Abstract
Lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) spiller viktige roller i ulike biologiske prosesser, slik som transkripsjonsregulering, cellevekst og tumorigenesis. Men lite er kjent om hvorvidt lncRNA-GAS5 (vekst arrest spesifikke 5) regulerer blærekreft progresjon. I denne studien fant vi at GAS5 uttrykket er ofte nedregulert i blærekreftcellelinjer og humane prøver. Knockdown av GAS5 fremmer blærekreft celleproliferasjon, mens tvangs ekspresjon av GAS5 undertrykker celleproliferasjon. Vi videre vist at knockdown av GAS5 øker CDK6 mRNA og proteinnivåer i blæren kreftceller. Ventet, induserer GAS5 hemming en betydelig reduksjon i G0 /G1 fase og en tydelig økning i S-fasen. Gain-av-funksjon og tap-av-funksjon studiene viste at GAS5 hemmer blærekreft celleproliferasjon, i det minste delvis, ved å regulere ekspresjon CDK6.
Konklusjoner
downregulated GAS5 fremmer kreftcelle blære spredning, blant annet ved å regulere CDK6, og dermed kan være nyttig i utviklingen av effektive behandlingsstrategier mot blærekreft
Citation. Liu Z, Wang W, Jiang J, Bao E, Xu D, Zeng Y, et al. (2013) nedregulering av GAS5 Fremmer blærekreft Cell Proliferation, Delvis ved å regulere CDK6. PLoS ONE 8 (9): e73991. doi: 10,1371 /journal.pone.0073991
Redaktør: Antonia Vlahou, Biomedical Research Foundation, Academy of Athens, Hellas
mottatt: 10 april 2013; Akseptert: 25. juli 2013, Publisert: 17.09.2013
Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Award Antall XBR 2011038 fra Shanghai Municipal Health Bureau. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Menneskelig blærekreft er den fjerde vanligste kreftformen hos menn og den tiende mest vanlig hos kvinner [1], [2]. Den vanligste histologiske typen blærekreft er uroteliale karsinom (UC) som er ikke-invasive papillærtumorer som ofte går igjen, men sjelden fremgang [3]. Generelt, er behandlingen av disse pasientene endoskopisk reseksjon [4], [5]. Invasive svulster i blæren er mer aggressive, og pasienter med muskel invasiv UC er vanligvis behandles med radikal cystektomi. Imidlertid halvparten av pasienter med blærekreft utvikle følgende metastatisk sykdom, selv etter radikal kirurgi av de primære tumorer [6]. Fremskritt i effektiv behandling for blærekreft har vært begrenset fordi de patologiske mekanismer som forårsaker svulst ikke er kjent. Derfor avslører den molekylære mekanismen for blæren tumorigenesis er uunnværlig for å utvikle effektiv behandling.
Nyere funn viser at lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) spiller viktige roller i ulike biologiske prosesser, slik som transkripsjonsregulering, cellevekst og tumorigenesis [7], [8]. Våre tidligere undersøkelser viste at H19 øker blærekreft celleproliferasjon og metastase [9], [10]. Oppregulert H19 bidrar til blærekreft vekst ved å regulere ID2 uttrykk. Oppregulert H19 øker også blærekreft celle metastase ved å knytte EZH2 og hemme E-cad uttrykk. Den hotair (for HOX anti intergeniske RNA) nivået økes i primærsvulster og regulerer kreft progresjon [11]. Overekspresjon av varmluft i epiteliale kreftceller fører til endret histon H3-lysin 27 metylering og fremmer kreft metastase [12]. Hotair er et kritisk element i metastatisk progresjon ved å assosiere med medlemmer av PRC2 komplekse (SUZ12, EZH2, og H3K27me3) [13], [14]. LncRNA-MEG3 (matern uttrykt gen 3) er også forbundet med tumordannelse og progresjon av meningeom [7]. MEG3 er ikke uttrykt i de fleste humane meningiomer eller de humane meningeom cellelinjer [7]. Re-uttrykk for MEG3 hemmer tumor celleproliferasjon og kolonidannelse i soft agar ved å fremkalle akkumulering av p53 protein og selektivt å regulere p53 target genuttrykk [15]. GAS5 er et nylig identifiserte ikke-kodende RNA som er forbundet med celleproliferasjon. GAS5 spiller en viktig rolle i normal vekst arrest i både T-cellelinjer og ikke-transform lymfocytter [16]. Overekspresjon av GAS5 reduserer frekvensen av progresjon gjennom cellesyklus, mens nedregulering av GAS5 hemmer apoptose og opprettholder en raskere cellesyklusen. Mourtada-M
et al
vist at GAS5 transkripsjonsnivåer er betydelig redusert i brystkreftprøver i forhold til tilstøtende normale bryst epitelvev [17]. Overekspresjon av GAS5 induserer vekst og apoptose uavhengig av andre stimuli. Men de underliggende mekanismene for GAS5 regulere kreftcelle spredning fortsatt uklare.
Basert på disse funnene, vi testet om GAS5 regulerer cellesyklus og celledeling i blærekreft celle. Vi fant at GAS5 uttrykk er betydelig redusert i blærekreft vev. Knockdown av GAS5 induserer en signifikant reduksjon i G0 /G1 fasen og fremmer blærekreft celleproliferasjon, i det minste delvis, ved å regulere ekspresjon CDK6.
Materialer og metoder
vevsprøver og cellelinjer
Menneskelige blæren vev ble innhentet skriftlig informert samtykke fra den første Folkets sykehus tilknyttet School of Medicine Shanghai Jiaotong University. Studien ble godkjent av etikkomiteen av School of Medicine Shanghai Jiaotong University. 28 eksemplarer av blærekreft vev og deres tilstøtende normalt vev ble samlet mellom 02/2011 og 12/2012 (tabell 1).
Menneskelige blærekreftceller (T24, DSH1, RT112, RT4, KU7 og 253J-celler) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA,) med 10% føtalt bovint serum (FBS;. Gibco)
Fast -time Polymerase Chain Reaction (PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra blærekreft vev eller celler ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), og den reverse transkripsjonsreaksjoner ble utført ved anvendelse av tilfeldige primere og en M- MLV revers transkriptase sett (Invitrogen). Real-time PCR ble utført ved hjelp av en standard protokoll fra SYBR Grønn PCR kit (Toyobo, Osaka, Japan) på Applied Biosystems 7300 Real Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til instruksjonene. p-aktin ble brukt som referanser for lncRNAs. ΔCt verdier ble normalisert til p-actin nivåer. Hver prøve ble analysert i triplikat.
Western Blot analyse
Western blot-analyse for å vurdere CDK6 og β-aktin-ekspresjon ble utført som tidligere beskrevet [18]. Den anti-CDK6 primære antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). β-actin primære antistoffer ble kjøpt fra Sigma (MO, USA).
flowcytometrisk analyse
RT4 celler (1~2 × 10
5) behandlet med GAS5-siRNA eller CDK6 -siRNA ble sådd ut i 6-brønns plater. Etter 48 timers inkubering ble kulturene inkubert med propidiumjodid i 30 min i mørket. Kulturer ble samlet og analysert for cellesyklus ved hjelp av et strømningscytometer (FACSCalibur, BD Biosciences) etter propidiumjodidfarging. Kulturene ble også farget med annexin V-fluoresceinisotiocyanat, og cellen apoptose ble analysert ved hjelp av en strømningscytometer.
Overuttrykte og små interfererende RNA
For å uttrykke GAS5, plasmid pcDNA-GAS5 ble konstruert ved å innføre en
KpnI-XhoI
fragment som inneholder GAS5 cDNA inn i de samme områdene i pcDNA3.1. Den GAS5 genet ble amplifisert fra cDNA preparert fra T24 celler ved PCR bruke forover og bakover primere: ggggtaccTTTCGAGGTAGGAGTCGAC og ccgctcgagGGATTGCAAAAATTTATTAAAATTG. pcDNA-GAS5 ble transfektert inn blærekreft cellelinje ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
For å hemme endogen GAS5 og CDK6 uttrykk, 2 × 10
5 celler per brønn i en seks-brønns plate ble transfektert med 50 nM angitt siRNA eller negativ kontroll ved hjelp av Lipofectamine 2000. Deretter ble cellene inkubert med siRNA for den angitte tid. Tre forskjellige GAS5-sirnas (referansesekvens NR_002578) ble designet av Ambion (Ambion, Austin, TX). Den CDK6-sirnas brukt i denne studien var blandinger av tre sirnas og ble kjøpt fra Ambion.
celleproliferasjonsanalyse
celleproliferasjon analyser ble utført ved hjelp av Cell Counting Kit-8 kit (Dojindo Laboratories , Kumamoto, Japan). RT4-celler ble sådd ut i 24-brønners plater i triplikat ved omtrent 1 x 10
5 celler per brønn og dyrket i vekstmediet. RT4 Cellene ble deretter behandlet med pcDNA-GAS5 eller GAS5-siRNA, og antallet celler pr brønn ble målt ved absorbans (450 nm) av redusert WST-8 (2- (2-metoksy-4-nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4-isulfophenyl) -2H-tetrazolium, mononatriumsalt) på angitte tidspunkter.
RNA Immunpresipitasjon og RNA Nedtrekk
RNA immunoprecipitation (RIP ) eller RNA Nedtrekk ble utført som beskrevet tidligere [10]. Kort fortalt, for RNA nedtrekk analysen, biotin-merket RNA var
in vitro
transkribert med Biotin RNA Merking Mix (Roche Diagnostic, Indianapolis, USA) og T7 RNA polymerase (Roche). Cellekjerneekstrakt (2 ug) ble blandet med biotinylert RNA (100 pmol). Vasket Streptavidin agarosekuler (100 ul) ble tilsatt til hver bindingsreaksjonen og ytterligere inkubert ved romtemperatur i 1 time. Kulene ble vasket raskt tre ganger og kokt i SDS-buffer, og den hentede-proteinet ble påvist ved standard Western blot teknikken.
CDK6 antistoffer som brukes for RIP er innkjøpt fra Abcam (Abcam, Cambridge, MA). De samutfelte RNA ble detektert ved revers transkripsjon PCR. Totalt RNA og kontroller ble også analysert for å vise at de detekterte signalene var fra RNA spesifikt bindes til CDK6.
Statistical Analysis
Statistiske sammenligning mellom 2 grupper ble utført ved hjelp av uparet
t
-test. Alle gruppene ble sammenlignet ved hjelp av en-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukey post hoc test der det passer. Forskjellen ble ansett statistisk signifikant på
p
0,05. Alle data ble representert som gjennomsnitt ± standard deviateon fra minst tre separate forsøk.
Resultater
GAS5 nivå er betydelig nedregulert i blærekreft
Tidligere studier har vist at GAS5 styrer celle apoptose og er nedregulert i brystkreft [17]. For å undersøke hvorvidt GAS5 regulerer blære tumorgenese, vi først undersøkt GAS5 ekspresjonsnivået i blærecancer vev og tilstøtende normale vev. Figur 1A viste at GAS5 uttrykk er bemerkelsesverdig nedregulert i 82% blærekreft vev sammenlignet med tilstøtende kontroller. For å bekrefte gyldigheten av GAS5 reduksjon, ble en del av den RNA som brukes for real-time PCR kastet northern blotting-analyse. I overensstemmelse med de ovenfor angitte resultater, ble GAS5 redusert i de fleste blærekreft vev (figur 1B). Vi deretter undersøkt uttrykket nivået av GAS5 i blærekreft cellelinjer (T24, DSH1, RT112, RT4, 253J, og KU7). Sammenlignet med normal urothelia cellen, GAS5 ekspresjon signifikant redusert i disse blærecancercellelinjer (figur 1C). Disse data indikerer at nedregulering av GAS5 kan være relatert til blærekreft progresjon.
(A) Analyse av GAS5 ekspresjonsnivået ble utført i blærekreft vev eller tilstøtende kontroll (n = 28). Totalt RNA ble utsatt for sanntids RT-PCR for å analysere CT verdiene av blærekreft normalisert til p-aktin i hver prøve. De normaliserte verdiene (ΔCT) fra alle vev ble så sammenlignet med et normalt vev, i hver gruppe (ΔΔCT). Resultatene ble uttrykt som Log10 (2
-ΔΔCt). (B) RNA fra 1-7 # anvendt i (A) ble analysert ved Northern blot-analyse som tidligere beskrevet [32]. (C) GAS5 nivåer ble evaluert av real-time PCR i blæren kreft cellelinjer. Normale urotelialceller ble anvendt som kontroll. *
p
.
0,05
GAS5 Hemmer Blære Cell Proliferation
in vitro
For å undersøke den biologiske rollen GAS5 i å regulere blærekreft celleproliferasjon ble blæren kreftcellen behandles med GAS5 eller GAS5-siRNA analysert. GAS5-siRNA behandling inhiberer signifikant GAS5 uttrykk, og GAS5 knockdown øker RT4 celleproliferering (figur 2A og B). Motsatt, oppregulerer pcDNA-GAS5 behandling GAS5 uttrykk, og undertrykker RT4 celleproliferering (figur 2C og D). Disse data tyder på at downregulated GAS5 i blærekreft bidrar til blærekreft celleproliferasjon.
(A) RT4 celler ble behandlet med GAS5-siRNA og GAS5 uttrykk nivå ble analysert etter 48 timer ved real-time PCR. (B) RT4-celler ble behandlet med GAS5-siRNA, og ved de indikerte tidspunkter, ble antall celler per brønn målt ved absorbans (450 nm) av redusert WST-8. (C) RT4 celler ble behandlet med pcDNA-GAS5, og GAS5 ekspresjonsnivået ble analysert ved sanntids-PCR. (D) RT4 celler ble transient overuttrykt med GAS5, og antallet celler pr brønn ble målt ved absorbans (450 nm) av redusert WST-8. Resultatene viser data fra minst tre uavhengige eksperimenter, uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
P
0,05
GAS5 Negativt Regulerer CDK6 Expression
in vitro
Vi deretter undersøkt. mulige mekanismer som GAS5 regulerer blærekreft celleproliferasjon. Vi utførte en RNA-pull-down-analyse for å identifisere proteiner som er forbundet med GAS5 (figur 3A). Massespektrometri-analyse av proteinbåndet som er spesifikk for GAS5 avslørte at Cyclin-avhengig kinase 6 (CDK6) er spesielt forbundet med GAS5 (tabell 2). CDK6 regulerer cellesyklusen, og feilregulering av CDK6 er forbundet med blærekreft progresjon [19]. For ytterligere å bekrefte tilknytningen mellom GAS5 og CDK6, neste utførte vi en RIP analysen med et antistoff mot CDK6 på RT4 cellulære ekstrakter. Konsekvent, observerte vi en betydelig høyere grad av anrikning GAS5 med CDK6 antistoffet, sammenlignet med den ikke-spesifikke IgG kontrollantistoff (figur 3B). Knockdown av GAS5 signifikant øker CDK6 mRNA og proteinnivå i kreft i blære cellelinjer (figur 3C og D), men nedregulering av GAS5 ikke endrer CDK2 og CDK4 ekspresjonsnivået (data ikke vist). Videre overekspresjon av GAS5 bemerkelsesverdig hemmer CDK6 uttrykk i blæren kreft cellelinjer (figur 3E).
In vivo
, en betydelig negativ korrelasjon er også observert mellom GAS5 nivåene og CDK6 nivåer i kreft vev (
r
2 = 0,168,
p
= 0,013, figur 3F). Vi undersøke videre rolle GAS5 i regulering av celle apoptose og cellesyklusen. Figur 4A viste at GAS5-siRNA behandling hemmer celle apoptotisk. Da GAS5 eller CDK6 er slått ned og cellesyklus er analysert av flowcytometri. Sammenlignet med kontroll siRNA, viser GAS5 downregulation en redusert prosentandel av celler i G0 /G1 fase og flere celler i S-fasen (Figur 4B). Den kvantitative analysen viser også en signifikant reduksjon i cellepopulasjonen i G0 /G1 fase i celler transfekterte med GAS5-siRNA (figur 4B). Mer viktig, knockdown av CDK6 av bestemte sirnas reduserer prosentandelen av celler i S-fasen i GAS5-siRNA-behandlede celler (figur S1, figur 4B). Disse data indikerer at GAS5 regulerer blærekreft cellesyklus, i det minste delvis, ved regulering av CDK6.
(A) Biotinylert GAS5 eller kontroll ble inkubert med nukleære ekstrakter (RT4 celler), målrettet med streptavidin perler og assosierte proteiner ble løst i en gel. Sølvfarging av SDS-PAGE-gel inneholdende porsjoner av prøver som stammer fra proteiner trukket ned av GAS5. (B) RIP eksperimenter ble utført ved anvendelse av CDK6 antistoff for å immunoutfelle RNA og en primer for å påvise GAS5 RNA. (C) Analyse av CDK6 mRNA nivå ble utført i blærekreft cellelinjer etter GAS5-siRNA behandling. ble utført (D) Western blot-analyse av CDK6 proteinnivået i blærecancerceller behandlet med GAS5-siRNA. (E) Analyse av CDK6 mRNA nivå ble utført i blærekreft cellelinjer etter GAS5 overekspresjon. Resultatene viser data fra minst tre uavhengige eksperimenter, uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
P
0,05
. (F) Negativ sammenheng mellom GAS5 nivåer og CDK6 nivåer i 16 blærekreftprøver (
r
2 = 0,168,
p = 0,013
).
(A) GAS5 ekspresjon ble inhibert med spesifikke sirnas i RT4, og den celle apoptose ble analysert ved flow-cytometer 48 timer senere. (B) RT4 celler ble behandlet med GAS5-siRNA eller CDK6-siRNA. Førtiåtte timer senere ble det relative celleantall i hver cellesyklus fase etter propidiumjodidfarging bestemt ved FACS-analyse. Dataene er fra en av tre uavhengige eksperimenter. Histogrammene ble analysert og prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen er vist. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre forsøk.
GAS5 Reduserer blærekreft Cell Proliferation ved å regulere CDK6
downregulated GAS5 øker blærekreft celleproliferasjon, og en betydelig negativ korrelasjon er observert mellom GAS5 og CDK6. Vi trodde derfor at rollen til GAS5 ved regulering av blærekreft celleproliferasjon er mediert ved modulering av ekspresjon CDK6. I samsvar med tidligere studier, knockdown av CDK6 hemmer RT4 celleproliferasjon (figur 5A). Videre er RT4 celleproliferasjon delvis undertrykt ved CDK6 knockdown i GAS5-siRNA-behandlede celler (Figur 5A). I GAS5-overekspresjon celler, tvunget uttrykk for CDK6 resultater i en restaurert celleproliferasjon (figur 5B). Disse data bekrefter at GAS5 avtar blærekreft progresjon, i det minste delvis, ved å regulere ekspresjon CDK6.
(A) RT4 celler ble behandlet med GAS5-siRNA og CDK6-siRNA, og antallet celler per brønn var målt ved absorbans (450 nm) av redusert WST-8. *
p
0,05
. (B) RT4 celler ble overuttrykt med GAS5 og CDK6, og antallet celler pr brønn ble målt ved absorbans (450 nm) av redusert WST-8. *
p
0,05
Diskusjoner
Nyere studier viser at den menneskelige transkriptom er mer kompleks enn en samling av protein-. gener; som viser omfattende antisens og ikke-kodende RNA (ncRNA) ekspresjon [20], [21], [22]. Selv om utgangspunktet hevdet å være falsk transkripsjonen støy, nye bevis viser at ncRNAs (for eksempel microRNAs og lncRNAs) delta i reguleringen av cellulær utvikling, cellevekst og sykdommer hos mennesker [23], [24]. Nyere studier har begynt å rakne deres betydning i tumorigenesis. For eksempel er lncRNA-H19 nivå bemerkelsesverdig forhøyet i et stort antall humane cancere [25], [26], og H19 overekspresjon overfører en vekstfordel på kreftceller [27].
GAS5 er et nylig identifisert lncRNA involvert i reguleringen av cellesyklusen [16], [28]. Mourtada-M
et al
viste at GAS5 spiller en avgjørende rolle i normal vekst arrest i både T-cellelinjer og ikke-transform lymfocytter [16]. GAS5 overekspresjon resultater i både en økning i apoptose og en reduksjon i frekvensen av progresjon gjennom cellesyklus, mens GAS5 knockdown hemmer apoptose og opprettholder en raskere cellesyklus, noe som indikerer at GAS5 uttrykk er nødvendig å normal vekst arrest i T-celle linjer og humane perifere blod T-celler [16]. GAS5 nivåer er også betydelig redusert i brystkreftprøver [17]. Basert på disse funnene, spekulerte vi om uttrykk for GAS5 er unormal og feilregulert GAS5 regulerer celleproliferasjon i blærekreft. I denne studien identifiserer vi at GAS5 uttrykket er ofte nedregulert i de fleste blærekreft prøver og blære kreft cellelinjer. GAS5 inhibering bidrar til blærekreft celleproliferasjon, mens overekspresjon av GAS5 hemmer celleproliferasjon. Tidligere studier viste at GAS5 binder seg til DNA-bindende domene av glukokortikoidreseptoren (GR) ved å fungere som et lokke glukokortikoid respons element (GRE), for således å konkurrere med DNA Gres for binding til GR. Således GAS5 er en «riborepressor» av GR, som påvirker celleoverlevelse og metabolske aktiviteter i løpet av sult ved å modulere transkripsjonen aktivitet av GR [29]. Her utførte vi en RNA pull-down analysen å undersøke potensialet mekanisme GAS5 i å regulere cellevekst. Våre data viser at GAS5 kunne kombinere med den cyklin-avhengig kinase 6 (CDK6), og ytterligere undertrykke ekspresjon av CDK6. Derfor, nedregulering av GAS5 øker CDK6 ekspresjon i blærecancerceller. GAS5 inhibering induserer en signifikant reduksjon i G0 /G1 fase og en økning i S-fasen ved CDK6-avhengig måte. Gain-av-funksjon og tap-av-funksjon studier bekreftet at GAS5 regulerer cellesyklusen og hemmer blærekreft celleproliferasjon, dels ved å regulere ekspresjon CDK6.
Tumor utvikling og progresjon har vist seg å være avhengig av cellulær akkumulering av ulike epigenetiske og genetiske hendelser, herunder endringer i cellesyklusen maskiner på G1 /S sjekkpunkt [30]. G1 /S faseomvandling reguleres primært av D-type sykliner (D1, D2, eller D3) i kompleks med CDK4 /CDK6, og E-type sykliner (E1 eller E2) i kompleks med CDK2 [30]. CDK6 er vist å være overuttrykt i blærekreft [31], og konseptet har kommet fram at Rb fosforylering av CDK4 /6 fører ikke bare til kritisk E2F-avhengig transkripsjon av essensielle cellesyklus enzymer og regulatorer men også til montering av pre-replikasjon komplekset i G1 fasen [31]. Derfor kan GAS5 /CDK6 reaksjonsvei spiller en viktig rolle i regulering av kreftutvikling og progresjon.
Konklusjoner
Disse resultater antyder at nedregulering av GAS5 øker blærekreft celleproliferasjon, i det minste delvis, etter regulere CDK6. Våre funn bidrar til en bedre forståelse av betydningen av feilregulert lncRNAs i blærekreft progresjon og gir en begrunnelse for den mulige utviklingen av lncRNA-baserte målrettede metoder for behandling av blærekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Western blot analyse av CDK6 proteinnivå ble utført i blæren kreftceller behandlet med CDK6-siRNA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0073991.s001 plakater (TIF)
