Abstract
Pathways involvert i syntesen av signalstoffet gamma-aminosmørsyre ( GABA) har vært innblandet i patogenesen av høy klasse nevroendokrine (NE) svulster samt svulster fra et ikke-NE avstamning. Ved hjelp av Kreft Genome Atlas, overekspresjon av GABA syntetisk enzymet glutamat decarboxylase 1 (
GAD1
), ble funnet å være assosiert med redusert sykdomsfri overlevelse i prostata adenokarsinom og redusert total overlevelse i klare celle nyrecellekarsinomer . Videre
GAD1
ble funnet å bli uttrykt i kastrering resistent prostatacancercellelinjer, men ikke androgen-responderende cellelinjer. Ved hjelp av en ny fluorescens-koblet enzymatisk mikroplate-analysen for GABA mediert gjennom reduksjon av resazurin i en prostata nevroendokrine carcinom (PNEC) cellelinje, syre mikro-induserte spenning økt GABA-nivåer mens alkalisk mikromiljø induserte spenning redusert GABA gjennom modulering av GAD1 og glutaminsyntetase (GLUL) aktiviteter. Videre redusert glutamin men ikke glukose deprivasjon GABA gjennom modulering av GLUL. I samsvar med bevis i prokaryote og eukaryote organismer som GABA-syntesen mediert gjennom GAD1 kan spille en avgjørende rolle i å overleve stress, kan GABA være en viktig formidler av belastning overlevelse i svulster. Disse funnene identifisere GABA syntese og metabolisme som en potensielt viktig vei for å regulere kreftcelle stressrespons samt et potensielt mål for terapeutiske strategier
Citation. Ippolito JE, Piwnica-Worms D (2014) en fluorescens-Coupled analysen for GABA (GABA) avslører metabolsk stress-indusert Modulation av GABA innhold i Nevroendokrine Cancer. PLoS ONE 9 (2): e88667. doi: 10,1371 /journal.pone.0088667
Redaktør: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 22 oktober 2013; Godkjent: 15 januar 2014; Publisert: 13. februar 2014
Copyright: © 2014 Ippolito, Piwnica-Worms. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert med tilskudd fra Radiological Society of North America (RR1031, https://www.rsna.org) og National Institutes of Health (P50 CA94056). Den HTS kjerne støttes delvis av en bevilgning til Siteman Cancer Center (P30 CA091842). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
nevroendokrin (NE) system er en diffus nettverk av celler fordelt gjennom ulike vev og organer som kan produsere lokale eller systemiske effekter på fysiologi gjennom utskillelsen av hormoner eller signalstoffer. Selv om noen celler oppstår fra neural crest, er de fleste stammer fra multipotential epiteliale stamceller [1]. Nevroendokrine (NE) karsinom, som antas å oppstå fra NE-systemet, forekommer i nesten alle anatomiske steder og vise et bredt spekter av fenotypiske atferd fra godartet til metastatisk [2], [3]. For eksempel, «klassiske» karsinoider eller lavgradige NE karsinom er godt differensiert, har en lav mitotisk indeks, og ligner NE cellehyperplasi [2], [3], mens små cellekreft eller høygradig NE karsinomer er aggressive og dårlig differensiert [4] – [9]. Høy klasse NE karsinom karakteristisk ha en rekke områder av nekrose, en høy mitotisk indeks [2], [3], og en dårlig prognose. Konvensjonell terapi ikke forbedre pasientens overlevelse hos pasienter med høy klasse NE kreft [10].
adenokarsinomer, som er mye mer vanlig, oppstår fra en epitelial opprinnelse og vise en kjertel vekstmønster [11]. Interessant, kan adenokarsinomer vise NE funksjoner preget molekylært som uttrykk for genprodukter knyttet til NE celle avstamning. Dette fenomenet har blitt vist i mange typer av adenocarcinoma, inkludert de fra lunge, prostata og tykktarm, og korrelerer med tumor aggressivitet, metastase, og forkortet overlevelse [12] – [19]. Nærmere bestemt, i tilfelle av prostatakreft, ekspresjonen av NE gir positivt korrelerer med metastatisk potensial og kastrering bestandig vekst [19] – [21]. Dessverre forblir biologi NE celler samt deres bidrag til orgel homeostase ufullstendig definert, delvis på grunn av mangelen på disse cellene i normale organer [22].
Tidligere brukte vi en kombinasjon av genekspresjon profilering, massespektrometri og kjernemagnetisk resonansspektroskopi for å belyse en rekke metabolske nettverk innblandet i aggressive NE kreft ved anvendelse av en genetisk konstruert musemodell av metastatisk prostata NE karsinom, og et derivat prostata NE carcinoma (PNEC) cellelinje, karakterisert ved at den cryptdin 2 promoter stasjoner uttrykk for onkogene stort T-antigen (CR2-tag) [13], [23] – [25]. Resultatene fra disse analysene er identifisert syntesen og metabolismen av gamma-aminosmørsyre (GABA) avledet fra begge trikarboksylsyre (TCA) syklus mellomprodukter og polyaminer (kollektivt referert til som GABA shunt) som et metabolsk nettverk fremtredende opp reguleres i aggressive NE karsinomer [ ,,,0],13].
Modern spesialiserte instrumenter som brukes for metabolsk analyser, slik som massespektrometri (MS) og kjernemagnetisk resonans (NMR) er kostbare, krever betydelig trening for å operere, og kan ikke være lett tilgjengelig for mange vitenskapelige laboratorier . Classical enzymatisk-baserte metabolitt kvantifisering, derimot, gir en kostnadseffektiv, lett tilgjengelige, følsomme middel for kvantitativ analyse av metabolitter [26]. Selv ikke i stand til å gi samtidig informasjon om mengder av flere metabolitter, enzymatisk kvantifisering tilbyr muligheten til å samtidig kvantifisere en gitt metabolitt tvers av mange eksempler på en high-throughput plattform [27] -. [29]
Pyridine nucleotide- baserte enzymatiske analyser som par produksjonen av NADH eller NADPH (kollektivt referert til som NAD (P) H) til en biokjemisk reaksjon er attraktive, da disse reduserte nukleotider fluorescerer, og kan derfor anvendes for kvantitativ avlesning av enzymaktivitet eller metabolitter. Imidlertid kan bakgrunnsfluorescens i biologisk vev begrense følsomheten av NAD (P) H deteksjons [26].
Flere strategier for å forbedre den fotoniske produksjonen og forbedre følsomheten av enzymatiske reaksjoner er blitt utviklet [26], [ ,,,0],30] – [32]. En strategi involverer kobling av NAD (P) H syntese til mitokondriell lipoyl dehydrogenase (diaforase) som aktiverer kjemiske substrater for kromogene eller fluorescensanalyser. Resazurin er en slik forbindelse som kan brukes for enzymatisk-koblede og celleviabilitet assays [27], [33], [34]. Her rapporterer vi en roman enzymatisk assay for kvantifisering av GABA og lykkes med å bruke denne analysen til å karakterisere endringer i celle GABA i PNEC celler etter metabolsk stress.
Materialer og metoder
Reagenser
Alle kjemiske og enzymatiske reagenser ble kjøpt fra Sigma.
Cell Culture
Alle cellelinjer ble rutinemessig testet mycoplasma negative. Alle cellelinjer ble dyrket ved lav passasje under vanlige betingelser i henhold til ATCC protokoller i en 95% O
2/5% CO
2 inkubator ved 37 ° C. En selv feste subklon av Prostate Nevroendokrine Cancer (PNEC) cellelinje [35] ble dyrket som beskrevet tidligere [36]. I korte trekk ble DMEM /F12-medium (Invitrogen) supplert med 10% varmeinaktivert FBS (Gibco), 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA, Gibco), B27 serum supplement (Invitrogen), 5 ng /ml EGF (BDBiosciences), 5 ng /ml bFGF (Sigma), og 15 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) buffer (Gibco). Alle celler ble dyrket til et maksimum på 75% konfluens. Cellene ble trypsinert, nøytralisert med vekstmedier og passaged. Cellepelletene for RNA eller biokjemiske analyser ble spunnet ned ved 125 x g i 5 min ved 4 ° C. Cellene ble vasket med iskald fosfatbufret saltløsning, og sentrifugert på nytt. Supernatantene ble aspirert og pellets hurtigfrosset i flytende nitrogen. Alle prøver ble lagret ved -80 ° C inntil videre bruk.
Evaluering av overlevelseskurver fra Kreft Genome Atlas (TCGA)
cBioPortal for Cancer Genomics [37], [38] gitt gjennom Kreft Genome Atlas portal~~POS=HEADCOMP ble brukt for å få tilgang til og visualisere kliniske og genuttrykk datasett av menneskelige prostata adenokarsinom [39] og menneskelig klarcellet nyrecellekarsinom [40]. Bare «mRNA uttrykk z-score vs. Normals» alternativet ble kontrollert. «Alle svulster» ble valgt for spørringen. RNASeq data ble brukt for den klare cellekreft datasett. Overlevelseskurver ble vurdert basert på ekspresjon av gener innenfor GABA shunt. Prøvene som oppviser økt
GAD1
uttrykk (z poengsum 2 eller 3) og redusert
GLUL
uttrykk (z -2) ble identifisert og klinisk informasjon eksporteres. Overlevelseskurver ble konstruert med GraphPad Prism.
Real Time PCR Primer Design
Grunning for sanntids PCR ble utformet ved hjelp PrimerBLAST.
GAD1 plakater (NM_000817.2), men ikke 18S rRNA (
RNA18S5
; NR_003286.2), designet over en intron-exon veikryss. Utvalgte primere ikke har noen spådd off-target forsterkning i det menneskelige genom. Primer smeltetemperaturer ble utformet mellom 61 ° C og 63 ° C. Primere ble testet med PCR fra cDNA syntetisert fra NCI-H660 og LNCaP-cellelinjer. Amplikonene ved forventet lengde (GAD1:145 bp, 18S: 182 bp) ble oppnådd fra cDNA-preparater og var ikke tydelig i PCR-reaksjoner ved bruk av genomisk DNA som templat eller bare vann. Smelt kurver og forsterknings effektivitet i alle primerpar ble utført. Primersekvensene er som følger:
GAD1 plakater (fremover): 5′-ATGGGGTTCGCACAGGTCATCC-3 «,
GAD1 product: (revers): 5′-TCCATGAGGACAAACACTGGTGCA-3′;
RNA18S5 plakater (fremover): 5′-GGGCATTCGTATTGCGCCGC-3 «,
RNA18S5 product: (revers): 5’GAATAACGCCGCCGCATCGC-3′.
Real Time PCR
RNA ble isolert fra snap frosne cellepelleter ved hjelp av RNeasy-sett (Qiagen). Etter RNA-ekstraksjon ble alle RNA prøver alikvotert og lagret ved -80 ° C. Alle RNA-prøvene ble behandlet med DNase TURBO (Ambion) for fjerning av genomisk DNA. Alt RNA brukes for kvantitativ PCR ble umiddelbart revers transkribert med iScript kit (Bio-Rad). Renheten av cDNA ble vurdert med 18S rRNA PCR-amplifisering av cDNA-prøven og en negativ kontrollprøve av RNA som manglet den reverse transkriptase. Alle prøver som brukes for etterfølgende qPCR eksperimenter hadde ikke detekterbar genomisk DNA-forurensning, som vist ved mangel på en 18S amplikon etter 40 sykluser av reaksjons mangler revers transkriptase. Hver prøve ble testet i triplikat ved 50 ng cDNA. Sanntids-PCR ble utført med SYBR grønn masterblanding (BioRad) og en 100 nM konsentrasjon av den spesifikke primer som ligger i en Bio-Rad CFX96 PCR instrument (95 ° C i 10 min, deretter 40 sykluser med 95 ° C i 30 s , 61 ° C i 1 min, og 74 ° C i 1 min). 18S rRNA primere ble anvendt som en indre standard.
metabolsk stress Eksperimenter
For nærings deprivasjon eksperimenter, DMEM /F12 media mangler glukose, pyruvat, og glutamin (USBiological) ble anvendt. Mediet ble supplert med følgende komponenter: varmeinaktivert dialysert serum med et 10 kDa molekylvektsperre (Sigma), 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA, Gibco), 5 ng /ml EGF (BDBiosciences), og 5 ng /ml bFGF (Sigma). Glukose og glutamin (Gibco) ble supplert til de spesialiserte media når det trengs. Glukose ble tilsatt til mediet ved hjelp av standard DMEM /F12 formuleringskonsentrasjon på 17,5 mM. Glutamin ble benyttet ved 6 mM. Før metabolsk stress eksperimenter ble PNEC- cellene sådd ut ved en tetthet på 400.000 celler per brønn i en 12-brønners plate med 1,5 ml av standard vekstmedier. Celler ble tillatt å vokse i 24 timer. Media ble deretter byttet ut med 1,5 ml stresset medier. For alle pH-stress-eksperimenter ble konvensjonell PNEC vekstmedier anvendt uten bikarbonat eller Hepes-buffere og ble modifisert som følger. For syre stress, 2 – (
N
-morpholino) etansulfonsyre (MES), pH 6,5 ble tilsatt for en endelig konsentrasjon på 20 mM. For konvensjonell pH var HEPES, pH 7,4 tilsatt til en endelig konsentrasjon på 20 mM og natriumbikarbonat tilsatt for en endelig konsentrasjon på 0,34 g /l. For alkalisk stress, ble tris (hydroksymetyl) aminometan (Tris) pH 8,5 tilsatt til en endelig konsentrasjon på 20 mM og natriumbikarbonat tilsatt for en endelig konsentrasjon på 0,34 g /l. Celler ble deretter inkubert i et fuktet kammer uten CO
2 ved 37 ° C i 24 timer.
Prøvepreparering
Prøvepreparering for den enzymatiske analysen ble modifisert i forhold til tidligere beskrevne fremgangsmåter [13 ], [26]. For spennings eksperimenter, ble media raskt aspirert fra brønnene og cellene ble skylt med 1 ml PBS. For syre og base for spennings eksperimenter ble brønnene skyllet med saltløsning bufret til den passende pH-verdi med 20 mM MES eller HEPES som ovenfor. Cellene ble deretter lysert i 200 ul iskald lyseringsoppløsning (50 mM natriumhydroksyd og 1 mM EDTA) og forsiktig ristet i 30 sek. Et like stort volum av 100 mM saltsyre ble deretter tilsatt for å surgjøre lysatet. Platene ble dekket med klebe PCR folien og inkubert i et vannbad ved 60 ° C i 30 minutter for å ødelegge endogene enzymaktivitet, så vel som endogen NADH. Etter inkubering ble platene kort sentrifugert ved 100 x g (Allegra 6R; Beckman-Coulter) for å fjerne kondensat. Filmen ble fjernet, og 100 pl 400 mM Tris-base ble tilsatt til hver brønn, for et totalt volum på 500 ul lysat i hver brønn (slutt-pH ca. 8). Lysatene ble sentrifugert ved 15 000 x g i 5 minutter for å klumpe rusk og supernatantene ble samlet og frosset ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
Resazurin-baserte analysen for GABA og suksinsemialdehyd Bestemmelse
etter reagens optimalisering, den Mastermix for kvantifisering GABA og suksinsemialdehyd (SSAL) i prøvene bestod av 0.063 U /ml GABase, 0,063 U /ml diaforase, 6,25 uM resazurin, 100 mM nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat (NADP), 5 mM alfa-ketoglutarat og 3,125 uM ditiotreitol (DTT) i 100 mM Tris-base, pH 8,8. Den Mastermix ble gjort frisk før hvert eksperiment.
A Mastermix for kvantifisering bare SSAL inkludert de ovennevnte reagenser, så vel som 50 mM 2-aminoetyl-hydrogensulfat, en inhibitor av GABA-transaminase-komponenten i GABase enzympreparat. Inhibitoren ble tilsatt til den Mastermix i 10 minutter ved romtemperatur før tilsetning av Mastermix til prøvene. En ny fremstilling av inhibitoren ble fremstilt før alle forsøk.
Alikvoter av prøven (10 ul) ble tilsatt til brønner i en 96-brønners klar bunn sort kulturplate (Costar), etterfulgt av tilsetning av 90 ul MasterMix med en elektronisk multikanalspipette. To alikvoter av den samme prøve ble anvendt for bestemmelse av total GABA pluss SSAL eller SSAL alene på samme plate. Med mindre annet er angitt, ble reaksjonen utført ved romtemperatur og ble beskyttet mot lys i 30 minutter. Den hentet fra resorufin, fluorescerende produkt av resazurin signal, ble kvantifisert ved hjelp av en FLUOstar Optima mikroplateleser (BMG Labtech) med en 544 nm eksitasjon /590 nm utslipp filter sett (gevinst, 1327; 10 blink per brønn). Kinetiske analyser ble utført med 1 minutts sykluser.
signalet for total GABA pluss SSAL i hver prøve ble subtrahert fra den SSAL alene signalet for å oppnå signalet for GABA. Standardkurver for GABA og SSAL ble konstruert for kvantifisering og ble korrigert for reaksjonen emnet med og uten nærvær av 2-aminoetyl-hydrogensulfat. GABA og SSAL målinger ble normalisert til protein i lysatene, kvantifisert med bicinchoninic syre (BCA) analyse (Pierce) under anvendelse av et bovint serumalbumin standardkurve. Data ble behandlet med GraphPad Prism. Næringsstoffer og pH-stress-grupper ble analysert med en enveis ANOVA og etter Dunnett-test for statistisk analyse.
Resazurin-basert analyse for Glutamat Bestemmelse
En enzymatisk analyse for bestemmelse av glutamat ble utført som beskrevet tidligere [41]. I korthet reaksjonskomponentene inkludert 10 uM resazurin, 4 U /ml glutamat dehydrogenase, 0,25 U /ml glutaminsyre-pyrodruesyre-transaminase, 100 uM alanin, 0,5 mg /ml NAD + og 0,5 U /ml diaforase i 100 mM Tris-HCl, pH 7,5. 10 ul av de ovenfor nevnte prøvene ble tilsatt til 90 ul av reaksjonsblandingen og analyser utført i mørket ved romtemperatur. Resorufin-signalet ble målt ved 15 minutter. Næringsstoffer og pH belastningsgruppene ble analysert med enveis ANOVA og Dunnett post-test for statistisk analyse.
NAD (P) H fluorescens-basert GABase analysen
Analysen ble endret fra Passoneau [26 ]. Den Mastermix besto av 0,08 U /ml GABase, 5 mM alfa-ketoglutarat, 500 uM NADP, 100 mM DTT og 4 mM EGTA i 100 mM natriumpyrofosfat, pH 8,6. Aliquoter av prøven (10 ul) ble tilsatt til 96-brønners plater (Falcon optiske 353261) etterfulgt av 90 pl av Mastermix. Reaksjonen ble utført ved romtemperatur i en time og målt i et FLUOstar Optima med en 340 nm eksitasjon /450 nm emisjon filtersett (gevinst, 2103, 10 blink pr brønn).
Western blotting av metabolske enzymer
PNEC celler ble belagt, stresset, og vasket som beskrevet ovenfor. 100 ul iskald RIPA-buffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 140 mM natriumklorid, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1% natrium-deoksycholat, og 1% Triton X-100) inneholdende 1 mM natriumortovanadat og fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) ble tilsatt. Cellene ble skrapet fra brønnene på is og tilsatt til mikrofugerør. Prøvene ble sentrifugert i 10 minutter ved 10 000 x g ved 4 ° C for å fjerne uoppløselig bunnfall. Protein ble kvantifisert ved BCA-analyse som beskrevet ovenfor
Totalt 30 pg protein ble applisert på en 4-12% Bis-Tris polyakrylamidgel (Bolt, Life Technologies). Med reduksjonsmidlet i henhold til produsentens spesifikasjoner. Gelen ble overført til en Immobilon-membran (Millipore) og blokkert med fosfatbufret saltvann inneholdende 5% bovint serumalbumin og 0,1% Tween-20. Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt: anti-GAD1 (MAB5406 Millipore) ved 1:5000 fortynning, anti-ALDH5A1 (HPA029716, Sigma) på 1:1000 fortynning, anti-GLUL (MAB302 Millipore) ved 1:1000 fortynning, og anti-ACTB (ab8226; Abcam) på 1:4000 fortynning. Primære antistoffer ble inkubert over natten ved 4 ° C. Sekundært geite-anti-mus eller anti-kanin-pepperrot-peroksidase-konjugert antistoff (Cell Signaling) ble deretter brukt ved 1:5000 fortynning. Den samme blot ble anvendt for å undersøke ekspresjon av alle proteiner. Etter bruk av hver antistoff ble blot strippet med Western Re-probe (G biovitenskap) i henhold til produsentens spesifikasjoner. Blotter ble utviklet og avbildes med WesternBright Quantum deteksjon kit (Advansta).
Enzymatisk Analyser
PNEC celler ble belagt, stresset, og vasket som beskrevet ovenfor. Celler ble skrapet i 100 ul iskald lyseringsbuffer (100 mM natriumfosfat, pH 7,0, 20 mM pyridoksalfosfat, og 0,1% Triton X-100) og gjentatt en andre gang for hver brønn. Prøvene ble ultralydbehandlet kort (2-3 sekunder) på is og deretter sentrifugert i 10 minutter ved 10 000 x g ved 4 ° C for å fjerne uoppløselig materiale. Før prøve kvantitering, ble alle analysene evaluert for linearitet med hensyn til tid og mengde av tilsatt lysat. Alle enzymaktiviteter ble normalisert til tid og mengden av protein i lysatet. Statistiske analyser ble utført som beskrevet ovenfor.
Glutamat-dekarboksylase-analyse.
Metoden ble modifisert fra en opprinnelig protokoll [42]. Analysebufferen inneholdt 100 mM natriumfosfat, pH 7,0, 250 mM pyridoksalfosfat, 50 mM glutamat, og 0,4% beta-merkaptoetanol. En reaksjon blank ble utført for hver prøve og inneholdt ikke pyridoksalfosfat eller glutamat. 50 pl av lysatet ble tilsatt til 50 pl reaksjonsbuffer i en PCR-plate og inkubert i opp til 8 timer ved 37 ° C i en termosykler uten oppvarmet lokk. Analysen ble avsluttet ved tilsetning av 17 ul av 350 mM HCl og oppvarmet i 30 minutter ved 60 ° C i en termosykler. Platen ble fjernet og kort sentrifugert for å fjerne kondensat. 17 ul av 400 mM Tris-base ble tilsatt for å nøytralisere prøven, og platen sentrifugert i 10 minutter ved 1000 x g for å fjerne proteinbunnfall. Brønnene ble deretter fortynnet tidobbelt for måling av GABA, er produktet av den enzymatiske reaksjon, ved hjelp av GABase-resazurin-analyse som beskrevet ovenfor.
glutamin-syntetase-analyse.
Metoden ble modifisert fra en opprinnelig protokollen ved hjelp av spektrofotometrisk bestemmelse av γ-glutamyl-hydroksamat [43]. Forsøksbufferen inneholdt 50 mM imidazol, pH 6,8, 50 mM hydroksylamin, pH 6,8, 100 mM glutamin, 25 mM natrium-arsenat, 0,2 mM adenosin-difosfat (ADP), og 0,5 mM manganklorid. En reaksjon blank ble utført for hver prøve og inneholdt ikke arsenat, ADP, eller glutamin. 10 pl av lysatet ble tilsatt til 90 pl reaksjonsbuffer i en PCR-plate og inkubert i opp til 8 timer ved 37 ° C i en termosykler uten oppvarmet lokk. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 100 ul av utvikling av reagens (0,37 M jern (III) klorid, 0,3 M trikloreddiksyre, 0,6 M HCl). Prøvene ble sentrifugert for å fjerne bunnfall og absorbansen målt ved 505 nm. Prøve absorbans ble kalibrert med γ-glutamyltransferase hydroksamat standard.
ALDH5A1 (SSADH) assay.
Metoden ble endret fra tidligere protokoller [26], [44]. Analysebufferen inneholdt 100 mM Tris pH 8,8, 50 mM kaliumklorid, 1 mM ditiotreitol, 2,5 mM nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD), 1,25 mM SSAL, og 0,02% bovint serumalbumin. En reaksjon blank ble utført for hver prøve og inneholdt ikke SSAL. 10 pl av lysatet ble tilsatt til 90 pl reaksjonsbuffer i en PCR-plate og inkubert i opp til 8 timer ved 45 ° C i en termosykler uten oppvarmet lokk. Reaksjoner ble overført til en mikroplate og absorbansen av NADH, den enzymatiske produkt ble målt ved 355 nm. Prøve absorbans ble kalibrert med NADH standard.
Resultater
Kliniske implikasjoner av GABA Hunt
Vi har tidligere fastslått med uttrykk analyser som GABA-syntesen er beriket i høy klasse NE malignitet [13] og validert tilstedeværelsen av en funksjonell GABA shunt i prostata cancer NE (PNEC) cellelinje ved anvendelse av en kombinasjon av genekspresjon profilering, metabolitt og enzymaktiviteten kvantifisering [13], [25]. GABA kan være avledet fra trikarboksyl syre (TCA) syklus mellomprodukter og polyamin /kationiske aminosyre produkter som par GABA metabolismen til flere baner i cellulær energimetabolisme (fig. 1). I en reaksjonsvei, er GABA produsert av glutamat-decarboxylase 1 (GAD1) -mediert dekarboksylering av glutamat avledet fra enten glutamin eller alfa-ketoglutarat fra den TCA-syklusen. I en annen vei, produkter av polyamin og kationisk aminosyre degradering gjennom putrescin gjennomgå redoks-mediert omdannelse til GABA. GABA kan deretter metaboliseres av aminobutyrate nase (ABAT, GABA-T) og ravsyresemialdehyd dehydrogenase (ALDH5A1, SSADH) inn succinate for oppføring i TCA syklus
Glud. Glutamat dehydrogenase; GLS: glutaminase; GLUL: glutamat-ammoniakk ligase; GAD1: glutamat decarboxylase; ODC1: ornitindekarboksylase; ABP1: diaminoksidase; ABAT: GABA transami; SSAL: suksinsemialdehyd; ALDH5A1: ravsyresemialdehyd dehydrogenase; ALDH9A1: aldehyd dehydrogenase; SAT1. Spermidinsetemodulator /Spermine N-acetyltransferase
Først, for å avgjøre om overekspresjon av GABA shunt enzymer var påvisbare i menneskelige prostata maligniteter og hvis overekspresjon korrelert med uønskede kliniske hendelser, vi brukte cBioPortal [37] [38] av TCGA å avhøre en offentlig tilgjengelig prostatakreft genuttrykk datasettet og den tilhørende klinisk informasjon [39] for kohorter av pasienter med kreft overexpressed komponenter av GABA shunt. Ut fra alle de enzymer som er oppført i fig. 1,
GAD1
var den eneste gen hvis overekspresjon var assosiert med redusert sykdomsfri overlevelse. Vi identifiserte totalt 6 pasienter ut av totalt 216 pasienter (2,8%) som har kreft vises
GAD1
overekspresjon med z-poeng mer enn to. Pasienter med kreft som overuttrykt
GAD1
hadde en median sykdomsfri overlevelse på 19,8 måneder versus 110,3 måneder (p = 0,003) (Fig. 2A). Denne kohorten av pasientene hadde et bredt spekter av prostata serum antigen (PSA) nivåer som spenner 3,5 til 40,2 mg /dL, Gleason karakterer som spenner fra 3 + 3-4 + 5, og staging alt fra T2C til T3B. Selv om det var bare en dokumenterte tilfellet av metastatisk lymfadenopati ved tidspunktet for kirurgi, alle prøvene demonstrerte ekstrakapsulær forlengelse. Interessant, redusert uttrykk av glutamin syntetase (
GLUL
) som potensielt kan konkurrere med GAD1 enzym for glutamat ble også assosiert med redusert sykdomsfri overlevelse. Totalt 14 pasienter med z-score mindre enn -2 ble identifisert med en median overlevelse på 27,9 måneder versus 110,3 måneder (p = 0,006, Fig. 2B).
A.
GAD1
mRNA overekspresjon i prostata adenokarsinomer korrelerer med redusert sykdomsfri overlevelse. Svulster med
GAD1
uttrykk z-poeng mer enn to skjerm redusert sykdomsfri overlevelse (median 19,8 måneder) i forhold til svulster som ikke har økt
GAD1
uttrykk (median 110,3 måneder; p = 0,002). B.
GLUL
downregulation i prostata adenokarsinomer korrelerer med sykdomsfri overlevelse (median 27,9 måneder) i forhold til svulster uten
GLUL
downregulation (median 110,3 måneder, p = 0,006). C.
GAD1
mRNA uttrykk i prostata kreft cellelinjer målt med kvantitativ PCR.
GAD1
uttrykk er synlig i kastrat-resistente cellelinjer NCI-H660, PC3 og DU145, men ikke androgen-responsive cellelinjer LNCaP og LAPC4. 18S rRNA ble anvendt som en indre standard. A C
t er forskjellen på terskelen syklus av
GAD1 Hotell og terskelen syklus av 18S rRNA. ND: Ikke bestemt. D.
GAD1
mRNA overekspresjon i klar celle nyrecellekarsinomer korrelerer med redusert total overlevelse. Svulster med
GAD1
z-poeng 2 skjerm redusert total overlevelse (median 52,5 måneder) i forhold til svulster som ikke har økt
GAD1
uttrykk (median 80,6 måneder, p = 0,01 ). Svulster med
GAD1
z-poeng 3 skjerm større redusert median overlevelsestid (median 31,1 måneder) i forhold til resten av svulstene (median 78,4 måneder, p = 0,002)
i ekspresjonen av NE gener har vært implisert i for kastrering resistent prostatakreft, spesielt med hensyn til den økte ekspresjon av NE markør aromatisk aminosyre decarboxylase (
DDC
) i kastrering-resistente prostata kreft [21], bestemt vi hvis
GAD1
mRNA ble anriket i menneskelig kastrering resistent prostatakreft. Interessant,
GAD1
mRNA uttrykk var synlig bare i kastrat-resistente cellelinjer (Fig. 2C), med tilsvarende uttrykk nivåer i NCI-H660 NE kreftcellelinje og PC3 og DU145 adenokarsinom cellelinjer. Ingen påviselig uttrykk for GAD1 ble identifisert på en av androgen-responsive LNCaP og LAPC4 cellelinjer.
På grunn av en rapport fra GAD1 protein uttrykk i en undergruppe av nyrecellekarsinomer [45], forhørt vi en nylig publisert studie av klarcellet subtype av nyrecellekarsinomer [40] gitt gjennom cBioPortal å finne ut om det var like overlevelsesegenskaper. Vi identifiserte 39 pasienter av totalt 499 pasienter (8%) med tumorer overuttrykt
GAD1
mRNA med en z score høyere enn 2. Dette kullet viste en betydelig redusert totaloverlevelse i forhold til den totale klare cellekreftpopulasjonen med en median overlevelsestid på 52,5 måneder sammenlignet med 80,6 måneder (p = 0,01). Vi så isolert en kohort av
GAD1
overekspresjon tumorer (n = 18) med z-poeng høyere enn 3, og identifisert en ytterligere reduksjon i total overlevelse med en median overlevelse på 31,1 måneder sammenlignet med 78,4 måneder (p = 0,002) (fig. 2D). Det var ingen signifikant effekt av
GLUL
mRNA uttrykk på pasientens overlevelse i denne populasjonen.
Analyse Development
Potensialet for GABA å ha prognostisk betydning i å identifisere undergrupper av kreftpasienter med redusert overlevelse bedt oss om å utvikle en analyse for GABA som kunne allment vedtatt og uavhengig av teknisk utfordrende instrumentering som massespektrometri og NMR. Skjematisk av den koblede reaksjon er nødvendig for å kvantifisere GABA er gitt i fig. 3. Den kommersielt tilgjengelige «GABase» preparat fra
Pseudomonas fluorescens
er en kombinasjon av ABAT og ALDH5A1 enzymaktiviteter som oksidere GABA gjennom en serie av to reaksjoner i suksinat, noe som resulterer i reduksjon av NADP kofaktor til NADPH. NADPH oksideres deretter til NADP av mitokondrielle diaforase og kobler således reduksjon av Resazurin til fluorescerende produkt resorufin. Selv ALDH5A1 kan bruke både NAD + og NADP som underlag, har NADP konvensjonelt blitt brukt som en kofaktor med dette enzymet forberedelse [26].
GABase forberedelse, en kombinasjon av ABAT og ALDH5A1 enzymer fra
P. fluorescens
konverterer GABA til succinate gjennom konvertering av alfa-ketoglutarat til glutamat og NADP til NADPH. Selv om NAD eller NADP kan potensielt benyttes som substrater ved ALDH5A1 blir NADP konvensjonelt anvendt som en kofaktor for dette preparatet. Suksinsemialdehyd (SSAL), en mellom av GABA stoffskiftet er også metaboliseres av GABase forberedelse. Diaforase oksiderer den NADPH og reduserer resazurin til fluorescerende resorufin. Anvendelse av 2-aminoetyl-hydrogensulfat (2-AEHS), kan en hemmer av ABAT brukes til å bestemme bidraget fra SSAL til det totale signalet som genereres fra GABA og SSAL i cellelysatene.
Assay Optimalisering
en klassisk NADPH fluorescens-enzymaktivitetsanalyse [26] ble brukt som et grunnlag for optimaliseringen av de enkelte komponenter i en resazurin basert utlesning av GABA. Hver komponent ble titrert over et område av konsentrasjoner, holder alle andre komponenter konstant (fig. 4). Som forventet, analysen var følsom for Resazurin, viser en 5,9-gangers økning i signal over bakgrunnen i en konsentrasjon på 6,25 uM.
