Abstract
MUC1 protein er et attraktivt mål for kreft narkotika levering på grunn av sin overekspresjon i de fleste adenokarsinomer. I denne studien er en rapportert MUC1 protein aptamer utnyttes som målsøkende middel av en nanopartikkel-basert medikament leveringssystem. Paclitaxel (PTX) lastet poly (melkesyre-ko-glykolsyre-) (PLGA) nanopartikler ble formulert ved en emulsjon /fordampning metode, og MUC1 aptamerer (Apt) ble konjugert til partikkeloverflaten gjennom et DNA-spacer. De aptamer konjugert nanopartikler (Apt-NPS) er i ferd med 225,3 nm i størrelse med en stabil
in vitro
legemiddelfrigjøringsprofil. Ved hjelp av MCF-7 brystkreftceller som en MUC1-overekspresjon modell, MUC1 aptamer øket opptak av nanopartikler inn i målcellene som målt ved flow-cytometri. Videre PTX lastet Apt-NPs forbedret
in vitro
levering av legemidler og cytotoksisitet til MUC1
+ kreftceller, sammenlignet med ikke-målrettede nanopartikler som mangler MUC1 aptamer (P 0,01). Oppførselen til denne romanen aptamer-nanopartikkel bioconjugates antyder at MUC1 aptamerer kan ha anvendelsespotensial i målrettet levering av legemidler mot MUC1-overekspresjon svulster
Citation. Yu C, Hu Y, Duan J, Yuan W, Wang C, xu H, et al. (2011) Novel Aptamer-partikler Bioconjugates Forbedrer Levering av kreft narkotika til MUC1-positiv kreft celler
In Vitro
. PLoS ONE 6 (9): e24077. doi: 10,1371 /journal.pone.0024077
Redaktør: Tarl Wayne Prow, University of Queensland, Australia
mottatt: 02.05.2011; Godkjent: 29 juli 2011; Publisert: 01.09.2011
Copyright: © 2011 Yu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne erkjenne økonomisk støtte fra det kinesiske departementet for vitenskap og teknologi (2011CB911003, 2011CB911004, 2011CB933504) og Foundation Natural Science of China (81071870). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kjemoterapi er en primær behandling for kreft, men dets effekt er ofte begrenset på grunn av assosierte bivirkninger. Målrettet medikamentleveringssystemet kan overvinne den ikke-spesifikk toksisitet av kjemoterapi fordi det kan direkte anticancer legemidler til tumorceller og unngå toksisitet overfor normale celler. I mange tilfeller har nanopartikler (NP) blitt bevist av et stort potensial for medikamentlevering på grunn av den passive tumor-targeting effekt med forbedret permeabilitet og retensjon (EPR) som utvises av de fleste nano bærere [1]. Videre kan en aktiv rettet mot effekt oppnås dersom et målsøkende middel er konjugert til nanopartikkel overflate. I det siste, monoklonale antistoffer (Mabs) var de foreslåtte målsøkende midler [2]. I det siste roman målretting midler, inkludert aptamerer [3], korte peptider [4] og andre små molekyler [5], har blitt den nye generasjonen rettet mot molekyler. Aptamerer er små tråder av DNA eller RNA som kan danne unike tre-dimensjonale strukturer som spesifikt kombineres for å molekylære mål med høy affinitet. Sammenligne med andre målsøkende midler, aptamerer besitter særegne fordeler: lav syntese kostnads, lav-immunogenisitets-, liten størrelse som gjør det lett å trenge gjennom solide svulster, og høy affinitet sammenlignes med monoklonale antistoffer for å binde seg til nesten alle molekyler. Tidligere aptamerer har blitt brukt som målretting midler for å forbedre levering av legemidler til prostatakreft [6], [7], [8] og lymfatisk leukemi celler [9].
De ovennevnte studiene har banet veien for utnytte aptamer-konjugert nanopartikkel å utvikle målrettede stoffet leveringssystemer. Men de fleste aptamer styrt nanopartikler studert så langt rettet mot prostatakreft [6], [7], [8] og aptamer styrt nanobærere for levering av legemidler til andre kreftformer er ikke rapportert i litteraturen. Det ville være å foretrekke hvis en aptamer mot et bredt spektrum av kreftformer er anvendt til å konstruere et målrettet medikamentleveringssystem. MUC1 mucin er et stort trans glykoprotein, som uttrykk økt minst 10 ganger i de fleste maligne adenokarsinomer, noe som gjør det til et ideelt mål molekyl for kjemoterapeutika [10]. Glykosylering og fordeling av proteinet på celleoverflaten er unormale i ovarie, lunge, bukspyttkjertel og prostata cancer, så vel som i primære og metastatisk brystkreft, som er den mest vanlige cancer hos kvinner med 1,4 millioner tilfeller rapportert i 2008 [11 ]. Nylig ble flere MUC1 aptamerer utviklet av C.S.M. Ferreira et al. [12], og en av dem ble anvendt for selektivt å levere phototoxin til kreftceller
in vitro product: [13]. Så langt har imidlertid nanopartikkel-baserte kreft narkotika levering system rettet mot MUC1 protein har ikke blitt rapportert i litteraturen. Blant de publiserte MUC1 aptamerer, er S2.2 en 25-base-oligonukleotid som binder til MUC1 protein med forholdsvis høy affinitet og spesifisitet [12], [13]. I denne studien, bygget vi en MUC1 aptamer-konjugert nanopartikkel med S2.2 for levering av paclitaxel til MUC1-positive tumorceller, som kombinerer fordelene med aptamer som målsøkende middel og styrken av nanopartikler som legemiddelbærer. Vi undersøkte dens grunnleggende egenskaper og evaluert levering sin effekt
in vitro
bruker en MUC1-overekspresjon modell MCF-7 cellelinje. Vi rapporterer nå at MUC1 aptamer-nanopartikkel forbedrer levering av anticancer stoffet til MUC1-positive MCF-7 celler
in vitro
.
Materialer og Metoder
Material
MUC1 aptamer S2.2 (5′-GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G-3) ble syntetisert av Invitrogen (Shanghai, Kina). En modifisert aptamer S2.2-spacer, laget av S2.2 og designet DNA spacer (5′-GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG GTT CCC TTC CTT CTC TCT TCC TCT CTC CTT CTC TCT TCC TCT CTC CTT C-3 «) ble også syntetisert. Noen aptamerer ble modifisert med 3»-NH
2 eller 5′-FITC på en etter behov base. Poly (melkesyre-ko-glykolsyre-) (PLGA, 50:50, MW = 16 000),
N
-hydroxysulfosuccinimide (NHS), 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimidhydroklorid (EDC ), paklitaxel (PTX), 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), fluoresceinisotiocyanat (FITC) og poloksamer 188 var alle av analytisk kvalitet.
MCF-7 og HepG2-cellelinjer ble erholdt fra Celle Center of Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina). Celler ble dyrket i DMEM-medium, supplert med 100 enheter /ml vandig penicillin G, 100 mg /ml streptomycin og 10% FBS ved konsentrasjoner for å tillate 70% konfluens i 24 timer.
Nanopartikkel fremstilling
paclitaxel innkapslet nanopartikler ble utarbeidet etter en emulsjon /fordampning teknikk. Kort fortalt ble 0,1 mg PTX og 2,0 mg PLGA ble oppløst i 0,2 ml etylacetat og blandes med 1,0 ml 5% poloksamer vandig oppløsning i 30 s med sonikering (200 w) i et isbad. Emulsjonen ble forsiktig omrørt og oppløsningsmidlet avdampet ved 40 ° C i 2 timer. Etter inndampning, ble suspensjonen sentrifugert ved 100.000 g i 30 min. Supernatanten ble fjernet og utfellingen ble resuspendert i dobbeltdestillert vann. For evaluering av cellulært opptak av Apt-NPS, ble FITC innkapslet i nanopartikler i stedet for PTX, ved en konsentrasjon på 0,25 mg /ml.
Karakterisering av nanopartikler
Partikkelstørrelsen ble bestemt ved hjelp dynamisk lysspredning (Malvern Zetasizer Nano ZS, UK). 1,0 mg NPs eller apt-NPs ble oppløst i 1,0 ml dobbeltdestillert vann. Partikkelstørrelsesfordelingen ble målt ved en spredningsvinkel på 90 °. Intensiteten veide gjennomsnittsverdien ble registrert som et gjennomsnitt av tre målinger.
For å bestemme PTX lasting, 1,0 mg frysetørket PTX-Apt-NPs ble lysert i NaOH (1 M) og UV-absorbans (Thermo Nanodrop 1000, USA) ble målt ved en bølgelengde på 227 nm. 1,0 mg frysetørket vanlig NPs ble brukt som parallelle kontroller for å eliminere virkningene av bakgrunnen. Den PTX ble kvantitativt bestemt ved å sammenligne med en standardkurve.
Bøyning av aptamerer til nanopartikler
konjugering av aptamerer eller tilfeldig DNA til nanopartikler ble oppnådd via kryssbinding av COOH og NH
2. I korthet, ble 50 ul av PTX-NPS (10 ug /ml i DNase RNase-fritt vann) ble inkubert med 100 pl av 40 mM 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid-hydroklorid (EDC) og 100 ul 10 mM
N
-hydroxysulfosuccinimide (NHS) i 15 minutter ved romtemperatur med forsiktig omrøring. Da de aktiverte partikler ble kovalent bundet til 50 ul av 3′-NH
2-modifisert MUC1 aptamer (1 ug /mL i DNase RNase-fritt vann) eller 3′-NH
2, 5′-FITC- modifisert MUC1 aptamer på en som nødvendig base, i 2 timer ved romtemperatur. De resulterende aptamer-nanopartikkel bioconjugates ble vasket, resuspendert og bevart i DNase RNase-fritt vann. Konjugeringen av 5′-FITC, 3′-NH
2-modifisert MUC1 aptamer til PLGA mikropartikler (0,5 mg /ml) ble analysert ved flowcytometri (Accuri C6, USA).
Cellular bindings av aptamerer
Den cellulære binding av aptamerer ble bestemt ved flowcytometri (FCM) analyse av celler etter inkubasjon med FITC-merket tilfeldig DNA (Ran), S2.2 aptamer, eller S2.2-spacer. MCF-7 og HepG2-celler ble forsiktig skrapet og vasket med D Hanks to ganger. Cellene ble suspendert i bindingsbuffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl
2, pH 7,2) og inkubert med Ran, MUC1 aptamer S2.2 eller S2.2-avstands ved en konsentrasjon på 300 nM i 30 min. FCM-analyse ble utført for å undersøke bindingen av tilfeldige DNA eller aptamerer til begge cellelinjer.
In vitro
utgivelsen profil PTX fra Apt-NPs
in vitro
frigjøring av PTX fra Apt-NPs ble oppdaget av membranen diffusjon teknikk. PTX-apt-NPS ble oppslemmet i fosfatbuffer saltvann (PBS, pH 7,4) inneholdende 0,5% (w /v) poloksamer. 5 ml av suspensjonen (2 mg /ml) ble innført i en dialysepose (MWCO 3500) og deretter neddykket i 95 ml frigi medium i en risteinkubator innstilt ved 120 rpm ved 37 ° C. Ved de forutbestemte tidsintervaller, ble prøver tatt ut og erstattet med friskt frigjøringsmediet. Nanopartikler og frigjøres PTX ble separert ved ultrasentrifugering ved 100.000 g i 30 minutter ved 4 ° C. Den PTX Innholdet i supernatanten ble bestemt ved UV-spektrofotometer ved en bølgelengde på 227 nm. De kumulative utslipp prosenter av PTX fra Apt-NPs ble beregnet som følger og plottet mot tiden.
Cellular opptak eksperiment
cellulært opptak av partiklene ble bestemt av FCM analyse av celler etter inkubasjon med FITC innkapslet partikler. MCF-7 og HepG2-celler ble dyrket i 24-brønners plater i 24 timer. Cellene ble deretter inkubert med 50 ug /ml FITC innkapslede NPS eller Apt-NPS i 2 timer ved 37 ° C. FCM analyse ble deretter utført for å undersøke cellulære fluorescens opptak av både kreftcellelinjer.
Confocal fluorescens scanning mikros
cellulært opptak av NPs eller Apt-NPs av MCF-7 var videre utredning av konfokal fluorescens scanning mikroskopi (Perkin Elmer Ultra, USA). MCF-7 celler ble tillatt å holde seg til et glass dekkglass i 6-brønners plate i 24 timer. Cellene ble deretter inkubert med 100 ug /ml NPS eller Apt-NPS, begge inneholdende FITC, i 2 timer ved 37 ° C. Deretter ble cellene vasket med Hanks D og behandlet med 0,25% trypsin i 1 min. De suspenderte celler ble overført til et sentrifugerør og vasket to ganger. Cellene ble deretter fiksert med 4% formaldehyd i 10 min ved 4 ° C og analysert ved confocal fluorescens scanning mikroskopi.
In vitro
cytotoksisitet
For å evaluere cytotoksiske effekter av PTX-Apt-NPS mot MCF-7 og HepG2-celler ble begge cellelinjer dyrket i 96-brønners plater. Cellene ble behandlet med vanlig NPs, gratis PTX, PTX-lastet NPs (PTX-NPS) og PTX-lastet Apt-NPs (PTX-Apt-NPs). PTX-lastet NPs konjugert til tilfeldig DNA (PTX-R-NPs) ble også brukt til å tjene som en annen kontroll. MCF-7 og HepG2-celler ble ko-dyrket med de respektive stoffer ved en ekvivalent PTX dose på 0,05 ug /ml i 4 timer ved 37 ° C, deretter vasket med Hanks D (2 x 500 mL per brønn). Celler ble dyrket i ytterligere 48 timer og deretter MTS assay (Promega, USA) ble anvendt for å bestemme cellenes levedyktighet per standard protokoll som er beskrevet av produsenten.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Statistisk Analysis System (SAS, versjon 9.2). Enveis ANOVA med Fisher minst signifikant forskjell (LSD) post hoc sammenligninger på 99% konfidensintervall ble brukt for statistiske sammenligninger. Alle data er presentert som en middelverdi med sin standardavvik angitt (gjennomsnitt ± SD).
Resultater
Utarbeidelse av Apt-NPs
PTX-Apt-NPs ble konstruert som skissert i fig. En ved hjelp av en rutine emulsjon /fordampning metoden. PTX ble innlemmet i NPs av fysisk innesperring gjennom hydrofobe interaksjoner mellom PTX og PLGA (Fig. 1B). For å lette flerverdig binding mellom aptamer og målet, er en avstandsholder ofte innsatt mellom aptamer og nanopartikkel kjøretøyet. Derav konstruerte vi et DNA-avstandsstykke ved å utvide den 3 «ende av den opprinnelige S2.2 aptamer med 48 flere baser (fig. 1A), og gir et avstandsstykke lengde nær den for PEG 3400, som er en vanlig brukt i avstands målrettet medikamentavlevering systemer [14], [15]. Den utvidede delen av DNA vil ikke påvirke den sekundære strukturen i S2.2 aptamer per beregningsanalyse (RNAstructure, versjon 4.5). Å bøye den aptamer-avstands komplisert å PTX-lastet NPs, ble EDC og NHS lagt til katalysere dannelsen av kovalente par mellom -COOH av PLGA på nanopartikkel overflaten og 3»-NH
2 MUC1 aptamer (fig. 1B). Stoffet lastet nanopartikkelstørrelsen er 164,0 ± 7,6 nm før kopling til aptamerer, og økte til 225,3 ± 9,2 nm etter konjugering, antagelig på grunn av den ekstra størrelsen på aptamer og avstandsstykket. Den PTX innkapsling effekten var 83,6 ± 1,7% med et medikament belastning på 4,2 ± 0,1%.
(A) Oppbygging av MUC1 aptamer S2.2-spacer. Den S2.2-avstandsstykket er laget av det MUC1 aptamer S2.2 (som den målsøkende middel) og en konstruert sekvens av enkeltkjedet DNA (som forbinder avstandsstykke). (B) Fremstilling prosedyre for PTX-Apt-NP med emulsjon /fordampning metoden.
Affinity av MUC1 aptamer til MCF-7 og HepG2 cellelinjer
aptamer S2.2 er rapportert å spesifikt bindes til MUC1 protein med høy affinitet [12]. For å teste om S2.2 ville differensielt binde seg til MUC1-positive og MUC1-negative celler, bindingen av S2.2 til MCF-7 og HepG2 celler ble evaluert ved FCM-analyse. En tilfeldig DNA (Ran) ble anvendt som kontroll. Tidligere studie er vel etablert at MCF-7 er et human brystcancer cellelinje som overuttrykker MUC1-proteinet på sin overflate [16], og som HepG2 er en MUC1-negativ human leverkreft cellelinje [17]. I samsvar med den opprinnelige meldingen på den aptamer S2.2 (gul kurve) viste en høyere binding til MUC1-positive MCF-7-celler enn de MUC1-negative HepG2-celler (Fig 2 A og. B). Det tilfeldige DNA (blå kurve) hadde en mye lavere binding til både MCF-7 og HepG2-celler, antagelig et resultat av ikke-spesifikk binding. Videre, for å undersøke om S2.2-avstandsstykke hadde en lignende binding preferanse for MUC1-positive celler, ble bindings eksperimentet gjentatt for S2.2-spacer. Resultatene viste at den S2.2-avstandsstykket (rød kurve) hadde lignende interaksjon med begge celler som S2.2 (Fig 2 A og. B), noe som tyder på at S2.2-avstandsopprettholdes den selektive binding evnen av den opprinnelige aptamer. Den midlere fluorescensintensitet av FITC-merket S2.2-avstands binding til MCF-7 er 3,5 ganger høyere enn med HepG2, slik at det er en kvalifisert målsøkende middel for å selektivt sikte på MCF-7 celler. Siden et avstandsstykke kan lette flerverdig binding mellom aptamer og målet, ble S2.2-spacer anvendt som den målsøkende middel for å konstruere medikamentavleveringssystem i denne studien.
(A) Histogrammer av FCM-analyse. FITC-merket tilfeldig DNA, S2.2 eller S2.2-avstands ble inkubert separat med MCF-7 (til venstre) og HepG2 (høyre) celler. (B) Den gjennomsnittlige fluorescerende intensiteten av MCF-7 og HepG2 celler inkubert med tilfeldig DNA og ulike aptamerer.
Evaluering av konjugering mellom aptamerer og nanopartikler
MUC1 aptamer-spacer var konjugert til nanopartikkel i reaksjonen katalysert av EDC og NHS. For å sikre at DNA aptamer ble faktisk knyttet til overflaten av partikkelen, ble to eksperimenter utført. I det første eksperimentet, FITC-merket aptamer ble ko-inkubert med mikropartikler (MPS), enten i nærvær eller i fravær av katalysatorer EDC og NHS, og deretter analysert ved hjelp av FCM. Som vist på fig. 3A, partikkel fluorescerende intensitet i fravær av EDC og NHS var nesten identisk til den for vanlig MPS, mens en positiv fluorescens ble observert i nærvær av EDC og NHS. Resultatene antydet konjugasjonen mellom aptamerer og partiklene ble indispensably aktivert av katalysatorene, og at aptamerer ble stabilt konjugert til partiklene gjennom kovalent binding. Den andre eksperiment undersøkes tilstedeværelsen av DNA aptamer på nanopartikler ved UV-spektroskopi og evaluert konjugerende effekt. I likhet med FCM-resultatene, ble flere aptamerer knyttet til nanopartikler i nærvær av EDC og NHS (Fig. 3B). Mengden av konjugerte aptamerer på NPs ble også beregnet. I dette reaksjonssystemet, om lag 0,1 nmol aptamerer ble kovalent bundet til 1 mg PLGA NPS, eller ca 120 aptamerer for hver nanopartikkel.
PLGA mikropartikler (MPS), nanopartikler (NPS) omsatt med aptamerer i fravær ( -EDC NHS) eller nærvær (+ EDC NHS, venstre) eller nærvær (+ EDC NHS, høyre) av katalysatorer. Vanlig mikropartikler som ikke hadde reagert med aptamerer ble brukt som kontroll. (B) UV-absorpsjon av DNA ved 260 nm (n = 3) på partiklene som gjennomgikk konjugering prosess med aptamerer. Kontrollgruppen (NPS) indikerer vanlig nanopartikler som ikke har reagert med DNA aptamerer.
In vitro
utgivelsen profil PTX fra Apt-NPs
neste studerte
in vitro
utgivelsen profil av PTX fra Apt-NPs, en nødvendig egenskap for anticancer aktivitet. Mengden av PTX frigivelse i PBS ble analysert overtid med UV-absorpsjon ved 227 nm. En typisk Kinetikken for forlenget frigivelse fremgangsmåte ble observert for PTX, med omtrent 65% av medikamentet gradvis frigjort i løpet av de første 48 timer (fig. 4). Andelen av PTX utgitt her var på linje med frigjøringsprofilene til mange PLGA medikamentbærersystemer som er rapportert i litteraturen [18], [19], [20].
Forsøket ble utført i fosfatbuffer saltvann (PBS , pH 7,4) inneholdende 0,5% (w /v) poloksamer ved hjelp av membranen diffusjon teknikk, (n = 3).
Cellulært opptak eksperiment
den viktigste egenskap ved en målrettet legemiddelavleveringssystem er dets spesifisitet overfor målcellene. For å utforske
in vitro
kreft målretting av Apt-NPs mot MUC1-overekspresjon celler, vi sammenlignet cellulært opptak av MCF-7 (MUC1
+) og HepG2 (MUC1
-) ved hjelp av FCM-analyse (fig. 5). NPs og Apt-NPs, både innkapsle FITC, samtidig var dyrket med MCF-7 og HepG2. Fluorescent intensitet av MCF-7 og HepG2 celler inkubert med NPs var lik i amplitude. Men for Apt-NPS behandlede MCF-7-celler, den fluorescerende intensitet økt med 71%, mens den for HepG2 celler knapt endret seg. Skillet er antagelig forårsaket av de konjugerte aptamerer, som er bundet til den MUC1 protein på overflaten av MCF-7-celler, noe som resulterer i flere nanopartikler som er festet til celleoverflaten og internalisert inn i cellen.
Cellene ble så inkubert med FITC innkapslet Apt-NPs eller NPs 50 mikrogram /ml i 2 timer før lagt analyse.
Confocal fluorescerende scanning mikros
resultatene ovenfor viser at Apt-NPs generert forbedret fluorescens intensitet i MUC1-positive MCF-7 celler, sammenligne med NPs. Det var imidlertid ikke helt klart hvorvidt Apt-NPs var festet til celleoverflaten eller internalisert inn i cellene. For ytterligere å studere samspillet ordningen mellom Apt-NPs og målcellene ble konfokal fluorescerende scanning mikroskopi utføres for å bestemme plasseringen av Apt-NPs. Flere bilder skanne gjennom ulike nivåer av MCF-7 celler ble oppnådd. De sentrale nivå skanner som gikk gjennom sentrum av cellen og kjernene ble vist i fig. 6. Bildene klart indikerte at apt-NPs ble i hovedsak samlet i cytoplasma rundt kjernen. Følgelig kan Apt-NPs bli internalisert inn i målcellene og bære kreft narkotika inn i cytoplasma. Sammenlignet med Apt-NPS, mengden av NPS angitt MCF-7-celler var mye mindre; tyder igjen på at MUC1 aptamer tilrettelagt opptak av nanopartikler i cellene.
Grønn fluorescerende FITC ble innkapslet i Apt-NPs og NPs. Kjernene ble farget blå med DAPI. Den høyre kolonnen viser de sammenslåtte bilder av FITC og DAPI kanaler. MCF-7 celler ble eksponert for FITC-innkapslet Apt-NPs eller NPs på 100 mikrogram /ml i 2 timer.
In vitro
cytotoksisitet
Mobil opptak forsøket viste at Apt-NPs økt opptak av nanopartikler av MUC1-overekspresjon tumorceller. Det er imidlertid ikke kjent hvordan dette vil påvirke leveringen av anticancermiddelet til cellene. For å studere problemet,
in vitro
cytotoksisitet av fri PTX, vanlig NPs, PTX-lastet NPs (PTX-NPS), PTX-lastet NPs konjugert til tilfeldig DNA (PTX-R-NPs), og PTX- lastet NPs konjugert til MUC1 aptamerer (PTX-Apt-NPS) ble sammenliknet med MCF-7 (MUC1 +) og HepG2 (MUC1-) som målceller. Resultatene er presentert i fig. 7. Plain NPs viste liten cytotoksisitet, noe som tyder på at levering av kjøretøy er relativt giftfri til cellene og at cytotoksisitet ble hovedsakelig forårsaket av den innkapslede PTX. Fri PTX genererte tilsvarende grad av cytotoksisitet i begge cellelinjer. PTX-Apt-NPs produsert en mer potent cytotoksisitet enn PTX-NPs eller PTX-R-NPs i MCF-7 celler (P 0,01). Imidlertid Cytotoksisiteten forskjeller ble ikke observert i HepG2-celler. Dette er i samsvar med de resultatene som er vist i fig. 5, i hvilken MUC1 aptamer øket opptaket av Apt-NPS inn i MCF-7-celler (MUC1 +), men ikke HepG2-celler (MUC1-). Resultatene tyder på at den MUC1 aptamer kan selektivt å forbedre tilførselen av anticancer medikament til MUC1-positive cancerceller.
Cellene ble deretter vasket og inkubert i dyrkningsmedier for totalt 48 timer, før celleviabilitet i hvert gruppe ble vurdert med en standard MTS analyse (n = 6, middelverdi ± SA).
diskusjon
målrettet medikamentleveringssystemer er blitt foreslått for å løse problemet at de fleste antikreft terapeutiske midler unnlater å virke spesifikt på kreftceller og føre til toksisitet overfor normale celler. I denne studien utviklet vi et MUC1 aptamer-baserte målrettet medikamentleveringssystem (fig. 1) for å forbedre tilførselen av paclitaxel til MUC1-overuttrykkende tumorceller. De MUC1 aptamerer viste høyere affinitet og selektivitet mot MCF-7-celler (MUC1
+) over HepG2-celler (MUC1
-) (Fig. 2.). Å konstruere Apt-NPs ble MUC1 aptamerer konjugert de aptamerer til NPs overflaten gjennom kjemisk kovalent kobling (Fig. 3). Apt-NPs viste en profil av vedvarende legemiddelmeldingen (Fig. 4). Den rettet mot aptamer økt opptak av nanopartikler i MUC1-overekspresjon tumorceller (fig 5 . 6). Videre Apt-NPs forbedret PTX levering til MUC1-positive tumorceller (Fig. 7) mens viser ingen effekt mot kontrollcellene.
Tidligere studier av aptamer-konjugert NPs for levering av legemidler har bedret effekt mot prostatakreft via en aptamer av prostata-spesifikt membran antigen (PSMA) [6], [7], [8], [21]. Imidlertid ville det være ideelt å konstruere en aptamer-baserte medikamentavgivelsessystem rettet mot et bredt spektrum av kreftsykdommer. MUC1 protein er overuttrykt og abnormt glykosylert på overflaten av de fleste adenokarcinomceller [10], noe som gjør det til et svært attraktivt mål for kreftbehandling. I denne studien, for første gang, blir MUC1 aptamer utnyttes som et målsøkende middel i en nanopartikkel-baserte medikamentleveringssystem. Den MUC1 aptamer (S2.2) som brukes i denne undersøkelsen oppviste høy bindingsaffinitet til MUC1, noe som er sammenlignbart med det anti-MUC1-antistoff C595 [12], [22]. Den målrettede nanopartikkel leveringssystem basert på dette MUC1 aptamer ble evaluert for sin målgruppe evne mot MCF-7 celler
in vitro
. Ligner på levering av legemidler system basert på PSMA aptamer, vi observert økt opptak av Apt-NPs av MUC1-overekspresjon MCF-7 celler (Fig. 7). Siden MUC1 protein er overuttrykt på overflaten av flere typer kreftceller, kan en slik medikamentavgivelsessystem potensielt forbedre levering av anticancermidler til flere ondartede sykdommer, for eksempel kreft i bukspyttkjertelen [23], prostatakreft [24], eggstokk-kreft [25 ], etc.
Som omtalt ovenfor, den forbedrede levering av antikreft-medikament var hovedsakelig indusert av MUC1 aptamer. De confocal scanning mikroskopi bilder (Fig. 6) og den økte cytotoksisitet sammenligne å frigjøre PTX (Fig. 7) indikerte at NPs ble internalisert inn i cellene. Generelt er det tenkt at medikament-lastet PLGA NPS blir tatt opp av cellene ved internalisering, og deretter frigi medikamentet inne i cellene [26]. De S2.2 aptamerer konjugert til NPs trolig fremmet samspillet mellom NPs og MCF-7 celler via ligand-reseptor anerkjennelse. Nærmere bestemt, S2.2 bundet til MUC1 antagelig handlet som et anker og trekkes nanopartikkel til nærheten av cellen, og forbedret sjansene for nanopartikkel blir internalisert av MCF-7-celler. For MUC1-negative HepG2-celler, aptamer mislyktes i å forbedre opptaket av nanopartikkel (fig. 5), antagelig fordi det ikke ble bedre interaksjonen mellom nanopartikkel og cellen.
En avstandsmolekyl er ofte nødvendig mellom den målsøkende molekyl og bærernanopartikkel: lengde og fleksibilitet av avstands tillater målrettet mot aptamerer trenge gjennom celleoverflatemolekyler og binder seg til målene i en flerverdig måte [14]. I denne studien, forsøkte vi en ny tilnærming for å konstruere et avstandsstykke, som kan forenkle fremstillingsprosedyren. Vi utvidet 25-base-S2.2 aptamer ved tilsetning av en 48-base-DNA-sekvensen til 3′-enden av den aptamer, for å lage en 73-base-tråden. DNA-spacer er designet for å unngå dannelse av sekundære struktur og hadde omtrent samme lengde som den mest brukt avstands PEG-3400 (25 nm). Bindingseksperimentet (fig. 2) viste at aptamer S2.2 og S2.2-avstands hadde lignende bindingsprofiler med de MUC1-positive målceller og MUC1-negative kontrollceller. Disse resultatene antydet at den utvidede DNA-tråden ikke påvirker bindingen evnen til S2.2 og kan tjene som en mulig spacer. Ved å unngå PEG avstands, denne byggemåten forenklet kjemien konjugerende målsøkende middel og avstandsstykket til nanopartikkel. Siden fordelene med avstandsstykket har blitt godt godkjent [27], [28] og den S2.2-avstands viste god affinitet til MUC1-positive målceller, ble aptamerer med DNA spacer anvendes for å konstruere den målrettede medikamentavleveringssystem i denne forskningen . Som forventet, S2.2-avstands konjugert Apt-NPs vises høy spesifisitet og affinitet mot MUC1-overekspresjon celler
in vitro
.
MUC1 protein er en viktig tumorassosiert antigen (TAA) påvist i de fleste adenokarsinomer. Nylig har en gruppe av MUC1 aptamerer er blitt identifisert, inkludert aptamer S2.2 [12], som har potensiale til å tjene som målsøkende middel for MUC1 protein. Det primære målet med denne studien er å undersøke muligheten for å utvikle en nanoskala medikamentleveringssystem basert på S2.2 og foreløpig evaluere kreft målretting evne
in vitro
. Her bygget vi en roman PTX-lastet nanopartikkel konjugert til MUC1 aptamer S2.2 gjennom en DNA spacer. Den aptamer ble funnet å øke opptaket av nanopartikler inn i MUC1-positive MCF-7-celler. Videre PTX belastede Apt-NPs forbedret cytotoksisitet mot MCF-7 celler
in vitro
. Likevel, for å praktisk talt realisere MUC1-målrettet levering av legemidler, omfattende fremtidig forskning på Apt-NPs er fortsatt berettiget, inkludert detaljert
in vivo
evaluering av farmakokinetikk, farmakodynamikk, skadevirkninger og langsiktig biokompatibilitet i dyre studier.
Konklusjon
I sammendraget, et MUC1 aptamer styrt nanoskala levering av legemidler systemet ble utviklet med en roman konjugering strategi. Resultatene viser at systemet effektivt kan forbedre PTX levering til MUC1- overekspresjon MCF-7-celler
in vitro
. Siden mange kreftformer overuttrykker MUC1 protein, vi postulere at målrettet levering av legemidler med sikte på MUC1 kan tjene som en potensiell strategi for å forbedre behandlingen utfallet av disse svulstene.
