Abstract
Fulvestrant (ICI-182780) har nylig vist seg å effektivt undertrykke prostatakreft cellevekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Men det er uklart om microRNAs spille en rolle i regulering av onkogen-ekspresjon i fulvestrant behandlet med prostatakreft. Her, denne studien rapportene
HSA-Mir-765
som første fulvestrant-drevet, ERβ regulert miRNA stiller betydelige tumor suppressor aktiviteter som fulvestrantmengden mot prostatakreft cellevekst via blokkering av cellesyklusprogresjon på G2 /M overgang, og cellevandring, og invasjon eventuelt via reduksjon av filopodia /intens spenning-fiberdannelse. Fulvestrant ble vist å oppregulere
HSA-MIR-765
uttrykk gjennom rekruttering av ERβ til 5′-regulatoriske-regionen i
HSA-MIR-765
. HMGA1, et onkogen protein i prostatakreft, ble identifisert som en nedstrøms mål av
HSA-MIR-765 Hotell og fulvestrant i cellebaserte eksperimenter og en klinisk studie. Både antiøstrogen og
HSA-MIR-765
ligne trykkes HMGA1 protein uttrykk. I en neo-adjuvant studie, nivåene av
HSA-MIR-765
ble økt og HMGA1 uttrykk ble nesten helt borte i prostatakreft prøver fra pasienter behandlet med en enkelt dose (250 mg) av fulvestrant 28 dager før prostatektomi . Disse funnene viser en roman fulvestrant signalkaskade som involverer ERβ-mediert transcriptional oppregulering av
HSA-MIR-765
som undertrykker HMGA1 protein uttrykk som en del av mekanismen bak svulsten suppressor handlingen av fulvestrant i prostatakreft.
Citation: Leung YK Chan QK-Y, Ng CF, Ma FM-T, Tse HM, Til KF, et al. (2014) Hsa-miRNA-765 som en nøkkel mellommann for å hemme vekst, migrasjon og invasjon i Fulvestrant behandlet prostatakreft. PLoS ONE 9 (5): e98037. doi: 10,1371 /journal.pone.0098037
Redaktør: Jindan Yu, Northwestern University, USA
mottatt: 21 januar 2014; Godkjent: 28 april 2014; Publisert: May 16, 2014
Copyright: © 2014 Leung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Hong Kong University Grant Rådets generalsekretær forskningsfond (M469107 til KML) og Chinese University of Hong Kong Direktestipend (CU2041252 og CU2041563 til KML), en Veterans Affairs Merit Award (I01BX000675 til SMH) og tilskudd fra National Institutes of Helse (ES019480, ES020956, ES015584, ES006096, CA112570, CA015776 til SMH) og et stipend fra Investigator-sponset studie Program for Astrazeneca (til JM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. Jodi Maranchie mottatt Investigator-sponset studie Program av Astrazeneca. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Den normale utvikling og ondartet vekst av prostata er regulert ikke bare av androgener, men også av østrogen [1]. Østrogenreseptor (ER) β er den viktigste reseptoren uttrykt i prostata epitel og i flere stadier av prostatakreft (PCA), inkludert skjelettmetastaser [2], [3]. Den syntetiske østrogen diethylstilbestrol (DES), gjennom sin androgen-deprivasjon handling, som en gang var frontlinjen behandling for metastatisk PCa [1], [4]. DES til slutt tapt til fordel på grunn av sin høye hjerte-toksisitet og tromboembolisk risiko [5], [6], med parenteral østradiol-17β (E2) stadig ny popularitet som en terapi for metastatisk, kastrering-resistente PCa (CRPC) [7], [ ,,,0],8] grunn av sin lave toksisitet kardiovaskulære profil og beskyttende virkning mot osteoporose [9]. Andre selektiv ER modulatorer (f.eks tamoxifen, toremifen, og reloxifene) har blitt undersøkt i kliniske studier, men funnet å ha begrenset effekt sammenlignet med DES [10] – [13]. Med godkjenning i 2005 av fulvestrant (ICI 182 780), et rent østrogen reseptor antagonist uten kjent agonistisk handling, for behandling av reseptor-positiv metastatisk brystkreft, har interessen for sin bruk for CRPC dukket opp.
I prekliniske modeller, har fulvestrant vist funksjonene i en lovende behandling for PCa. I en østrogen-indusert PCa modell [14] – [17], fulvestrant hindret utviklingen av forstadier til kreft, reversert E2-indusert transkriptomet [16], [17], og induserte sin egen gen signatur [16]. I DU145, en human PCa cellelinje som uttrykker ERβ og ingen ERα, fulvestrant trykkes cellevekst via den reseptoren [18] og regulert et unikt sett av gener, eventuelt gjennom krysstale mellom ERβ og NFkB [19]. Videre fulvestrant undertrykte veksten av DU145 og PC-3 xenografter gjennom en ERβ-mediert KLF5 signalveien [20] og også hemmet LNCaP cellevekst ved downregulating androgen reseptoren [21].
I den eneste fase II studiet av fulvestrant hittil gjennomførte [22], 20 CRPC pasienter fikk en laste-dosering (500 mg på dag 0 og deretter 250 mg på dag 14 dag 28, og deretter månedlig). Etter seks måneders behandling, fulvestrant ble godt tolerert, selv om ingen gunstig klinisk eller PSA respons ble observert [22]. Men ved å øke startdose i den første måneden (500 mg hver 14 dager), PSA nivå ble effektivt redusert med 40-99% innen 0.27-2.67 måneder i seks av de sju svært forbehandlede CRPC pasienter uten noen åpenbar toksisitet [23 ]. Sistnevnte funn gir støtte til å drive mer forskning i dosejustering og dybde mekanistiske studier av fulvestrant som en terapi for PCa.
microRNAs (mirnas) er små (17-25 nukleotider) ikke-kodende RNA som regulerer post-transcriptional genuttrykk. Hver miRNA kan binde seg til en eller flere målsekvenser i den 3′-utranslaterte-region av dens target transkripter og fremkaller nedbrytning av mRNA eller undertrykkelse av proteintranslasjon, avhengig av graden av komplementær baseparring [24]. En enkelt miRNA regulerer normalt ekspresjon av et stort antall transkripter [25] – [27]. Avvikende uttrykk for spesifikke miRNAs ensidige vekstfordel til kreftceller enn normale celler ved å forstyrre flere onkogene /tumor-suppressor veier. PCa-spesifikke mirnas er blitt identifisert [28] – [30], og noen er androgen-relaterte [31]. Til dags dato, men ingen enkelt miRNA har vært knyttet til østrogener eller anti-østrogener ved PCA.
Her har vi undersøkt hvilken rolle miRNA i formidling handlingen av fulvestrant ved PCA. Global profilering av miRNA uttrykket i DU145 cellene identifisert
HSA-MIR-765
som fulvestrant regulert miRNA. Arrangøren analyser definert en minimal sekvens i 5′-regulatoriske regionen
HSA-Mir-765
som rekrutterer ERβ og som er avgjørende for fulvestrant regulering. Effektene av de miRNA på PCa cellevekst, migrering og invasjon ble sammenlignet med de av fulvestrant. Avhengigheten av fulvestrant handlinger på ERβ ble demonstrert av knockdown eksperimenter. Endringen i uttrykk for
HSA-MIR-765 Hotell og dens nedstrøms onkogene protein, høy mobilitet gruppe AT-krok 1 (HMGA1), ble vurdert i prostatektomi prøver hentet fra pasienter etter at de hadde blitt behandlet med fulvestrant for en måned.
Materialer og metoder
Fulvestrant behandling
DU145 og PC3 cellelinjer ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia). DU145-celler (ATCC) ble opprettholdt som tidligere beskrevet [18]. PC3 (ATCC) celler ble dyrket i RPMI 1640 med 10% varme-inaktivert FBS (HIFBS). Identiteten til hver cellelinje er nylig blitt godkjent av ATCC som benytter tandem repeat profilering metode. Alle celler ble opprettholdt i 5% trekull-strippet HIFBS medium i 24 timer før behandling. Cellene ble behandlet med enten 10
-6 M fulvestrant i 0,1% eller 0,1% etanol. Kontrollkulturer ble behandlet med bilen bare.
miRNA og genuttrykk
For miRNA profilering, ble totalt RNA ekstrahert og merket direkte ved hjelp av NCode Rapid Merking System (Invitrogen, Grand Island, New York) og kledd på NCode menneskelige miRNA microarray V3 (Invitrogen).
Tissue uttrykk for miRNA ble studert ved å trekke totalt RNA fra frysesnitt (5-10 mikrometer) som bruker RNAzol RT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH), poly (A) -endepåfestet og revers transkribert med universell RT primer bruker NCode mikroRNA første-cDNA kit (Invitrogen). Real-time PCR ble utført med SYBRGreen PCR Master-Mix (Invitrogen) ved hjelp av enten
HSA-MIR-765
spesifikke eller spliceosomal U6 liten kjernefysiske RNA (RNU6) -spesifikk QRT fremover primer (tabell S2) og en universell revers qPCR primer (Invitrogen).
Totalt RNA ble forberedt med tilfeldig heksamer (Invitrogen). Ribosomalt protein 3 (RPS3, Tabell S2) ble anvendt som kontroll rengjøring. Relativ genekspresjon ble bestemt ved ΔΔC
T-metoden [32].
kliniske prøver
Pasienter med histologisk bekreftet klinisk lokalisert PCa ble gitt en enkelt intramuskulær injeksjon av 250 mg fulvestrant , 28 dager før en planlagt radikal retropubic prostatektomi. Pasienter ble ekskludert hvis de hadde et antall hvite blodlegemer 3 000 /mikroliter, et blodplate 100 000 /mikroliter, hemoglobin 11 g /dl, INR 1.6, eller bilirubin ASAT eller kreatinin nivåer 1,5 ganger øvre normalgrensen. Pasientene ble også ekskludert hvis de hadde behov kortikosteroider for behandling av andre systemiske sykdommer eller hadde en historie med hjertesvikt, aktive angina, infeksjon eller aktiv andre malignitet. Alle fag hadde en endelig Gleason sum av 6 eller 7 på prostatektomi. Prøver fra ubehandlede pasienter med en lignende Gleason sum og alle prøver fra fulvestrant behandlede pasienter ble hentet fra University of Massachusetts Medical School (umms) under en protokoll (PI. Dr. Maranchie) godkjent av komiteen for beskyttelse av menneske Emner i forskning og Institutional Review Board på umms. Alle fag som tilbys skriftlig informert samtykke til å delta i denne studien, og de ble avidentifisert.
knockdown av ERβ
sirnas for ERβ eller rykke siRNA (Invitrogen) ble transfektert inn DU145-celler (2 × 10
5) ved hjelp av X-tremeGENE (Roche, Indianapolis, IN). SiRNA-behandlede celler ble behandlet med enten fulvestrant eller etanol i ytterligere 2-4 dager, og deretter utsatt for sanntids RT-PCR, promoteraktivitet analyse, cellevekstanalyse, og F-aktin-farging.
5 «regulatoriske region analyserer
5′ oppstrøms genomiske regioner av
HSA-MIR-765
forløper (Chr1:. 156,906,923-156,906,036 Adgangsnummer NC_000001.10) -3208-100 var forsterkes og klonet inn pGL3-basic (Promega, Madison, WI) som
pGL3-HSA-MIR-765
. Serielle delesjoner fra 5′-enden av den klonede sekvensen i vektoren ble utført for å generere pGL3-MIR-765-bp Δ1192 (sekvens-DNA -2016-100), pGL3-MIR-765-bp Δ1766 (DNA-sekvens fra – 1442-100), pGL3-MIR-765-Δ2414 bp (DNA sekvens -792 til 100), pGL3-MIR-765-Δ2618 bp (DNA sekvens -590 til 100), pGL3-MIR-765- Δ2972 bp (DNA sekvens -236 til 100), og pGL3-MIR-765-Δ3113 bp (DNA sekvens -95 til 100). Reporter aktivitetene til andre avkortede eller muterte vektorer i DU145 cellene ble bestemt med eller uten fulvestrant og /eller ERβ siRNA knockdown bruker dual luciferase reporter analysen system (Promega).
Mirna målretting reporter analysen
DU145-celler ble transfektert med luciferase reporter vektor pMIR-MIR-765 som ble klonet med komplementære sekvens av hSA-MIR-765 som perfekt MIR-765 mål og deretter behandlet med enten hSA-MIR-765 etterligne eller negativ-kontroll etterligne. Lysatene ble underkastet den doble luciferase reporter-analyse. 3′-translasjonell regionen
høy mobilitet gruppe AT-krok en product: (
HMGA1
) genet (+ 8026- + 9332) ble generert ved PCR (primere i tabell S2) og klonet inn pMIR-RAPPORT (Invitrogen) som
pMIR-HMGA1-3UTR
.
HSA-MIR-765
ligne (sekvens i tabell S2) ble klonet inn pMIR som
pMIR-MIR-765
. Effekten av
HSA-MIR-765
ligne på luciferaseekspresjon ble bestemt av luciferase assay (Promega), med
pMIR-tom
inkludert som en kontroll.
Kromatin immunoprecipitation analysen
Chromatin immunoutfellingsstudier (chip) ble utført i henhold til publiserte metoder [19]. I korte trekk, ble DU145-celler behandlet med fulvestrant eller kontroll i 45 minutter. DNA-proteinkomplekser ble tverrbundet med 1% formaldehyd. Atom komplekser ble ultralydbehandlet (250-500 bp). Fem mikrogram mus IgG (Millipore, Billerica, MA), anti-RNA polymerase II (Millipore) eller anti-ERβ1 (Serotec, Raleigh, North Carolina) antistoffer ble søkt om natten immunoprecipitation. DNA-proteinkomplekser ble vasket og eluert. Immunoutfelt DNA ble renset opp, reverse-krysskoblet, og renset. PCR og sanntids PCR avslørte rekruttering av ERβ til en sekvens i 5′-regulatoriske regionen
HSA-miR765 plakater (primere som er oppført i tabell S2).
0N
formidler av ERβ [33] ble brukt som en ikke-ERβ bindende kontroll for dette eksperimentet.
Cell-vekstanalyse
Effekter av fulvestrant eller
HSA-MIR-765
-mimic behandling på DU145 eller PC3 cellevekst ble bestemt av CellTiter 96 ikke-radioaktivt Cell Proliferation Assay (Promega). For HMGA1 ektopisk uttrykk eksperiment, full lengde HMGA1 (pCMV6-AC-HMGA1, OriGene, Rockville, MD) eller en negativ-kontroll (pCMV6-AC) ble transfektert inn DU145 cellene. De transfekterte celler ble anriket i G418-supplementert medium for en uke. Relativ vekst av DU145-celler ko-behandlet med fulvestrant i 4 dager og enten HMGA1 ekspresjon eller tom vektor i forhold til kontrollcellene som ble behandlet med etanol og tom vektor, ble sammenlignet.
Strømningscytometri-analyser
DU145 celler ble behandlet med fulvestrant /etanol eller
HSA-MIR-765
ligne /negativ-kontroll ligne i 2 dager. De behandlede celler ble analysert i henhold til publiserte protokoller [32].
Western blot-analyser
Fem mikrogram protein fra celle-lysat ble underkastet elektroforese på 10 til 12,5% SDS-PAGE og underkastet Western blot analyse. Primære antistoffer oppført i tabell S3 ble brukt til å påvise protein nivåer.
Migrasjon og invasjon analyser
DU145 eller PC3 celler ble behandlet med fulvestrant eller
HSA-MIR-765
ligne og deres respektive kontroller for 2 dager. Sårhelende analyser ble utført som tidligere rapportert [34]. DU145 cellene ble forbehandlet med fulvestrant eller etanol i 5 timer før migrasjon og invasjon ble utført [34].
Trådformede-aktin (F-aktin) farging
F-aktin i fulvestrant- eller etanol-behandlede DU145 kulturer utsatt for RNAi-mediert knockdown av ERβ, ble
HSA-MIR-765
-mimic transfeksjon, eller kontroll behandling visualiseres som tidligere beskrevet [34]. I korte trekk ble fulvestrant- og etanolbehandlede kontroll DU145 cellene med enten ERβ siRNA eller negativ-kontroll siRNA farget med TRITC-konjugert phalloidin, og fluorescens bildene ble tatt.
Computational prediksjon av miRNA mål
Miranda /mirSVR [35] (https://www.microrna.org), TargetScan r5.2 [36] (https://www.targetscan.org), RNAhybrid [37], og EIMMo2 [38 ] ble brukt til å forutsi de antatte målene for
HSA-MIR-765
. Genomisk justeringer, BLAT (https://www.ensembl.org), ble brukt for ytterligere kontroll av predikerte nettsteder.
Farging av HMGA1 og AR
Frosne seksjoner (5 mikrometer) av PCa prøver fra pasienter som ble behandlet eller ikke behandlet med fulvestrant før prostatektomi ble fiksert i 3% formaldehyd ved værelsestemperatur og deretter med metanol ved -20 ° C. HMGA1 og AR ble immunpåvist med 1:100 anti-HMGA1 antistoff (sc 8982, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) og anti-AR henholdsvis (sc 816, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) ifølge publiserte protokoller [39 ]. Immunopositivity ble bestemt av hvor stor prosentandel av positive signal (kjernefysisk eller cytoplasma) i Gleason grad 3/4 foci.
Resultater
A. Fulvestrant hemmer cellevekst, cellesyklusprogresjon, migrering og invasjon i en ERβ avhengig måte
fulvestrant hemmet veksten av DU145-celler med 40% og PC-3-celler med 30% gjennom en ERβ-avhengig reaksjonsvei (figur 1 A, Figur S1A) og arrestert celledeling i G2 /M-fase, som indikert ved en signifikant reduksjon i G0 /G1 cellepopulasjon og en akkumulering av G2 /M-celler (figur 1B). Avbrudd i celle-syklusprogresjon ble ledsaget av økt ekspresjon av G2 /M-markører cyklin A (G2), cyclin B (M), og fosforylert cdc2 (G2), men ikke av S-fase markører cyclin E og cdc25C (figur 1C).
(A) Fulvestrant induserer vekst hemming av DU145 cellene via en ERβ avhengig mekanisme. Veksten av fulvestrant-behandlede DU145-celler med eller uten ERβ siRNA knockdown i 4 dager i forhold til de etanol-behandlede kontrollceller med negativ-kontroll siRNA er presentert og sammenlignet (n = 8). ERβ uttrykk ble også slått ned av en annen siRNA (siRNA # 2) og lignende resultater ble oppnådd (figur S5). (B) Fulvestrant induserer DU145 cellesyklus arrest i G2 /M-fasen. Representative DNA-histogrammer av 48 timer fulvestrant -or etanol- (kontroll) behandlede celler og prosentvise fordelinger av cellene ved G0 /G1 og G2 /M-fasene (n = 3) er presentert og sammenlignet. (C) Fulvestrant induserer ekspresjon av G2 /M-markører. DU145-celler ble behandlet med fulvestrant eller etanol i 2 dager (kontroll) og cellesyklus markører ble bestemt ved Western blot-analyse. To uavhengige eksperimenter ble utført og en representant sett med data ble presentert. (D) Fulvestrant undertrykker celle migrasjon. En sårhelende analyse ble utført på de fulvestrant- og etanol (EtOH) behandlede DU145-celler (n = 3). Representative mikrografer av fulvestrant- og etanol behandlet cellekulturer med riper på 0 h og etter 16 timer er vist. Såret er markert med stiplede linjer. (E) Fulvestrant hemmer transwell migrasjon (venstre panel) og invasjon (høyre panel) i DU145-celler (n = 3) etter 5 timer for fulvestrant behandling. (F) Reduksjoner av filopodial celler og celler med intens spennings fibre av fulvestrant (behandlet med 48 timer) via en ERβ avhengig mekanisme. Representative mikrografer og prosentandelen av cellene med intense spennings fibre og filopodial-celler (n = 3) er presentert. Student t-test ble utført for å bestemme signifikans med en cutoff p-verdi på 0,05. ** P 0,01; barer = SD
Fulvestrant hemmet celle migrasjon i sårhelende analysen (figur 1D), og transwell migrasjon (figur 1E, venstre panel) og celle invasivitet i transwell invasjonen analysen (figur 1E, rett panel) med ~40% (
p
0,01, n = 3) i DU145 celler (figur 1E) samt i PC-3-celler (fig S2). Behandling med fulvestrant signifikant reduksjon i prosentandelen av celler filopodial fra 90,1% til 55,9% (
p
0,005, n = 5) og celler med intens spenning fiber fra 96,4% til 64,2% (
p
0,001, n = 5) (figur 1F). RNAi-mediert knockdown av ERβ effektivt reversert fulvestrant-indusert hemming (figur 1F).
B. Fulvestrant oppregulerer
HSA-MIR-765
uttrykk i PCA celler
Blant de 211 påvisbare mirnas, 6 svært rikelig mirnas inkludert HSA-MIR-185, HSA-la-7b, HSA-speil 765, HSA-la-7a, HSA-MIR-601, og HSA-MIR-768-5p ( 300 relativ normalisert signal intensitet) ble oppregulert etter fulvestrant-behandling ( 2 ganger;
p
0,005) (figur 2A).
Hsa-MIR-765
var en av de Mirs som viste den største relative økningen (3,8 ganger) og største absolutte nivået på uttrykk i fulvestrant behandlet DU145 celler (tabell S1). Fulvestrant også induserte en betydelig økning i uttrykket av dette MIR i PC3 cellene i en ERβ avhengig måte (figur 2B, Figur S1B).
(A)
Hsa-MIR-765
er sterkt uttrykt i fulvestrant behandlet DU145 cellene. Totalt RNA av behandlede celler ble merket direkte og kledd på NCode menneskelige miRNA microarray. De median og lineær regresjon-normalisert data er presentert i et spredningsplott. (B)
Hsa-MIR-765
er indusert av fulvestrant i to prostata kreft cellelinjer. HSA-MIR-765 i fulvestrant- og etanol-behandlet kontroll DU145 og PC-3 celler ble kvantifisert ved miRNA QRT-PCR-analyse. Relative fold endringer mellom uttrykket av
HSA-MIR-765
i fulvestrant-behandlede og kontrollceller blir presentert. Student t-test ble utført for å bestemme deres betydning ved hjelp av en cutoff p-verdi på 0,05 (n = 3). ** P 0,01; barer = standardavvik
C.
Hsa-MIR-765
hemmer cellevekst, cellesyklusprogresjon, migrasjon og invasjon
En
HSA-MIR-765
ligne eller en negativ kontroll ble uttrykt i DU145 celler som bærer luciferase reporter vektor
pMIR-MIR-765
. Ektopisk uttrykk for
HSA-MIR-765
etterligne, men ikke den negative kontroll, effektivt undertrykt luciferase aktivitet ved 70% i DU145 cellene (figur 3A). Overekspresjon av
HSA-MIR-765
ligne i DU145 celler indusert hemming av cellevekst (40%, figur 3B) og cellesyklus arrest i G2 /M (G0 /G1 til G2 /M ratio redusert fra 3,5 ± 0,26 til 2,7 ± 0,10,
p
= 0,0074) (figur 3C) og oppregulert uttrykk for cyclin A, cyclin B, og fosforylert-cdc2 men ikke cyclin E eller cdc25C (figur 3D). Til slutt, det redusert cellemigrering og invasivitet (~80%, figur 3E), og dannelsen av filopodia /intens spenning fiber (figur 3F) ved nivåer høyere enn eller sammenlignbare med de som forårsakes av fulvestrant (se figurene 1C 0,01; bar = standardavvik
D. Fulvestrant induserer oppregulering av
HSA-MIR-765
uttrykk via rekruttering av ERβ til en antatt regulerende element
DU145 cellene ble utsatt for sirnas-mediert knockdown av ERβ før fulvestrant behandling. SiRNA effektivt slått ned ERβ uttrykk (figur S4). Dette knockdown fullstendig blokkert fulvestrant-indusert forbedring av
HSA-MIR-765
uttrykk (figur 4A) og avskaffet trans aktiviteter fulvestrant på en 5′-regulatorisk sekvens av
HSA-MIR-765
(mellom -3208 og 100; 3,3 kb) (figur 4B). Serie sletting analyse identifisert en 141 bp sekvens (mellom -236 og -95) i 3,3-kb 5′-regulatorisk sekvens som viktig i formidling av stimulerende effekt av fulvestrant på
HSA-MIR-765
transkripsjon. Chip analyser ytterligere demonstrert rekruttering av ERβ til denne korte sekvensen følgende fulvestrant stimulering (figur 4D). Disse data støtter en rolle ERβ i formidling av fulvestrant-indusert
HSA-MIR-765
oppregulering.
(A) ERβ siRNA knockdown blokker fulvestrant-indusert oppregulering av
HSA-speil 765
uttrykk i DU145 cellene. Ekspresjonsnivåene av
HSA-MIR-765
bestemt ved QRT-PCR-analyse av fulvestrant-behandlede celler med ERβ-siRNA (siERβ) eller forvrenge negativ-kontroll (siNeg) ble sammenlignet (n = 3). (B) siRNA knockdown av ERβ blokker fulvestrant-indusert trans av 5 «oppstrøms regulatorisk område av
HSA-MIR-765
i DU145 cellene. 5 «oppstrøms regulatorisk område av
HSA-MIR-765
ble klonet inn en luciferase vektor. Rapportør aktiviteter med ERβ-knockdown (siERβ) eller krafse negativ-kontroll (siNeg) i nærvær av fulvestrant ble sammenlignet (n = 3). (C) Sletting kartlegging analyse definerer en fulvestrant-responsive segmentet i
HSA-MIR-765
regulatorisk område i DU145 cellene. 5 «oppstrøms DNA sekvens av
HSA-MIR-765
fra nt. -3208-100 ble analysert ved anvendelse av luciferase reporter-systemet. Serielle delesjoner fra 5′-enden av den klonede sekvensen i vektoren ble gjennomført. Rapportør aktiviteter ble sammenlignet mellom de fulvestrant-behandlede (fulvestrant) og kontroll (EtOH) celler for hver reporter-vektor (n = 3). (D) Fulvestrant-induserer rekruttering av ERβ på den antatte
HSA-MIR-765
regulatoriske regionen. Kromatin-immunoprecipitation avslørte rekruttering av ERβ til en sekvens i 5′-regulatoriske regionen
HSA-miR765
. Mus IgG og RNA polymerase II tjene som negativ og positiv kontroll, respektivt. Fulvestrant induserte 17 ganger økning i ERβ rekruttering når sammenlignet med ikke-ERβ bindende region (den 0N promoteren av ERβ [33], [41]). Student t-test ble utført for å bestemme betydningen av mellom grupper ved hjelp av en cutoff p-verdi på 0,05. ** P 0,01; bar = standardavvik
E. HMGA1 er et mål på
HSA-MIR-765
bioinformatiske analyser med flere miRNA mål prediksjon programmer foreslo HMGA1 som et mål av
HSA-MIR-765
; en konservert anerkjennelse nettsted på 8982-9002 med -22,6 kcal /mol minimum fri energi ble spådd (figur 5A, tabell S4). Reporter analyser viste at transfeksjon av
HSA-MIR-765
etterligne, men ikke på en negativ-kontroll etterligne, betydelig redusert
HMGA1 3 «UTR
-avhengig luciferase aktivitet (figur 5B); ingen slik forskjell ble observert i DU145 celler som bærer den pMIR-tom vektor. Viktigere, transfeksjon av
HSA-MIR-765
ligne fullstendig blokkert uttrykk for HMGA1 protein (figur 5C øvre panel), sammen med en svak reduksjon i mRNA nivå (figur 5C, nedre panel). Av interesse, behandling med fulvestrant også effektivt stenge uttrykk for HMGA1 protein (figur 5D). Disse dataene støtter en hemmende rolle
HSA-MIR-765
på HMGA1 uttrykk på proteinnivå og en mellommann rolle i fulvestrant aksjon på PCA celler. Til slutt, ektopisk ekspresjon av HMGA1 effektivt reduseres den veksthemmende virkning av fulvestrant på DU145-celler (figur 5E), et funn i samsvar med den rapporterte onkogene virkningen av HMGA1 i prostata [40].
(A) 3- «UTR av
HMGA1
8910-8929 er anslått til å være
HSA-MIR-765
bindingssetet. (B)
Hsa-MIR-765
samhandler med 3’UTR av
HMGA1
i en måls reporter analysen. DU145-celler ble transfektert med enten tom eller pMIR-pMIR-HMGA1-3UTR hvori 3 «UTR av
HMGA1 plakater (+ 8026- + 9332) ble klonet inn i 3′ enden av luciferase. Reporter aktiviteter av pMIR-HMGA1-3UTR transfektert celler behandlet med
HSA-MIR-765
ligne eller negativ-kontroll ligne sammen (n = 3). (C)
Hsa-MIR-765
ligne redusert HMGA1 protein uttrykk i DU145 cellene. Protein og mRNA nivåer av HMGA1 i
HSA-MIR-765
mimic- og negative kontrollligne behandlede celler ble bestemt ved Western blot analyse (øverst) og real-time RT-PCR-analyse (lavere), henholdsvis. Resultater fra
MIR-765
ligne vs negativ kontroll ligne sammen (n = 3). (D) Fulvestrant reduserer HMGA1 protein uttrykk i DU145 cellene. Proteinnivået av HMGA1 og β-aktin i fulvestrant-behandlede og etanol-behandlede kontroll (CTL) celler ble bestemt ved Western blot-analyse. (E) ektopisk uttrykk for HMGA1 blokker fulvestrant-indusert DU145 celleveksthemming. Den relative cellevekst ble bestemt etter 4 dager med behandling med fulvestrant eller etanol etter stabil transfeksjon av
HMGA1 plakater (eller tom vektor for kontroll) for en uke. Proteinnivåer av HMGA1 ble vist i figur S6. Den cellevekst av fulvestrant-behandlede celler med overekspresjon HMGA1 vs tom vektor blir sammenlignet (n = 8). Student t-test ble utført for å bestemme signifikans mellom grupper ved hjelp av en cutoff p-verdi på 0,05. ** P 0,01; bar = standardavvik
F.
Hsa-MIR-765
er forhøyet, men HMGA1 protein er redusert i fulvestrant behandlet PCa eksemplarer
prostatektomi vev ble oppnådd fra pasienter med lokaliserte PCa som fikk eller ikke fikk fulvestrant behandling (250 mg, im 28 dager før prostatektomi). Real time RT-PCR-analyser viste oppregulering av
HSA-MIR-765
mRNA (2,7-fold,
p
0,05, n = 7) i PCA prøver fra fulvestrant behandlede pasienter sammenlignet med de fra ubehandlede kontroller (n = 7) (Figur 6A). I kontrast, immunohistologiske analyser viste en markert reduksjon i HMGA1 immunopositivity i prøver fra fulvestrant-behandlede pasienter (Figur 6b). HMGA1 ble lokalisert primært i kjernen av PCA-celler i kreftbrennpunkter, med bare svak cytoplasmatisk farge i stromale celler. Farging var ubetydelig i fulvestrant behandlede prøver i nesten alle kreft foci (figur 6C,
p
0,01, n = 5). Androgen reseptor ble tidligere vist å bli nedregulert ved fulvestrant i en gnager [41] og en cellemodell [21]. Her viste vi AR ble også signifikant nedregulert i vår kliniske studien (figur 6B og C). * P 0,05;
