, cytoplasma og /eller kjernen (figur 1C og 1F). I motsetning til dette, LDHA ekspresjon var generelt høy i tumor så vel som i preneoplastiske vev og pankreatitt uten et bestemt mønster (figur 2). LDHA ekspresjon ble også påvist i cellemembranen og /eller cytoplasma og av og til i kjernen.
(A) godt differensiert område av tumor som viser svak PKM2 uttrykket (rød pil), med høy ekspresjon i dårlig differensierte områder ( brun farge, gul pil) (x100 forstørrelse). (B) Økende margin på tumornoduler med sterke uttrykk for PKM2 (rød pil) (x100 forstørrelse). (C) Membranous uttrykk for PKM2 (rød pil) (x200 forstørrelse). (D) heterogene uttrykk for PKM2 med dominerende uttrykk i prolifererende celler (rød pil) (x200 forstørrelse). (E) Sterkt positiv tumor uttrykk for PKM2 i vaskulær invasjon (rød pil) (x100 forstørrelse). (F) Sterkt positiv tumor uttrykk for PKM2 med muskel invasjon (rød pil) (x100 forstørrelse).
(A) Membranous uttrykk for LDHA (x200 forstørrelse). (B) Cytoplasmatiske og kjernekraft uttrykk (x200 forstørrelse). (C) Sterk ekspresjon i pankreas cyste med mild uttrykk i det omgivende normale vev bukspyttkjertelen (x50 forstørrelse). (D) Nuclear uttrykk for LDHA i bukspyttkjertelkreft (x100 forstørrelse). (E) Sterk uttrykk i Panin lesjon (x100 forstørrelse). . (F) Negativ farging i normal bukspyttkjertelen (x100 forstørrelse)
I likhet uttrykk for PKM2 og LDHA ble observert i UCLH kohort og TMA prøver, med en farge score på 3 i 64% og 73% av tumorer, henholdsvis for PKM2, og i 76% av tumorer for LDHA i begge kullene. Uttrykket mønster i bukspyttkjertelkreft cellelinjene var lik for både PKM2 og LDHA, bortsett fra i den KP4 cellelinje hvori LDHA nivå var sterkere enn PKM2 nivå (figur 3). I begge kohorter, pankreatitt prøver også sterkt uttrykt LDHA sammenlignet med PKM2 uttrykk (fig 4).
Farging av Miapaca-2 celler med PKM2 (A) og LDHA (B) vises i nedre panel. Sterk cytoplasma og kjernekraft farging er nevnt i prolifererende celler
PKM2 var sterkt uttrykt av bukspyttkjertelkreft vevsprøver og var betydelig høyere enn i normal, pankreatitt, bukspyttkjertel cyste og Panin vev (P 0,001).. Uttrykk for LDHA var signifikant høyere i bukspyttkjertelkreft enn i normal bukspyttkjertel (P 0,001)., Mens det var ingen signifikante forskjeller i LDHA uttrykk mellom kreft i bukspyttkjertelen, Panin, bukspyttkjertelen cyster og pankreatitt
Som vist i figur 4, ble progressivt høyere PKM2 ekspresjon observert langs overgangen til kreft i bukspyttkjertelen, med det laveste ekspresjon i pankreas cyster (19%), mellomprodukt i Panins (37%) og høyest i cancere (68%). PKM2 uttrykk var omtrent fire ganger høyere i pankreatitt (29%) sammenlignet med vanlig bukspyttkjertelen vev. Selv LDHA uttrykket ble også betydelig økt i kreft sammenlignet med vanlig bukspyttkjertelen vev (p 0,0001, ANOVA), var det ingen signifikante forskjeller mellom kronisk pankreatitt, bukspyttkjertel cyster, Panin og kreft prøver (67%, 59%, 73% og 76 %, henholdsvis).
PKM2 og LDHA uttrykk i bukspyttkjertelen kreftcellelinjer
etter Western blotting, høy uttrykk for PKM2 og LDHA ble påvist i åtte og ni av de 10 bukspyttkjertelkreft cellelinjer (fig 3). Ekspresjonsnivået av PKM2 og LDHA tilsvarte i alle cellelinjer, unntatt i den KP4 der PKM2 nivå var svakere enn den LDHA nivå. Ved immunhistokjemi, både PKM2 og LDHA hadde sterk cytoplasma og kjernekraft uttrykk (Fig 3).
Association med clinicopathological parametre
Sammenhengen mellom PKM2 og LDHA uttrykk med clinicopathological egenskaper er vist i tabell 1. det var en betydelig invers korrelasjon mellom PKM2 ekspresjon og tumor differensiering i UCLH kohort, med 83% av PKM2 positive tumorer som er mindre differensiert sammenlignet med 64% av PKM2 negative tumorer (p = 0,047, Chi-square test) (data ikke vist) .
en signifikant høyere antall CD8 + tIL ble funnet i tumorer med svak PKM2 eller LDHA ekspresjon sammenlignet med svulster som hadde en sterk uttrykket (p = 0,0001 p = 0.005 henholdsvis tabell 1). Videre ble det observert en signifikant sammenheng mellom tumorcelle-proliferasjon og ekspresjon av både PKM2 og LDHA; antall kreft kjerner uttrykke Ki-67 var mer enn 2 ganger høyere i PKM2 og LDHA uttrykker svulster sammenlignet med negative tumorer (PKM2: 27,8 ± 12,9 vs. 12,2 ± 14, p = 0,0001 og LDHA: 25,1 ± 14 vs. 12,3 ± 15,1, p = 0,004). Når flekker score, ble CD8 + TIL telling og antall Ki-67 positive celler betraktet som avhengige variabler, ble det observert en signifikant invers korrelasjon mellom flekker score og CD8 + celletall (PKM2: p 0,001 og LDHA: p = 0,004, Spearman rang korrelasjon). En betydelig direkte sammenheng ble lagt merke mellom flekker score og Ki-67 count (PKM2: p 0,001 og LDHA: p = 0,001, Spearman rank korrelasjon test) (figur 5 og 6). I TMA årsklasse, uttrykk for PKM2 og LDHA korrelert med tumorstørrelse. PKM2 uttrykk ble observert i 54,5%, 77,8% og 90,9% av svulstene som ble ≤ 2,5, 2.6-3.9 og ≥ 4 cm i størrelse, henholdsvis. Positive LDHA ekspresjon ble funnet i 59,1%, 77,8% og 100% i tumorer som var ≤ 2.5, 2.6 til 3.9 og ≥ 4 cm i størrelse, henholdsvis. Det var ingen signifikante forskjeller mellom PKM2 eller LDHA uttrykk og tumor beliggenhet, spredning til lymfeknuter, T-scene og metastatisk status.
(A) Godt differensierte svulster med negativ PKM2 uttrykk hatt sterk infiltrasjon av CD8 + positive T-lymfocytter (x200 forstørrelse). (B) Dårlig differensierte svulster sterkt positive for PKM2 hadde sparsom infiltrasjon av CD8 + positive T-lymfocytter (x200 forstørrelse). Det var en signifikant negativ korrelasjon mellom CD8 + positive celler og både PKM2 (C) (D) og LDHA farging (E) og amp; (F).
(A) Svulster med sterkt positiv PKM2 uttrykk styrte kjernen farget for Ki-67 (x100 forstørrelse). (B) Svulster svakt positiv for PKM2 hadde snaut Ki67 flekker (x100 forstørrelse). (C) og amp; (D) Sammenheng mellom PKM2 farging og Ki-67 positive celler. (E) (F) Sammenheng mellom LDHA farging og Ki-67 positive celler. Det var en signifikant sammenheng for både PKM2 og LDHA.
Sammenheng mellom PKM2 og LDHA uttrykk og pasient overlevelse
Vi neste undersøkt om uttrykk profil PKM2 og LDHA spådd overlevelse. Pasienter med svulster scoring 3 for PKM2 eller LDHA uttrykk hadde signifikant lavere overlevelse sammenlignet med de som svakt uttrykt PKM2 og /eller LDHA. Av de 72 bukspyttkjertelkreft prøver (UCLH kohort), 46 (64%) sterkt uttrykt PKM2 og disse pasientene hadde en median overlevelse på bare 8,9 måneder sammenlignet med 28,9 måneder i de 26 (36%) pasienter med svak (negativ) PKM2 svulst uttrykk (p = 0,016, log-rank test, figur 7). Tilsvarende 55 (76,4%) pasienter med positiv LDHA svulst uttrykk hadde en median overlevelse på 10,9 måneder sammenlignet med 34,5 måneder av 17 (23,6%) pasienter med svak (negativ) LDHA svulst uttrykk (p = 0,029, log-rank test, figur 7). Dessuten, når den ekspresjonsprofilen av PKM2 og LDHA ble kombinert, overlevelse av pasienter med negative uttrykk for begge eller positiv for en gitt fire ganger lengre enn de med en positiv status for begge (27,9 måneder sammenlignet med 7,0 måneder, henholdsvis p = 0.003, log rank test). Blant de flere overlevelses prediktorer ved univariat analyse (T-stadium, p = 0,006, tumor differensiering; p = 0,003, metastatisk status; p = 0,000), ved Cox regresjonsanalyse bare den kombinerte PKM2 /LDHA uttrykk status og tumor differensiering status var uavhengige overlevelse prediktorer (p = 0,003, Hazard ratio (HR) = 4,96 og p = 0,015, HR = 3,31, henholdsvis) (tabell i S1 tabell).
Både PKM2 (A) og LDHA (B) hadde en betydelig prognostisk betydning for pasientens overlevelse (p = 0,016, 0,029, log rank test, henholdsvis) og den kombinerte uttrykk for begge markører ytterligere stratifisert pasientene (C) (p = 0,003, log rank test). Som forventet har pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon hadde en lengre overlevelse enn unresected pasienter.
I tillegg 27 av de 72 pasientene (UCLH kohort) gjennomgikk kirurgisk reseksjon for PDAC (n = 16) eller ampullary adenokarsinom ( n = 11). De som gjennomgikk kirurgisk reseksjon hadde en betydelig lengre overlevelse enn de som ikke opereres (26,5 vs 7,0 måneder, P 0,0001, log rank test). Som forventet har pasienter med ampullary adenokarsinom hadde en bedre prognose etter operasjonen enn de med PDAC, med 5 av 11 (45,5%) ampullary karsinom pasienter i live etter siste kontakt, mot bare 1 av 16 (6,3%) pasienter med PDAC (P 0,0001, log rank test)
Diskusjoner
Det er montering bevis for at kreftceller har økt glukoseopptak med en samtidig økning i laktat produksjon gjennom sekvensielle katalytisk enzymmediert prosesser [44,45]. . PKM2 og LDHA er to viktige glykolytiske enzymer som letter disse prosessene til å gi kreftceller med en vekst fordel over normale celler. Til dags dato har serum PKM2 blitt identifisert som en diagnostisk og prognostisk markør med sammenlignbar sensitivitet og spesifisitet til serum CA19-9 markør i bukspyttkjertelkreft [46-48]. Men det er begrensede data på uttrykket mønster og prognostisk effekt av PKM2 og LDHA i bukspyttkjertelkreft [32,49,50]. Så langt vi kjenner til, er vår studie den første til å vurdere den prognostiske effekten av kombinert PKM2 og LDHA uttrykk i initiering og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen. En fersk studie viste overekspresjon og fosforylering av begge disse enzymene i skjoldbruskkjertelkreft sammenlignet med benign struma [51]. Våre resultater stemmer overens med deres funn viser betydelig overekspresjon av PKM2 og LDHA i bukspyttkjertel kreft sammenlignet med vanlig bukspyttkjertelen vev.
trinnvis initiering og utvikling av kreft i bukspyttkjertelen begynner ofte med pankreatitt, ductal metaplasi, cyste formasjon eller Panin lesjoner, som fører til kreft i bukspyttkjertelen. Interessant, våre resultater viser overekspresjon av LDHA på et svært tidlig stadium langs kreftfremkallende sti fra pankreatitt gjennom cyste /Panin til kreft med det høyeste uttrykk i de mest aggressive svulster. I kontrast, økt PKM2 uttrykk progressivt langs overgangen til kreft i bukspyttkjertelen og var lavest i cyster, middels i Panin lesjoner og høyest i kreft. Selv om den eksakte mekanismen for denne differensial uttrykk mønsteret er ikke avklart, er det mulig at de pre-neoplastiske lesjoner erverve glycolytic fenotype gjennom LDHA overekspresjon og deretter LDHA selv eller andre onkogener indusere PKM2 overekspresjon på senere stadier når svulst celle spredning priser er høyere . Faktisk har det nylig blitt vist at epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) induserer β-catenin transaktivering og c-myc ekspresjonen, oppregulering LDHA, som i sin tur induserer oppregulering av PKM2 ekspresjon ved alternerende spleising av genet fra M1 til M2 typen [52]. Disse funnene kan delvis forklare den konsekvente overekspresjon av LDHA hele tumorigent prosessen og den progressive overekspresjon av PKM2 langs kreftfremkallende sti. Uttrykket og enzymatiske aktivitet av LDHA og PKM2 kan også moduleres ved tyrosinfosforylering ved forskjellige rester (Y10 og Y105, henholdsvis) ved den oncogene tyrosinkinase-fibroblast-vekstfaktor-reseptor-1 [53]. Differensialuttrykksmønster tilsier at PKM2 (eller en kombinasjon av PKM2 og LDHA) ville være et bedre valg for kresne kreft fra pre-neoplastiske lesjoner sammenlignet med LDHA alene, bortsett fra i pankreatitt hvor begge merkene er sterkt uttrykt.
behandling av kreft i bukspyttkjertelen er svært vanskelig på grunn av sen diagnose, og mangel på passende prognostiske markører og effektive terapier. Våre resultater viser at både PKM2 eller LDHA er betydelige prognostiske markører i bukspyttkjertelkreft og kombinasjonen gir økt lagdeling av utfallet. Disse resultatene er i tråd med tidligere publikasjoner som viser en signifikant prognostisk effekt av LDHA eller PKM2 i andre tumortyper, inkludert plateepitelkarsinom, kolangiokarsinom og magekreft [43,54,55]. De eksakte mekanismene forbundet med overekspresjon av PKM2 og LDHA som fører til dårlig prognose fortsatt uklare. Ganske nylig, Rajeshkumar et al (2015) fant at LDHA lite molekyl hemmer FX11 kan hindre tumorvekst, redusere tumor celleproliferasjon og indusere apoptose i en pasient-avledet mus xenograft modell for kreft i bukspyttkjertelen med mutant TP53, mens svulster husing villtype TP53 var helt motstandsdyktig mot FX11 [56].
kreft i bukspyttkjertelen er en av de mer aggressive krefttyper, med en svært dårlig total overlevelse. Resultatene fra vår studie viser tydelig oppregulering av både PKM2 og LDHA i bukspyttkjertelkreft og implisere den høye uttrykket av disse to glykolytiske enzymer i utvikling og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen gjennom økt spredning, migrasjon, invasjon og angiogenese.
